肝癌分子流行病学的研究
上海市北医院 上海市 200435
项目负责人 周汉高上海市北医院 上海市 200435
收稿日期 1998-02-06
Subject headings liver neoplasms/epidemiology; liver neoplasms/etiology; liver neoplasms/genetics; molecular biology; aflatoxin B1; chromosome aberrations; oncogenes; genes, suppressor, tumor
主题词 肝肿瘤/流行病学；肝肿瘤/病因学；肝肿瘤/遗传学；分子生物学；黄曲霉素B1；染色体畸变；癌基因；基因，抑制，肿瘤
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分子流行病学是将传统流行病学的原理和方法与现代分子生物学技术相结合的一门科学[1]. 开展分子流行病学研究必须应用各种生物标志物(biomarker)[2]. 生物标志物是环境病因与生物机体相互作用的产物. 分子生物标志物大致可分为三类：暴露、效应和遗传易感性生物标志物[3].
1 暴露生物标志物
暴露生物标志物系由外界的致病因子进入机体，经过代谢，与体内大分子、靶细胞或组织，甚至与DNA结合后形成的产物[4]. 以肝癌而言，主要研究黄曲霉毒素B1(AFB1)与机体形成加合物的病因学意义.
, 百拇医药
1.1 AFB1与清蛋白结合 应用黄曲霉毒素清蛋白加合物证明肝癌高发区与摄入黄曲霉毒素多少有关；与发生肝癌的相对危险度有关；与居民主食玉米改为大米比例相关[1].
队例研究显示，肝细胞癌(HCC)患者血清AFB1-清蛋白加合物显著增加. Chan et al应用ELISA法测定20例HCC患者和对照组86名健康人的血清AFB1-清蛋白加合物，结果13例(65%)HCC患者和对照组的32名健康人(37%)阳性. 旷双远等对启东804例HBsAg阳性的肝癌高危人群进行了5a的队例研究，并检测其中发现的34例肝癌和170名对照的血清AFB1-清蛋白加合物水平. 肝癌病例血清AFB1-清蛋白加合物阳性率为73.5%，平均水平为1.65nmol/L清蛋白；对照组阳性率50%，平均水平为1.45nmol/L清蛋白，两者有显著性差异. 加合物阳性者肝癌相对危险度估计值(OR)为2.8.
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1.2 黄曲霉毒素与鸟嘌呤结合 钱耕荪et al[4]应用单克隆抗体亲和层析柱结合高效液相色谱法测定了50例肝癌及267名健康人对照尿液中AFB1或黄曲霉毒素B(AFB)及其代谢物，AFP1、AFM1及黄曲霉毒素(AFT)-N7-鸟嘌呤加合物，同时用RIA试剂检测血清HBsAg阳性肝癌尿液中含一种或一种以上AFT标志物的检出率显著高于对照组. 尿液中如只检出AFMI，AFP1或AFB1或AFB，不同时伴有AFT-N7-鸟嘌呤加合物，其发生肝癌的相对危险度比同时伴有AFT-N7-鸟嘌呤加合物者低得多. 而且在调整HBsAg及吸烟等混杂因素后，尿液中AFP1或AFB阳性与肝癌的关系无统计学上显著性联系，这表明尿液AFT标志物，尤其是AFT-N7-鸟嘌呤加合物与肝癌具有显著的相关性，并在个体水平上提供了AFT暴露与HBV感染对肝癌发生有明显协同作用的证据. 在上海，花生及酱油是饮食中AFB1的最主要来源，队列对象摄入AFB1总量的80%以上均来自这两种食品. Ross et al通过AFB1-鸟嘌呤加合物等研究，亦观察到慢性乙型肝炎血清学标志物和AFB1暴露呈协同致癌作用.
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1.3 AFB1与肝细胞DNA结合 Chen et al分析台湾50例HCC活检涂片样本中AFB1 DNA加合物，发现35例(70%) HCC中存在AFB1 DNA加合物. 男性检出率(69%)略低于女性(75%)，年轻患者加合物检出率(84%)显著高于老年人(58%). HBsAg和HBeAg均阳性，仅HBsAg阳性和这些抗原均阴性的患者中检出率不同，分别为29%，74%和82%. 有HCC家族史者检出率(100%)高于无家族史者(67%). 这些结果提示在台湾AFB1可能涉及HCC的发生，分析少量细胞中AFB1 DNA加合物有助于监测AFB1的生物学作用.
2 效应生物标志物
效应生物标志物是由在靶位置或类似靶位置毒性反应所造成的不可逆的生物学反应. 并且认为是病理上与癌症有关的生物标志物. 在危险性评价过程中可用于直接危害的辨认和剂量反应评价. 不同个体或群体对同等剂量的化学致癌物有较大的变异[5].
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2.1 染色体损伤 致突变物可导致染色体和染色单体畸变. Sorsa[6]报告在接触基因毒性化合物的人群前瞻性研究中观察到淋巴细胞染色体畸变率，并认为与癌症的危险性有联系. 沈卫平等检测了24例肝癌、39例肝癌一级亲族、8例慢性肝炎和36例无肿瘤家族史的外周血染色体畸变和脆性部位，结果染色体畸变分别为7.63%，2.52%，0.67%和0.37%. 脆性部位表达分别为66次、29次、1次和0. 提示不仅肝癌患者外周血染色体畸变率和脆性部位显著高于其他各组(P均<0.01)，而且一级亲族组亦显著高于慢性肝炎和对照组. 为探索肝癌与遗传因素的关系，翁立红et al[7]针对肝癌患者、乙肝病毒携带者和正常人外周血淋巴细胞进行染色体畸变的分析对比. 结果表明：肝癌患者外周血淋巴细胞染色体具有不稳定性和抗诱变能力差的特点，此与肝癌的发生和发展密切关系.
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2.2 微核 微核是由于无着丝粒染色体片断聚集或整个染色体在复制后期的移动被滞留所造成. 因此，微核被认为染色体畸变[5]. 刘耳
et al[8]调查了启东124例健康人外周血淋巴细胞微核率，结果表明自发微核率为0.76‰±0.07‰，HBsAg阳性组微核率、微核者出现率显著高于阴性组(P<0.05或<0.01). 提示HBV感染者染色体畸变、自发微核率明显上升，对人类存在着致突变、致癌的潜在危险.
2.3 癌基因激活和抑癌基因失活 癌基因激活刺激生长或抑癌基因失活解除生长限制，均可导致无法控制的癌细胞增生[9]. 以肝癌而言，研究最多的是p53基因的突变热点，即在249密码的第三碱基上G：T→T：A颠换，导致精氨酸→丝氨酸的变化. 这与AFB1引起动物实验的突变位置一致，间接支持了其致癌作用. 国内外许多学者研究表明，除中国大陆和南部非洲AFT高暴露的一些地区外，在HCC中极少见有p53突变热点. Ozturk et al发表从14个不同国家收集的标本，其中包括北美、欧洲、中东和日本等95例HCC，均未发现突变热点. 邓卓霖 et al[10]研究广西AFB1高、中、低暴露区的HCC标本，发现p53基因突变热点分别为67%，60%和10%.
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3 遗传易感性生物标志物
研究表明，接触同样数量致癌物的个体中，某些生物标志物的水平有高度差异，其中包括遗传易感性生物标志物.
3.1 姐妹染色单体互换(SCE) 余新生等对启东一个四代109名成员的大家族进行了研究发现，有10例患肝癌. 选择其中7例和生活环境相同的9名作对照结果表明，如不经AFB1处理，肝癌家族与对照组的淋巴细胞SCE值无显著差异；经AFB1 0.01mg处理后，前者SCE值显著高于后者(P<0.01). 提示肝癌高发家族对AFB1存在着遗传易感性，并认为肝癌家族的发生可能是遗传因素与AFB1共同作用的结果. AFB1导致易感个体的淋巴细胞发生突变，是由于AFB1容易和细胞中DNA上碱基结合，使淋巴细胞的免疫监视功能受阻或丧失，从而较一般人容易发生肿瘤.
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3.2 DNA修复 尽管基因毒性因子可以达到靶组织，但染色体断裂仍依赖于DNA修复机制的缺陷. 淋巴细胞DNA非程序合成(UDS)已被广泛用来估价人体DNA修复能力和致癌的敏感性. 瞿永华等用盐酸氮芥作为诱导剂测定了启东肝癌患者、肝癌高发家族和肿瘤低发家族成员外周血淋巴细胞的UDS结果表明：肝癌患者组、肝癌高发家族组的UDS的平均值比肿瘤低发家族组分别增加58%(P<0.01)和47%(P<0.05). 肝癌患者组和肝癌家族成员的UDS差别不显著(P>0.05). 作者认为其机制有两种可能：①由于前两组人群淋巴细胞染色体结构上的差异，易为致癌物质接近而使DNA受损伤，从而使UDS增高；②前两组由于修复时连接障碍，修复合成的DNA片段不能及时与原来的DNA连接，致使修复合成片段延长，导致UDS值增高. 但其确切机制尚待进一步探讨. 王金兵等应用UDS试验，估价肝癌家系成员和HBsAg携带者外周血淋巴细胞DNA损伤和修复能力，结果：①肝癌患者及其一级亲属UDS值显著高于对照组；②HBsAg携带者UDS值亦明显高于对照组；③HBsAg阴性肝癌及其亲族UDS值与对照组有显著差异. 以上提示肝癌的发生可能是环境因素与遗传易感性共同作用的结果[15].
, 百拇医药
总之，分子流行病学是近年来崛起的一门新学科，应用三种生物标志物对肝癌进行了危险度评估，为预防肝癌提供了一个客观的指标.
4 参考文献
1 俞顺章. 发展中的分子流行病学. 中华流行病学杂志，1997；18(4)：195-196
2 McMichael AJ. Invited commentary“Molecular Epidemiology”: new pathway or new travelling Companion Am J
Epidem, 1994;140(2):1-11
3 World Health Organization. Biomarkers and risk assessment: concepts and principles. Environmental Health Criteria.
, http://www.100md.com
Geneva,1993:155-210
4 钱耕荪，袁剑敏，屠基陶，褚兴棣，王学励，旷双远. et al. 尿液中黄曲霉毒素——DNA加合物与肝癌的关系前瞻性研究.
肿瘤，1995；15(2)：63-67
5 资晓林，俞顺章，董传辉. 分子生物学标志物与肿瘤危险性评价.中华流行病学杂志，1997；18(4)：244-247
6 Sorsa M. Cytogenetic surveillance of workers exposed to genotoxic chemicals: prelimary experiences from a prospective cancer
study in a cytogenetic cohort. Teratog Carcinog Mutagen, 1990;10(3):215-218
, 百拇医药
7 翁立红，姚竹秀，顾文祥. 肝癌患者外周血淋巴细胞染色体畸变及姐妹染色单体交换的研究.癌症，1996；15(4)：271-272
8 刘耳，张启南，王金兵，吴燕. 健康人群自发微核率和HBV感染的调查.右江医学，1992；20(2)：80-81
9 Balmain A, Brown K. Oncogen activation in chemical carcinogenesis. Adv Cancer Res, 1988;51(2):147-156
10 邓卓霖，潘朗星，马韵，彭怀政，丁志敏. 广西黄曲霉毒素高危区肝癌p53基因序列改变.中华肿瘤杂志，1997；19(1)：18-22, 百拇医药(周汉高 顾公望)
项目负责人 周汉高上海市北医院 上海市 200435
收稿日期 1998-02-06
Subject headings liver neoplasms/epidemiology; liver neoplasms/etiology; liver neoplasms/genetics; molecular biology; aflatoxin B1; chromosome aberrations; oncogenes; genes, suppressor, tumor
主题词 肝肿瘤/流行病学；肝肿瘤/病因学；肝肿瘤/遗传学；分子生物学；黄曲霉素B1；染色体畸变；癌基因；基因，抑制，肿瘤
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分子流行病学是将传统流行病学的原理和方法与现代分子生物学技术相结合的一门科学[1]. 开展分子流行病学研究必须应用各种生物标志物(biomarker)[2]. 生物标志物是环境病因与生物机体相互作用的产物. 分子生物标志物大致可分为三类：暴露、效应和遗传易感性生物标志物[3].
1 暴露生物标志物
暴露生物标志物系由外界的致病因子进入机体，经过代谢，与体内大分子、靶细胞或组织，甚至与DNA结合后形成的产物[4]. 以肝癌而言，主要研究黄曲霉毒素B1(AFB1)与机体形成加合物的病因学意义.
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1.1 AFB1与清蛋白结合 应用黄曲霉毒素清蛋白加合物证明肝癌高发区与摄入黄曲霉毒素多少有关；与发生肝癌的相对危险度有关；与居民主食玉米改为大米比例相关[1].
队例研究显示，肝细胞癌(HCC)患者血清AFB1-清蛋白加合物显著增加. Chan et al应用ELISA法测定20例HCC患者和对照组86名健康人的血清AFB1-清蛋白加合物，结果13例(65%)HCC患者和对照组的32名健康人(37%)阳性. 旷双远等对启东804例HBsAg阳性的肝癌高危人群进行了5a的队例研究，并检测其中发现的34例肝癌和170名对照的血清AFB1-清蛋白加合物水平. 肝癌病例血清AFB1-清蛋白加合物阳性率为73.5%，平均水平为1.65nmol/L清蛋白；对照组阳性率50%，平均水平为1.45nmol/L清蛋白，两者有显著性差异. 加合物阳性者肝癌相对危险度估计值(OR)为2.8.
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1.2 黄曲霉毒素与鸟嘌呤结合 钱耕荪et al[4]应用单克隆抗体亲和层析柱结合高效液相色谱法测定了50例肝癌及267名健康人对照尿液中AFB1或黄曲霉毒素B(AFB)及其代谢物，AFP1、AFM1及黄曲霉毒素(AFT)-N7-鸟嘌呤加合物，同时用RIA试剂检测血清HBsAg阳性肝癌尿液中含一种或一种以上AFT标志物的检出率显著高于对照组. 尿液中如只检出AFMI，AFP1或AFB1或AFB，不同时伴有AFT-N7-鸟嘌呤加合物，其发生肝癌的相对危险度比同时伴有AFT-N7-鸟嘌呤加合物者低得多. 而且在调整HBsAg及吸烟等混杂因素后，尿液中AFP1或AFB阳性与肝癌的关系无统计学上显著性联系，这表明尿液AFT标志物，尤其是AFT-N7-鸟嘌呤加合物与肝癌具有显著的相关性，并在个体水平上提供了AFT暴露与HBV感染对肝癌发生有明显协同作用的证据. 在上海，花生及酱油是饮食中AFB1的最主要来源，队列对象摄入AFB1总量的80%以上均来自这两种食品. Ross et al通过AFB1-鸟嘌呤加合物等研究，亦观察到慢性乙型肝炎血清学标志物和AFB1暴露呈协同致癌作用.
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1.3 AFB1与肝细胞DNA结合 Chen et al分析台湾50例HCC活检涂片样本中AFB1 DNA加合物，发现35例(70%) HCC中存在AFB1 DNA加合物. 男性检出率(69%)略低于女性(75%)，年轻患者加合物检出率(84%)显著高于老年人(58%). HBsAg和HBeAg均阳性，仅HBsAg阳性和这些抗原均阴性的患者中检出率不同，分别为29%，74%和82%. 有HCC家族史者检出率(100%)高于无家族史者(67%). 这些结果提示在台湾AFB1可能涉及HCC的发生，分析少量细胞中AFB1 DNA加合物有助于监测AFB1的生物学作用.
2 效应生物标志物
效应生物标志物是由在靶位置或类似靶位置毒性反应所造成的不可逆的生物学反应. 并且认为是病理上与癌症有关的生物标志物. 在危险性评价过程中可用于直接危害的辨认和剂量反应评价. 不同个体或群体对同等剂量的化学致癌物有较大的变异[5].
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2.1 染色体损伤 致突变物可导致染色体和染色单体畸变. Sorsa[6]报告在接触基因毒性化合物的人群前瞻性研究中观察到淋巴细胞染色体畸变率，并认为与癌症的危险性有联系. 沈卫平等检测了24例肝癌、39例肝癌一级亲族、8例慢性肝炎和36例无肿瘤家族史的外周血染色体畸变和脆性部位，结果染色体畸变分别为7.63%，2.52%，0.67%和0.37%. 脆性部位表达分别为66次、29次、1次和0. 提示不仅肝癌患者外周血染色体畸变率和脆性部位显著高于其他各组(P均<0.01)，而且一级亲族组亦显著高于慢性肝炎和对照组. 为探索肝癌与遗传因素的关系，翁立红et al[7]针对肝癌患者、乙肝病毒携带者和正常人外周血淋巴细胞进行染色体畸变的分析对比. 结果表明：肝癌患者外周血淋巴细胞染色体具有不稳定性和抗诱变能力差的特点，此与肝癌的发生和发展密切关系.
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2.2 微核 微核是由于无着丝粒染色体片断聚集或整个染色体在复制后期的移动被滞留所造成. 因此，微核被认为染色体畸变[5]. 刘耳
et al[8]调查了启东124例健康人外周血淋巴细胞微核率，结果表明自发微核率为0.76‰±0.07‰，HBsAg阳性组微核率、微核者出现率显著高于阴性组(P<0.05或<0.01). 提示HBV感染者染色体畸变、自发微核率明显上升，对人类存在着致突变、致癌的潜在危险.
2.3 癌基因激活和抑癌基因失活 癌基因激活刺激生长或抑癌基因失活解除生长限制，均可导致无法控制的癌细胞增生[9]. 以肝癌而言，研究最多的是p53基因的突变热点，即在249密码的第三碱基上G：T→T：A颠换，导致精氨酸→丝氨酸的变化. 这与AFB1引起动物实验的突变位置一致，间接支持了其致癌作用. 国内外许多学者研究表明，除中国大陆和南部非洲AFT高暴露的一些地区外，在HCC中极少见有p53突变热点. Ozturk et al发表从14个不同国家收集的标本，其中包括北美、欧洲、中东和日本等95例HCC，均未发现突变热点. 邓卓霖 et al[10]研究广西AFB1高、中、低暴露区的HCC标本，发现p53基因突变热点分别为67%，60%和10%.
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3 遗传易感性生物标志物
研究表明，接触同样数量致癌物的个体中，某些生物标志物的水平有高度差异，其中包括遗传易感性生物标志物.
3.1 姐妹染色单体互换(SCE) 余新生等对启东一个四代109名成员的大家族进行了研究发现，有10例患肝癌. 选择其中7例和生活环境相同的9名作对照结果表明，如不经AFB1处理，肝癌家族与对照组的淋巴细胞SCE值无显著差异；经AFB1 0.01mg处理后，前者SCE值显著高于后者(P<0.01). 提示肝癌高发家族对AFB1存在着遗传易感性，并认为肝癌家族的发生可能是遗传因素与AFB1共同作用的结果. AFB1导致易感个体的淋巴细胞发生突变，是由于AFB1容易和细胞中DNA上碱基结合，使淋巴细胞的免疫监视功能受阻或丧失，从而较一般人容易发生肿瘤.
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3.2 DNA修复 尽管基因毒性因子可以达到靶组织，但染色体断裂仍依赖于DNA修复机制的缺陷. 淋巴细胞DNA非程序合成(UDS)已被广泛用来估价人体DNA修复能力和致癌的敏感性. 瞿永华等用盐酸氮芥作为诱导剂测定了启东肝癌患者、肝癌高发家族和肿瘤低发家族成员外周血淋巴细胞的UDS结果表明：肝癌患者组、肝癌高发家族组的UDS的平均值比肿瘤低发家族组分别增加58%(P<0.01)和47%(P<0.05). 肝癌患者组和肝癌家族成员的UDS差别不显著(P>0.05). 作者认为其机制有两种可能：①由于前两组人群淋巴细胞染色体结构上的差异，易为致癌物质接近而使DNA受损伤，从而使UDS增高；②前两组由于修复时连接障碍，修复合成的DNA片段不能及时与原来的DNA连接，致使修复合成片段延长，导致UDS值增高. 但其确切机制尚待进一步探讨. 王金兵等应用UDS试验，估价肝癌家系成员和HBsAg携带者外周血淋巴细胞DNA损伤和修复能力，结果：①肝癌患者及其一级亲属UDS值显著高于对照组；②HBsAg携带者UDS值亦明显高于对照组；③HBsAg阴性肝癌及其亲族UDS值与对照组有显著差异. 以上提示肝癌的发生可能是环境因素与遗传易感性共同作用的结果[15].
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总之，分子流行病学是近年来崛起的一门新学科，应用三种生物标志物对肝癌进行了危险度评估，为预防肝癌提供了一个客观的指标.
4 参考文献
1 俞顺章. 发展中的分子流行病学. 中华流行病学杂志，1997；18(4)：195-196
2 McMichael AJ. Invited commentary“Molecular Epidemiology”: new pathway or new travelling Companion Am J
Epidem, 1994;140(2):1-11
3 World Health Organization. Biomarkers and risk assessment: concepts and principles. Environmental Health Criteria.
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Geneva,1993:155-210
4 钱耕荪，袁剑敏，屠基陶，褚兴棣，王学励，旷双远. et al. 尿液中黄曲霉毒素——DNA加合物与肝癌的关系前瞻性研究.
肿瘤，1995；15(2)：63-67
5 资晓林，俞顺章，董传辉. 分子生物学标志物与肿瘤危险性评价.中华流行病学杂志，1997；18(4)：244-247
6 Sorsa M. Cytogenetic surveillance of workers exposed to genotoxic chemicals: prelimary experiences from a prospective cancer
study in a cytogenetic cohort. Teratog Carcinog Mutagen, 1990;10(3):215-218
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7 翁立红，姚竹秀，顾文祥. 肝癌患者外周血淋巴细胞染色体畸变及姐妹染色单体交换的研究.癌症，1996；15(4)：271-272
8 刘耳，张启南，王金兵，吴燕. 健康人群自发微核率和HBV感染的调查.右江医学，1992；20(2)：80-81
9 Balmain A, Brown K. Oncogen activation in chemical carcinogenesis. Adv Cancer Res, 1988;51(2):147-156
10 邓卓霖，潘朗星，马韵，彭怀政，丁志敏. 广西黄曲霉毒素高危区肝癌p53基因序列改变.中华肿瘤杂志，1997；19(1)：18-22, 百拇医药(周汉高 顾公望)