双歧杆菌对实验性大肠癌的抑制作用及其机制的初步探讨
第一军医大学南方医院全军消化内科研究所 广东省广州市 510515
项目负责人 王立生第一军医大学南方医院全军消化内科研究所 广东省广州市 510515
收稿日期 1998-01-20
Subject headings bifidobacterium longum; colonic neoplasms; neoplasm transplantation; diseases models,animal; tumor cells, cultured
主题词 双歧杆菌；结肠肿瘤；肿瘤移植；疾病模型，动物；肿瘤细 胞，培养的中国图书资料分类号 R735.35
, http://www.100md.com
双歧杆菌系革兰阳性无芽胞厌氧菌，为人体及其他动物肠道内的生理性细菌，也是肠道 膜菌群的最重要成分. 它可阻止病原微生物的定植，同时也可合成多种维生素、酶类及 氨基酸等营养物质，对维持人体的健康起重要作用. 近年来发现它还具有抗肿瘤作用，已 证明它在体内对S180肉瘤、肝癌、乳腺癌及Meth A纤维肉瘤等肿瘤的生长与发展起 一定的阻抑作用[1-3]. 本文运用大肠癌细胞裸鼠移植瘤为动物模型，探讨了双 歧杆菌对它的抑制作用，同时对其抑瘤机制也作了初步观察.
1 材料和方法
1.1 材料 BALB/c(nu/nu)，6wk～8wk，雄性，体重约18g～22g，购于 本校实验动物中心，并饲养于其SPF级动物室. 双岐杆菌系本所从健康婴儿粪便中分离培养 所得，经API-20A及TAB系统(广东省妇幼保健院检验科)及快速生化反应鉴定条(广州丽康 生物技术公司)鉴定为青春型. 实验时将双歧杆菌加至硫乙醇酸盐肉汤中，置厌氧培养箱37℃ 培养72h，PBS洗3次，将细菌浓度调至1×1010/ml. Lovo细胞为人未分化结肠 癌细胞，来源于人结肠癌转移淋巴结、经离体培养建株而成. 引自本校病理教研室. 实验时 按常规传代于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，待细胞长至单层后，以0.25%胰蛋白酶 消化贴壁的细胞，收集并调整细胞数为1×107/ml.
, 百拇医药
1.2 方法 实验动物分为二组，每组20只. 肿瘤对照组：实验的d1将2×106(0.2ml) Lovo细胞接种于裸鼠左前肢背部皮上下，d2天起腹腔注射PBS 0.2ml， 1次/d，连续5d；双歧杆菌注射组：实验的d1接种Lovo细胞的数量、程 序、部位同肿瘤对照组. d2起腹腔注射双歧杆菌0.2ml(2×109)， 1次/d，连续5d. 出瘤时以游标卡尺测量肿瘤的最长径和最短径，测量2次/wk ，根据公式计算出肿瘤体积，即体积(V)cm3=(长径×短径2)÷2 . 于实验的 d21将动物处死，剥离瘤体、称重，根据公式计算其抑瘤率，抑瘤率(%)=(肿瘤对照组 平均瘤重-双歧杆菌注射组平均瘤重)÷肿瘤对照组瘤重×100. 同时取新鲜肿瘤组织，以10% 中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，厚约4μm，行HE染色及增殖 细胞核抗原(PCNA)的免疫组化染色. 鼠抗人PCNA单抗及生物素化马抗鼠IgG购自DAKO公司， SP 试剂盒购自北京中山生物技术公司，染色程序按免疫组化常规进行，DAB-H2O2显色 ，苏木素衬染. 结果判断：随机观察并计数500个细胞中的PCNA阳性细胞数，计算出每例的阳性细胞百分率.
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统计学处理 采用t检验.
2 结果
2.1 双歧杆菌体内抑瘤试验结果 实验结果表明肿瘤对照组随着动物存活时间的延长，肿瘤体积逐渐增大，其生长速度显 著高于双歧杆菌注射组(P<0.01). 实验结束时肿瘤对照组及双歧杆菌注射组的平均瘤重分别为2.49g±0.40g及1.01g±0.06g，两者之间比较具有显著性差异(P<0.01)，双歧杆菌对大肠癌移植瘤的抑瘤率为59.64%(图1).
图1 肿瘤对照组及双歧杆菌注射组大肠癌移植瘤的生长曲线 ×—×—× 为肿瘤对照组； ——为双歧杆菌注射组.
, 百拇医药
2.2 大肠癌移植瘤组织PCNA免疫组化染色结果 所有移植瘤组织PCNA免疫组化染色均呈阳性结果，阳性细胞核呈棕黄色，不弥散于胞质、 背景清晰. 肿瘤对照组的PCNA阳性细胞百分率显著高于双歧杆菌注射组，具有显著的统计学 意义(P<0.01， 表1).
表1 双歧杆菌对大肠癌裸鼠移植瘤PCNA表达的影响
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bP<0.01， vs 肿瘤对照组.
3 讨论
双歧杆菌系人和动物肠道内数量占绝对优势的生理性细菌 ，它和机体构成一个和谐 的整体，对维持肠道的微生态平衡起重要作用. 目前发现它在体内具有一定的抗肿瘤作用. Sekine et al报道婴儿型双歧杆菌细胞壁成分完整肽聚糖和Meth A纤维肉瘤细胞混合接 种到小鼠皮下，结果表明它能显著抑制该瘤的生长，同时将完整肽聚糖注射于荷瘤鼠 的Meth A纤维肉瘤的瘤体内，也具有一定的抗肿瘤作用[2]. 国内王跃等也首次报 道了婴儿型双歧杆菌对皮下移植的S180肉瘤具有明显的抑制作用，能使荷瘤鼠存活期 明显延长，病理检查见肿瘤组织坏死明显，其周围有大量的炎细胞浸润[3]. 本文 以青春型双歧杆菌注射到皮下接种了大肠癌细胞的荷瘤鼠的腹腔内，结果表明双歧杆菌 注射组的大肠癌移植瘤生长速度显著低于肿瘤对照组，注射组的平均瘤重亦显著低于对照 组，提示青春型双歧杆菌对大肠癌裸鼠移植瘤的生长与发展具有一定的抑制作用.
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目前双歧杆菌的抑瘤机制还未完全阐明. 大多数学者认为双歧杆菌的抗瘤作用与菌苗 刺激宿主的免疫系统有关，特别是激活其中的巨噬细胞，使之产生一定量的细胞毒性效应分 子和重要递质，如IL-1，IL-6，TNF-α以及NO等等[4]. 我们对大肠癌移植 瘤组织作了PCNA的免疫组化染色，结果显示双歧杆菌注射组的PCNA阳性细胞百分率显著低于 肿瘤对照组. 由于PCNA是细胞DNA聚合酶δ的辅因子，主要在S期表达，为细胞DNA合成所必须，它的表达水平本质上反映了细胞增殖活性的高低[5，6]. 因此结合PCNA的染 色结果，我们认为双歧杆菌可抑制瘤细胞的增殖，降低它的增殖活性，这可能是其抑瘤机 制的一个方面.
4 参考文献
1 Reddy BS, Rivenson A. Inhibition effect of bifidobacterium longum on colon, mammary, and liver carcinogenesis induced by 2 amino
, 百拇医药
3 methylimidazo[4,5f] quinoline, a food mutagen. Cancer Res, 1993;53(9):3914-3918
2 Sekine K, Toida T, Saito M, Kuboyama M, Kawashima T, Hashimoto Y et al. A new morphologically characterized cell wall
preparation (whole peptidoglycan)from bifidobacterium infantis with a higher efficacy on the regression of an established tumor
in mice. Cancer Res,1985;45(3):1300-1307
, http://www.100md.com
3 王跃，胡宏，刘明方，陈淑惠. 婴儿双歧杆菌对小鼠肉瘤S180的抑制作用. 中国微生态学杂志，1989；1(1)：24-27
4 Sekine K,Ohta J, Onishi M, Tatsuki T, Shimokawa Y, Toida T et al. Analysis of antitumor properties of effector cells stimulated with
a cell wall preparation (WPG) of bifidobacterium infantis.Biol Pharm Bull,1995;18(1):148-153
5 Holl PA, Levison DA, Woods AL, Sopin C, Bouley C, Trugnan G et al. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunolocalization
in paraffin sections: an index of cell proliferation with evidence of deregulated expression in some neoplasms.
J Pathol,1990;162(2):285-294
6 Merkel DE, Mcguire WL. Ploidy, proliferative activity and prognosis, DNA flow cytometry of solid tumors. Cancer,1990;65(3):1194-1205, http://www.100md.com(王立生 潘令嘉 施 理 张亚历 周殿元)
项目负责人 王立生第一军医大学南方医院全军消化内科研究所 广东省广州市 510515
收稿日期 1998-01-20
Subject headings bifidobacterium longum; colonic neoplasms; neoplasm transplantation; diseases models,animal; tumor cells, cultured
主题词 双歧杆菌；结肠肿瘤；肿瘤移植；疾病模型，动物；肿瘤细 胞，培养的中国图书资料分类号 R735.35
, http://www.100md.com
双歧杆菌系革兰阳性无芽胞厌氧菌，为人体及其他动物肠道内的生理性细菌，也是肠道 膜菌群的最重要成分. 它可阻止病原微生物的定植，同时也可合成多种维生素、酶类及 氨基酸等营养物质，对维持人体的健康起重要作用. 近年来发现它还具有抗肿瘤作用，已 证明它在体内对S180肉瘤、肝癌、乳腺癌及Meth A纤维肉瘤等肿瘤的生长与发展起 一定的阻抑作用[1-3]. 本文运用大肠癌细胞裸鼠移植瘤为动物模型，探讨了双 歧杆菌对它的抑制作用，同时对其抑瘤机制也作了初步观察.
1 材料和方法
1.1 材料 BALB/c(nu/nu)，6wk～8wk，雄性，体重约18g～22g，购于 本校实验动物中心，并饲养于其SPF级动物室. 双岐杆菌系本所从健康婴儿粪便中分离培养 所得，经API-20A及TAB系统(广东省妇幼保健院检验科)及快速生化反应鉴定条(广州丽康 生物技术公司)鉴定为青春型. 实验时将双歧杆菌加至硫乙醇酸盐肉汤中，置厌氧培养箱37℃ 培养72h，PBS洗3次，将细菌浓度调至1×1010/ml. Lovo细胞为人未分化结肠 癌细胞，来源于人结肠癌转移淋巴结、经离体培养建株而成. 引自本校病理教研室. 实验时 按常规传代于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，待细胞长至单层后，以0.25%胰蛋白酶 消化贴壁的细胞，收集并调整细胞数为1×107/ml.
, 百拇医药
1.2 方法 实验动物分为二组，每组20只. 肿瘤对照组：实验的d1将2×106(0.2ml) Lovo细胞接种于裸鼠左前肢背部皮上下，d2天起腹腔注射PBS 0.2ml， 1次/d，连续5d；双歧杆菌注射组：实验的d1接种Lovo细胞的数量、程 序、部位同肿瘤对照组. d2起腹腔注射双歧杆菌0.2ml(2×109)， 1次/d，连续5d. 出瘤时以游标卡尺测量肿瘤的最长径和最短径，测量2次/wk ，根据公式计算出肿瘤体积，即体积(V)cm3=(长径×短径2)÷2 . 于实验的 d21将动物处死，剥离瘤体、称重，根据公式计算其抑瘤率，抑瘤率(%)=(肿瘤对照组 平均瘤重-双歧杆菌注射组平均瘤重)÷肿瘤对照组瘤重×100. 同时取新鲜肿瘤组织，以10% 中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，厚约4μm，行HE染色及增殖 细胞核抗原(PCNA)的免疫组化染色. 鼠抗人PCNA单抗及生物素化马抗鼠IgG购自DAKO公司， SP 试剂盒购自北京中山生物技术公司，染色程序按免疫组化常规进行，DAB-H2O2显色 ，苏木素衬染. 结果判断：随机观察并计数500个细胞中的PCNA阳性细胞数，计算出每例的阳性细胞百分率.
, 百拇医药
统计学处理 采用t检验.
2 结果
2.1 双歧杆菌体内抑瘤试验结果 实验结果表明肿瘤对照组随着动物存活时间的延长，肿瘤体积逐渐增大，其生长速度显 著高于双歧杆菌注射组(P<0.01). 实验结束时肿瘤对照组及双歧杆菌注射组的平均瘤重分别为2.49g±0.40g及1.01g±0.06g，两者之间比较具有显著性差异(P<0.01)，双歧杆菌对大肠癌移植瘤的抑瘤率为59.64%(图1).
图1 肿瘤对照组及双歧杆菌注射组大肠癌移植瘤的生长曲线 ×—×—× 为肿瘤对照组； ——为双歧杆菌注射组.
, 百拇医药
2.2 大肠癌移植瘤组织PCNA免疫组化染色结果 所有移植瘤组织PCNA免疫组化染色均呈阳性结果，阳性细胞核呈棕黄色，不弥散于胞质、 背景清晰. 肿瘤对照组的PCNA阳性细胞百分率显著高于双歧杆菌注射组，具有显著的统计学 意义(P<0.01， 表1).
表1 双歧杆菌对大肠癌裸鼠移植瘤PCNA表达的影响
| 组别 | n | PCNA阳性率(x-±s) |
| 肿瘤对照组 | 20 | 172±84.20 |
| 双歧杆菌注射组 | 20 | 65.44±37.23b |
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bP<0.01， vs 肿瘤对照组.
3 讨论
双歧杆菌系人和动物肠道内数量占绝对优势的生理性细菌 ，它和机体构成一个和谐 的整体，对维持肠道的微生态平衡起重要作用. 目前发现它在体内具有一定的抗肿瘤作用. Sekine et al报道婴儿型双歧杆菌细胞壁成分完整肽聚糖和Meth A纤维肉瘤细胞混合接 种到小鼠皮下，结果表明它能显著抑制该瘤的生长，同时将完整肽聚糖注射于荷瘤鼠 的Meth A纤维肉瘤的瘤体内，也具有一定的抗肿瘤作用[2]. 国内王跃等也首次报 道了婴儿型双歧杆菌对皮下移植的S180肉瘤具有明显的抑制作用，能使荷瘤鼠存活期 明显延长，病理检查见肿瘤组织坏死明显，其周围有大量的炎细胞浸润[3]. 本文 以青春型双歧杆菌注射到皮下接种了大肠癌细胞的荷瘤鼠的腹腔内，结果表明双歧杆菌 注射组的大肠癌移植瘤生长速度显著低于肿瘤对照组，注射组的平均瘤重亦显著低于对照 组，提示青春型双歧杆菌对大肠癌裸鼠移植瘤的生长与发展具有一定的抑制作用.
, http://www.100md.com
目前双歧杆菌的抑瘤机制还未完全阐明. 大多数学者认为双歧杆菌的抗瘤作用与菌苗 刺激宿主的免疫系统有关，特别是激活其中的巨噬细胞，使之产生一定量的细胞毒性效应分 子和重要递质，如IL-1，IL-6，TNF-α以及NO等等[4]. 我们对大肠癌移植 瘤组织作了PCNA的免疫组化染色，结果显示双歧杆菌注射组的PCNA阳性细胞百分率显著低于 肿瘤对照组. 由于PCNA是细胞DNA聚合酶δ的辅因子，主要在S期表达，为细胞DNA合成所必须，它的表达水平本质上反映了细胞增殖活性的高低[5，6]. 因此结合PCNA的染 色结果，我们认为双歧杆菌可抑制瘤细胞的增殖，降低它的增殖活性，这可能是其抑瘤机 制的一个方面.
4 参考文献
1 Reddy BS, Rivenson A. Inhibition effect of bifidobacterium longum on colon, mammary, and liver carcinogenesis induced by 2 amino
, 百拇医药
3 methylimidazo[4,5f] quinoline, a food mutagen. Cancer Res, 1993;53(9):3914-3918
2 Sekine K, Toida T, Saito M, Kuboyama M, Kawashima T, Hashimoto Y et al. A new morphologically characterized cell wall
preparation (whole peptidoglycan)from bifidobacterium infantis with a higher efficacy on the regression of an established tumor
in mice. Cancer Res,1985;45(3):1300-1307
, http://www.100md.com
3 王跃，胡宏，刘明方，陈淑惠. 婴儿双歧杆菌对小鼠肉瘤S180的抑制作用. 中国微生态学杂志，1989；1(1)：24-27
4 Sekine K,Ohta J, Onishi M, Tatsuki T, Shimokawa Y, Toida T et al. Analysis of antitumor properties of effector cells stimulated with
a cell wall preparation (WPG) of bifidobacterium infantis.Biol Pharm Bull,1995;18(1):148-153
5 Holl PA, Levison DA, Woods AL, Sopin C, Bouley C, Trugnan G et al. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunolocalization
in paraffin sections: an index of cell proliferation with evidence of deregulated expression in some neoplasms.
J Pathol,1990;162(2):285-294
6 Merkel DE, Mcguire WL. Ploidy, proliferative activity and prognosis, DNA flow cytometry of solid tumors. Cancer,1990;65(3):1194-1205, http://www.100md.com(王立生 潘令嘉 施 理 张亚历 周殿元)