大鼠肝细胞Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因表达及PDGF的影响
上海第二医科大学 1附属新华医院消化研究室 2生化教研室上海市 200092
姚迪，女，1968-07-17生，黑龙江省人，1990年哈尔滨医科大学本科毕业，1996年上海第二医科大学硕士研究生毕业，医师，主要从事肝纤维化发病机制及治疗的研究，发表论文3篇.
项目负责人 姚迪，200092，上海第二医科大学附属新华医院消化研究室，上海市控江路1665号.
Correspondence to Di Yao, Laboratory of Digestion, Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University,1665 Kongjianglu, Shanghai 200092, China
, http://www.100md.com
Tel. +86·21·65454630-4223
收稿日期 1997-10-28
Expression of typeⅠ and Ⅲ procollagen mRNAs in rat hepatocytes with or without platelet-derived growth factor
Di Yao1, Ding-Guo Li1, Feng Cheng2, Tian-Yuan He2 and Qin-Fang Xu1
1Laboratory of Digestion, Xinhua Hospital and 2Department of Biochemistry, Shanghai Second Medical University,Shanghai 200092, China
, 百拇医药
Abstract
AIM To observe the expression of type Ⅰ and Ⅲ procollagen mRNAs of rat hepatocytes and effect of PDGF.
METHODS The expression of type Ⅰ and Ⅲ procollagen mRNAs of rat hepatocytes and the effect of 10μg/L and 30μg/L PDGF
(n=30) were tested with in situ hybridization. The percentage of areas of mRNA expression in the total cell area was also determined.
, 百拇医药
RESULTS The expression of type Ⅰ and Ⅲ procollagen mRNAs was seen in normal rat hepatocytes and with PDGF (two concentrations). The percentage of mRNA expression areas of type Ⅰ and Ⅲ procollagen mRNAs in normal rat hepatocytes was 7.7%±1.9%, with addition of 10μg/L PDGF, 11.5%±1.9% and 11.2%±1.0%; and with 30μg/L PDGF, 15.2%±3.4% and 18.1%±2.8%.
CONCLUSION PDGF is involved in hepatic fibrosis through excessive collagen synthesis of hepatocytes at the transcriptional level.
, 百拇医药
Subject headings liver cirrhosis; liver; procollagen; gene expression; platelet derived growth factor; rats; RNA,messenger
Yao D, Li DG, Cheng F, He TY, Xu QF. Expression of type Ⅰ and Ⅲ procollagen mRNAs in rat hepatocytes with or without plateletderived growth factor. Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(4):300-302
摘要
目的 观察大鼠肝细胞Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因的表达及PDGF对其表达的影响.
, 百拇医药
方法 应用原位杂交技术检测分离培养的SD大鼠肝细胞(n=30)内Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因的表达. 同时观察10μg/L(n=30)和30μg/L(n=30)PDGF促进前胶原基因表达的作用. 测定基因表达颗粒总面积占细胞总面积的百分比，并作比较分析.
结果 无论正常肝细胞或是在两种浓度的PDGF存在时，肝细胞内均可见到Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因的表达. 正常肝细胞Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因表达面积的百分比(%)为7.7±1.9和7.5±2.1；加10μg/L-PDGF后为11.5±1.9和11.2±1.0，而加30μg/L后为15.2±3.4及18.1±2.8，且在后者中表达明显增强(P<0.05及P<0.01).
结论 PDGF在转录水平上促进肝细胞胶原的合成.
主题词 肝硬化；肝；胶原；基因表达；血小板衍化生长因子；大鼠；RNA，信使
, 百拇医药
姚迪, 李定国, 程枫, 何天源, 徐芹芳. 大鼠肝细胞Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因表达及PDGF的影响.华人消化杂志,1998;6(4):300-302
0 引言
肝纤维化是细胞外基质合成、降解和沉积间失衡的结果，其中胶原的过度合成在纤维化形成中占有十分重要的地位. 我们采用细胞原位杂交的方法，观察肝细胞内Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因的表达，同时选用血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor, PDGF)作为干预因素，观察其对肝细胞内Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因表达的影响，以进一步揭示肝纤维化形成的机制.
1 材料和方法
1.1 材料 参照黄俊勇et al[1]方法，自行分离、体外培养SD大鼠肝细胞. 含人Ⅰ型和Ⅲ型前胶原cDNA的质粒pHCALIU, pH FS3由美国博士惠赠. 参照Sambrook et al[2]方法进行质粒的扩增、抽提和纯化.
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1.2 方法
1.2.1 探针的酶切与回收 Ⅰ型前胶原cDNA片段经Pst Ⅰ和PvuⅡ内切酶；Ⅲ型前胶原cDNA片段经PstⅠ和HindⅢ内切酶消化后，应用Gel Extraction Kit回收片段. Ⅰ，Ⅲ型片段长度分别为0.371Kb和0.295Kb.
1.2.2 探针的标记 应用DIG标记试剂盒.
1.2.3 原位杂交 在细胞体外培养3d，加入PDGF，5d，吸出培养液，加入0.4g/L EDTA 消化、收集细胞，并用含1ml/L BSA的PBS洗涤细胞2次，最后用PBS重悬细胞沉淀，调整细胞浓度为1×106/L. 取5μl细胞悬液于酸化处理的载玻片上，室温下干燥10min. 用30g/L多聚甲醛室温下固定10min. 室温下预杂交1h. 预杂交液：4×SSC，400g/L甲酰胺，1×Denharht，10g/L硫酸葡聚糖，0.1g/L tRNA，0.1g/L sperm DNA. 于密闭温盒中37℃杂交过夜. 杂交液：含DIG标记的3μg/L探针. 依次用2×SSC，1×SSC，0.5×SSC洗涤15min. 经苏木精、伊红染色，并依次用乙醇脱水然后用二甲苯脱水，最后用中性树胶封片. 设无DNase的RNase消化的细胞标本、空白标本和用HE染色的标本作为阴性对照.
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2 结果
10μg/L和30μg/L的PDGF均可促进肝细胞Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因的表达，且后者较前者作用强(P<0.05，P<0.01). 而Ⅰ，Ⅲ型前胶原含量未见明显不同(P>0.05)，图1-8. 原位杂交信号通过VIDAS全自动图象分析系统，经过阴影校正，采用低滤过波，使图象增强，然后进行恢度测量. 各组数据经方差齐性检验后行方差分析(表1).
表1 PDGF对鼠肝细胞Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因表达的影响
, 百拇医药
aP<0.05，bP<0.01， vs 对照组.
图1 正常肝细胞Ⅰ型胶原mRNA的表达
图2 PDGF(10μg/L)对Ⅰ型胶原mRNA表达的影响
图3 PDGF(30μg/L)对Ⅰ型胶原mRNA表达的影响
图4 正常肝细胞Ⅲ型胶原mRNA的表达
图5 PDGF(10μg/L)对Ⅲ型胶原mRNA表达的影响
, http://www.100md.com
图6 PDGF(30μg/L)对Ⅲ型胶原mRNA表达的影响
图7 空白对照
图8 HE染色对照
3 讨论
胶原的过度合成在肝纤维化形成过程中占有十分重要的地位. 胶原的种类很多，迄今已发现14种. 在肝组织中有Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ和Ⅵ型，其中含量最多的是Ⅰ，Ⅲ型，占肝内胶原总量的40%左右. 肝纤维化时，Ⅰ，Ⅲ型胶原明显提高，可高达胶原总量的90%，是肝纤维化细胞外基质的主要成分[3]. 我们选用Ⅰ，Ⅲ型前胶原cDNA克隆片段作为探针，观察肝细胞内胶原合成情况. 研究肝脏中胶原的细胞来源，原位杂交是一种可靠的方法，其敏感性高、定位准确，而且胶原mRNA T1/2极短，更能反应胶原合成状态[4]. 我们应用地高辛素标记探针，可使杂交过程更简化、结果稳定、背景清晰.
, 百拇医药
肝内细胞外基质的主要来源仍有争议. 目前国内纤维化机制研究主要集中于细胞外基质及其与成纤维细胞或贮脂细胞的相互作用[5]. 然而肝细胞胶原合成及其代谢对肝纤维化的影响仍不十分清楚. 一种观点认为肝内基质成分主要由间质细胞包括贮脂细胞、肌成纤维细胞及成纤维细胞合成，肝细胞不能合成[6]；但也有研究[7-9]表明肝细胞能够合成Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ型胶原及层粘连蛋白、纤维连接蛋白等基本成分，特别是在某种纤维产生的刺激情况下. 考虑到肝细胞在数量上的绝对优势，我们采用细胞原位杂交方法，观察肝细胞内Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因表达情况. 结果显示无论正常肝细胞或是在PDGF存在时，肝细胞内均可见Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因的表达. 业已证实，许多细胞因子能在转录水平和转录后水平上调节胶原基因的表达. 其中PDGF是参与肝纤维化形成的一个重要生长因子，在慢性肝病中，病毒、内毒素及免疫复合物等能刺激血小板、巨噬细胞及枯否细胞等合成并分泌PDGF和其他细胞因子. PDGF等细胞因子刺激肝内细胞生长、增殖并产生大量细胞外基质，同时促进其沉积. PDGF还能诱导中性粒细胞、单核巨噬细胞、纤维细胞等发生趋化反应，并使之激活，释放生长因子，加剧间质细胞的增殖及结缔组织的形成，引起肝纤维化[9]. 本结果显示，在PDGF存在下，肝细胞内Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因表达明显提高，并且与剂量呈正相关(P<0.05). 但是此结果是由PDGF直接作用于肝细胞亦或细胞外基质，间接地影响了肝细胞的功能状态，还需进一步研究.
, 百拇医药
4 参考文献
1 黄俊勇，冷欣夫. 大鼠肝细胞的分离技术. 细胞生物学杂志，1991；13(1)：42-44
2 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning. New York. Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:16-42
3 朱国静，范宗涝. 肝纤维化发病机理、诊断及治疗的进展. 临床肝胆病杂志，1993；9(4)：178-181
4 王要军，戴益民. 肝脏胶原基质的病理学进展. 国外医学生理病理和临床分册，1992；12(2)：123-125
5 Weiner FR, Giambrone MA, Czaja MJ, Sheh A, Annoni G, Takahashi S. Ito cell expression and collagen regulation.
, 百拇医药
Hepatology, 1990;11(1):111-120
6 Gressner AM, Bachern MG. Cellular sources of noncollagen matrix proteins: role of fat storing cells in fibrogenesis.
Sem Liver Dis,1990;10(1):30-46
7 Honglum K, Buck M, Adir V, Chojkior M. LAP transactivates the collagen α1 (Ⅰ) gene from a 5＇regulatory region.
J Clin Invest, 1994;94(2):808-814
, 百拇医药
8 Yamada S, Koji T, Hata R, Hirohashi S, Kurata S, Senoo H. Stimultaneous expression of type Ⅰ procollagen mRNA and albumin
in cirrhotic human liver. J Clin Lab Anal, 1992;6(6):351-358
9 Grotendorst GR, Tashijan AH, Clark RA, Sakakibara K. Platelet derived growth factor is a chemoattractant for vascular smooth
muscle cells. J Cell Physiol, 1982;113(1):261-269, 百拇医药(姚迪1 李定国1 程枫2 何天源2 徐芹芳1)
姚迪，女，1968-07-17生，黑龙江省人，1990年哈尔滨医科大学本科毕业，1996年上海第二医科大学硕士研究生毕业，医师，主要从事肝纤维化发病机制及治疗的研究，发表论文3篇.
项目负责人 姚迪，200092，上海第二医科大学附属新华医院消化研究室，上海市控江路1665号.
Correspondence to Di Yao, Laboratory of Digestion, Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University,1665 Kongjianglu, Shanghai 200092, China
, http://www.100md.com
Tel. +86·21·65454630-4223
收稿日期 1997-10-28
Expression of typeⅠ and Ⅲ procollagen mRNAs in rat hepatocytes with or without platelet-derived growth factor
Di Yao1, Ding-Guo Li1, Feng Cheng2, Tian-Yuan He2 and Qin-Fang Xu1
1Laboratory of Digestion, Xinhua Hospital and 2Department of Biochemistry, Shanghai Second Medical University,Shanghai 200092, China
, 百拇医药
Abstract
AIM To observe the expression of type Ⅰ and Ⅲ procollagen mRNAs of rat hepatocytes and effect of PDGF.
METHODS The expression of type Ⅰ and Ⅲ procollagen mRNAs of rat hepatocytes and the effect of 10μg/L and 30μg/L PDGF
(n=30) were tested with in situ hybridization. The percentage of areas of mRNA expression in the total cell area was also determined.
, 百拇医药
RESULTS The expression of type Ⅰ and Ⅲ procollagen mRNAs was seen in normal rat hepatocytes and with PDGF (two concentrations). The percentage of mRNA expression areas of type Ⅰ and Ⅲ procollagen mRNAs in normal rat hepatocytes was 7.7%±1.9%, with addition of 10μg/L PDGF, 11.5%±1.9% and 11.2%±1.0%; and with 30μg/L PDGF, 15.2%±3.4% and 18.1%±2.8%.
CONCLUSION PDGF is involved in hepatic fibrosis through excessive collagen synthesis of hepatocytes at the transcriptional level.
, 百拇医药
Subject headings liver cirrhosis; liver; procollagen; gene expression; platelet derived growth factor; rats; RNA,messenger
Yao D, Li DG, Cheng F, He TY, Xu QF. Expression of type Ⅰ and Ⅲ procollagen mRNAs in rat hepatocytes with or without plateletderived growth factor. Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(4):300-302
摘要
目的 观察大鼠肝细胞Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因的表达及PDGF对其表达的影响.
, 百拇医药
方法 应用原位杂交技术检测分离培养的SD大鼠肝细胞(n=30)内Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因的表达. 同时观察10μg/L(n=30)和30μg/L(n=30)PDGF促进前胶原基因表达的作用. 测定基因表达颗粒总面积占细胞总面积的百分比，并作比较分析.
结果 无论正常肝细胞或是在两种浓度的PDGF存在时，肝细胞内均可见到Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因的表达. 正常肝细胞Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因表达面积的百分比(%)为7.7±1.9和7.5±2.1；加10μg/L-PDGF后为11.5±1.9和11.2±1.0，而加30μg/L后为15.2±3.4及18.1±2.8，且在后者中表达明显增强(P<0.05及P<0.01).
结论 PDGF在转录水平上促进肝细胞胶原的合成.
主题词 肝硬化；肝；胶原；基因表达；血小板衍化生长因子；大鼠；RNA，信使
, 百拇医药
姚迪, 李定国, 程枫, 何天源, 徐芹芳. 大鼠肝细胞Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因表达及PDGF的影响.华人消化杂志,1998;6(4):300-302
0 引言
肝纤维化是细胞外基质合成、降解和沉积间失衡的结果，其中胶原的过度合成在纤维化形成中占有十分重要的地位. 我们采用细胞原位杂交的方法，观察肝细胞内Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因的表达，同时选用血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor, PDGF)作为干预因素，观察其对肝细胞内Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因表达的影响，以进一步揭示肝纤维化形成的机制.
1 材料和方法
1.1 材料 参照黄俊勇et al[1]方法，自行分离、体外培养SD大鼠肝细胞. 含人Ⅰ型和Ⅲ型前胶原cDNA的质粒pHCALIU, pH FS3由美国博士惠赠. 参照Sambrook et al[2]方法进行质粒的扩增、抽提和纯化.
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1.2 方法
1.2.1 探针的酶切与回收 Ⅰ型前胶原cDNA片段经Pst Ⅰ和PvuⅡ内切酶；Ⅲ型前胶原cDNA片段经PstⅠ和HindⅢ内切酶消化后，应用Gel Extraction Kit回收片段. Ⅰ，Ⅲ型片段长度分别为0.371Kb和0.295Kb.
1.2.2 探针的标记 应用DIG标记试剂盒.
1.2.3 原位杂交 在细胞体外培养3d，加入PDGF，5d，吸出培养液，加入0.4g/L EDTA 消化、收集细胞，并用含1ml/L BSA的PBS洗涤细胞2次，最后用PBS重悬细胞沉淀，调整细胞浓度为1×106/L. 取5μl细胞悬液于酸化处理的载玻片上，室温下干燥10min. 用30g/L多聚甲醛室温下固定10min. 室温下预杂交1h. 预杂交液：4×SSC，400g/L甲酰胺，1×Denharht，10g/L硫酸葡聚糖，0.1g/L tRNA，0.1g/L sperm DNA. 于密闭温盒中37℃杂交过夜. 杂交液：含DIG标记的3μg/L探针. 依次用2×SSC，1×SSC，0.5×SSC洗涤15min. 经苏木精、伊红染色，并依次用乙醇脱水然后用二甲苯脱水，最后用中性树胶封片. 设无DNase的RNase消化的细胞标本、空白标本和用HE染色的标本作为阴性对照.
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2 结果
10μg/L和30μg/L的PDGF均可促进肝细胞Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因的表达，且后者较前者作用强(P<0.05，P<0.01). 而Ⅰ，Ⅲ型前胶原含量未见明显不同(P>0.05)，图1-8. 原位杂交信号通过VIDAS全自动图象分析系统，经过阴影校正，采用低滤过波，使图象增强，然后进行恢度测量. 各组数据经方差齐性检验后行方差分析(表1).
表1 PDGF对鼠肝细胞Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因表达的影响
| 组别 | n | 颗粒总面积/细胞总面积 | |
| Ⅰ | Ⅲ | ||
| 对照组 | 30 | 7.7±1.9 | 7.5±2.1 |
| PDGF(10μg/L) | 30 | 11.5±1.9a | 11.2±1.0b |
| PDGF(30μg/L) | 30 | 15.2±3.4b | 18.1±2.8b |
, 百拇医药
aP<0.05，bP<0.01， vs 对照组.
图1 正常肝细胞Ⅰ型胶原mRNA的表达
图2 PDGF(10μg/L)对Ⅰ型胶原mRNA表达的影响
图3 PDGF(30μg/L)对Ⅰ型胶原mRNA表达的影响
图4 正常肝细胞Ⅲ型胶原mRNA的表达
图5 PDGF(10μg/L)对Ⅲ型胶原mRNA表达的影响
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图6 PDGF(30μg/L)对Ⅲ型胶原mRNA表达的影响
图7 空白对照
图8 HE染色对照
3 讨论
胶原的过度合成在肝纤维化形成过程中占有十分重要的地位. 胶原的种类很多，迄今已发现14种. 在肝组织中有Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ和Ⅵ型，其中含量最多的是Ⅰ，Ⅲ型，占肝内胶原总量的40%左右. 肝纤维化时，Ⅰ，Ⅲ型胶原明显提高，可高达胶原总量的90%，是肝纤维化细胞外基质的主要成分[3]. 我们选用Ⅰ，Ⅲ型前胶原cDNA克隆片段作为探针，观察肝细胞内胶原合成情况. 研究肝脏中胶原的细胞来源，原位杂交是一种可靠的方法，其敏感性高、定位准确，而且胶原mRNA T1/2极短，更能反应胶原合成状态[4]. 我们应用地高辛素标记探针，可使杂交过程更简化、结果稳定、背景清晰.
, 百拇医药
肝内细胞外基质的主要来源仍有争议. 目前国内纤维化机制研究主要集中于细胞外基质及其与成纤维细胞或贮脂细胞的相互作用[5]. 然而肝细胞胶原合成及其代谢对肝纤维化的影响仍不十分清楚. 一种观点认为肝内基质成分主要由间质细胞包括贮脂细胞、肌成纤维细胞及成纤维细胞合成，肝细胞不能合成[6]；但也有研究[7-9]表明肝细胞能够合成Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ型胶原及层粘连蛋白、纤维连接蛋白等基本成分，特别是在某种纤维产生的刺激情况下. 考虑到肝细胞在数量上的绝对优势，我们采用细胞原位杂交方法，观察肝细胞内Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因表达情况. 结果显示无论正常肝细胞或是在PDGF存在时，肝细胞内均可见Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因的表达. 业已证实，许多细胞因子能在转录水平和转录后水平上调节胶原基因的表达. 其中PDGF是参与肝纤维化形成的一个重要生长因子，在慢性肝病中，病毒、内毒素及免疫复合物等能刺激血小板、巨噬细胞及枯否细胞等合成并分泌PDGF和其他细胞因子. PDGF等细胞因子刺激肝内细胞生长、增殖并产生大量细胞外基质，同时促进其沉积. PDGF还能诱导中性粒细胞、单核巨噬细胞、纤维细胞等发生趋化反应，并使之激活，释放生长因子，加剧间质细胞的增殖及结缔组织的形成，引起肝纤维化[9]. 本结果显示，在PDGF存在下，肝细胞内Ⅰ，Ⅲ型前胶原基因表达明显提高，并且与剂量呈正相关(P<0.05). 但是此结果是由PDGF直接作用于肝细胞亦或细胞外基质，间接地影响了肝细胞的功能状态，还需进一步研究.
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4 参考文献
1 黄俊勇，冷欣夫. 大鼠肝细胞的分离技术. 细胞生物学杂志，1991；13(1)：42-44
2 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning. New York. Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:16-42
3 朱国静，范宗涝. 肝纤维化发病机理、诊断及治疗的进展. 临床肝胆病杂志，1993；9(4)：178-181
4 王要军，戴益民. 肝脏胶原基质的病理学进展. 国外医学生理病理和临床分册，1992；12(2)：123-125
5 Weiner FR, Giambrone MA, Czaja MJ, Sheh A, Annoni G, Takahashi S. Ito cell expression and collagen regulation.
, 百拇医药
Hepatology, 1990;11(1):111-120
6 Gressner AM, Bachern MG. Cellular sources of noncollagen matrix proteins: role of fat storing cells in fibrogenesis.
Sem Liver Dis,1990;10(1):30-46
7 Honglum K, Buck M, Adir V, Chojkior M. LAP transactivates the collagen α1 (Ⅰ) gene from a 5＇regulatory region.
J Clin Invest, 1994;94(2):808-814
, 百拇医药
8 Yamada S, Koji T, Hata R, Hirohashi S, Kurata S, Senoo H. Stimultaneous expression of type Ⅰ procollagen mRNA and albumin
in cirrhotic human liver. J Clin Lab Anal, 1992;6(6):351-358
9 Grotendorst GR, Tashijan AH, Clark RA, Sakakibara K. Platelet derived growth factor is a chemoattractant for vascular smooth
muscle cells. J Cell Physiol, 1982;113(1):261-269, 百拇医药(姚迪1 李定国1 程枫2 何天源2 徐芹芳1)