肝动脉灌注阿霉素毫微粒在荷肝瘤鼠体内的药物分布及药效研究
第四军医大学 1唐都医院介入放射科 2基础部化学教研室 3基础部微生物学教研室 4西京医院药剂科 陕西省西安市 710038
陈江浩，男，1972-10-29生，陕西省宝鸡市人，汉族. 1995年第四军医大学医疗系毕业，1998年第四军医大学硕士研究生毕业，主要从事肿瘤的介入治疗研究，发表论文3篇.
项目负责人 陈江浩，710038，陕西省西安市，第四军医大学唐都医院介入放射科.
Correspondence to Jiang-Hao Chen, Department of Interventional Radiology, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710038, Shaanxi Province, China
Tel. +86·29·3510595-77154
收稿日期 1998-06-29
Drug distribution and therapeutic effect of nanoparticle-associated adriamycin injected into
hepatic artery of hepatoma-bearing rats
Jiang-Hao Chen1, Zhi-Min Wang1, Dao-Cheng Wu2, Shan-Dan Xu1, Hai-Wei Chen3 and Ai-Dong Wen4
1Department of Interventional Radiology, Tangdu Hospital,2Departments of Chemistry, and 3Microbiology, Faculty of Preclinical Medicine,
4Department of Pharmacy, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710038, Shaanxi Province, China
Abstract
AIM To investigate the drug distribution and therapeutic effect of nanoparticle-associated adriamycin (NADM) after perfusion into the hepatic artery of hepatoma-bearing rats.
METHODS Walker-256 (W256) carcinosarcoma cells were surgically implanted into the left liver lobe of 90 male SD rats, which were divided into 6 groups at random, with 15 rats for each group. NADM and free adriamycin (FADM) were injected into the hepatic artery of animals on the 7th day after the tumor inoculation. The dose of adriamycin in each formulation was 2mg/kg body weight, and the concentration was 1.0g/L. At 1, 5 and 15 hours after drug administration, 5 animals in each group were sacrificed and the adriamycin concentrations in the plasma, liver, heart, spleen, lungs, kidneys, and tumor were determined by using a reverse phase high performance liquid chromatography with fluorescence detector (RP-HPLC) technique. Normal saline (NS), FADM, adriamycin mixed with unloaded nanoparticles (ADM+NP), and NADM were injected into the remaining 4 groups.
RESULTS NADM increased the adriamycin concentrations significantly in the liver, spleen and tumor of rats at 1, 5, and 15 hours after injection (P<0.01), as compared to FADM, whereas the concentrations in the plasma, heart and lungs were markedly decreased (P<0.01). The survival time was significantly prolonged in animals receiving NADM (P<0.01), the tumor growth inhibition was more remarkable (P<0.01) and necrosis was more extensive as compared with those treated with FADM or ADM+NP.
CONCLUSION The in vivo distribution of adriamycin could be modified by its encapsulation in nanoparticles and administration via the hepatic artery, and the tumor has a higher drug concentration. NADM was more effective in the treatment of hepatoma as compared with ADM and ADM+NP.
Subject headings liver neoplasms/drug therapy; adriamycin/therapeutic use; adriamycin/metabolism;
adriamycin/pharmacology; disease models, animal
Chen JH, Wang ZM, Wu DC, Xu SD, Chen HW, Wen AD. Drug distribution and therapeutic effect of nanoparticle-associated adriamycin injected into hepatic artery of hepatoma-bearing rats. Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(12):1048-1051
摘要
目的 研究阿霉素毫微粒(NADM)经肝动脉灌注后在荷肝肿瘤鼠体内的药物分布与药效.
方法 SD纯系大鼠90只，建立W256移植性肝癌模型并随机分为6组，每组15只动物，其中2组供药物分布研究，4组供药效研究. 药物分布组经肝动脉以2mg/kg药物剂量分别注入NADM与游离阿霉素(FADM)，每组于给药后1，5，15h各处死5只大鼠，分别提取血浆、肝、心、脾、肺、肾、肝肿瘤样品，采用反相高效液相色谱荧光检测法测定药物浓度；药效组经肝动脉分别灌注生理盐水(NS)，FADM、阿霉素加空白毫微粒(ADM+NP)和NADM.
结果 给药后1，5，15h时NADM组大鼠肝、脾、肝肿瘤中阿霉素浓度均显著高于FADM组(P<0.01)，而血浆、心、肺中阿霉素浓度则显著降低(P<0.01). 与FADM及ADM+NP组相比，经NADM治疗的大鼠生存期显著延长(P<0.01)，对肿瘤生长的抑制更为明显(P<0.01)，肿瘤坏死更广泛，更彻底.
结论 NADM经肝动脉给药后改变了阿霉素的体内分布特征，对肝肿瘤表现出明显的靶向性，并显著提高阿霉素的疗效.
主题词 肝肿瘤/药物疗法；阿霉素/治疗/用；阿霉素/代谢；阿霉素/药理学；疾病模型，动物
陈江浩, 王执民, 吴道澄, 徐山淡, 陈海微, 文爱东.肝动脉灌注阿霉素毫微粒在荷肝瘤鼠体内的药物分布及药效研究.
华人消化杂志,1998;6(12):1048-1051
0 引言
近年来临床实践证实，经导管动脉化疗(TAC)可明显改善中晚期肝癌(HCC)患者的生存质量，其机制在于：TAC较静脉给药显著提高了肝脏的药物分布. 毫微粒(nanoparticles)是一类由天然或合成高分子材料制成的纳米级固态胶体载药微粒，实验表明其在动物体内的分布有明显的靶向性，主要集中于网状内皮系统如肝、脾等. 因此，从理论上分析，TAC与毫微粒技术相结合应可在HCC的治疗中取得良好的协同作用. 为此，我们研制出阿霉素毫微粒(adriamycin-loaded nanoparticles， NADM)并对其经肝动脉灌注后在荷肝瘤鼠体内的药物分布及抗癌效果进行了研究.
1 材料和方法
1.1 材料 NADM的制备及检测：NADM为我科与学校化学教研室以α-聚氰基丙烯酸正丁酯为载体材料，采用经改进的界面聚合法制备，外观呈橙红色半透明状胶体溶液，透射电镜显示呈圆整规则球形微粒，大小均匀，分散良好(图1). 粒径分布22nm～130nm，平均粒径93nm±12nm. 荧光比色法测定包封率82.6%，载药量40.9%，存放3mo渗漏率小于3%. 动物肝癌模型的建立及分组：SD纯系大白鼠90只，220g～250g，♂，学校实验动物中心提供. 大鼠Walker-256瘤株，购自上海医药工业研究院. 全部大鼠依文献[1] 法建立移植性肝癌模型并随机分为6组，每组15只，其中2组供药物分布研究，4组供药效研究.
1.2 方法 给药方法：于种瘤后7d行动脉灌注. 麻醉、消毒后剖腹，暴露肝脏. 手术显微镜下以自制导管经胃十二指肠动脉行肝固有动脉插管，药物分布组分别注射游离阿霉素(FADM)和NADM，药效组分别注射生理盐水(NS)，FADM，阿霉素加空白毫微粒(ADM+NP)和NADM. 药物剂量2mg/kg，药物浓度均为1.0g/L. 药物分布研究：药物分布组于给药后1，5，15h各处死大鼠5只，分别提取血浆1.0mL，肝、心、脾、肺、肾、肝肿瘤组织样品各1.0g，采用反相高效液相色谱荧光检测法(RP-HPLC)测定药物浓度[2]，色谱条件：流动相为甲醇-0.01mol/L磷酸二氢铵-冰醋酸(70∶30∶0.5)混合液，流速1.0mL/min，激发波长450nm，发射波长530nm、室温.药效研究：根据下列指标进行疗效判定. A. 肿瘤生长率：于治疗后7d再次开腹，测取肿瘤长径(a)和短径(b)；计算肿瘤体积V=a·b2/2，再求得肿瘤生长率%G=V治疗后/V治疗前. B.肿瘤坏死范围：各组随机取7只大鼠，于给药后7d处死，完整切取瘤块及周围组织，置100mL/L福尔马林液中固定，取瘤体最大剖面作2～3处病理切片，HE染色，光镜下根据坏死组织所占比例分为轻度(0%～30%)、中度(30%～70%)及重度(70%～100%). C.生命延长率：记录各组所余8只大鼠治疗后的生存天数，以NS组为对照组计算生命延长率%ILS=治疗组平均存活天数/对照组平均存活天数.
2 结果
2.1 体内药物分布 给药后1，5，15h NADM组大鼠肝、脾、肝肿瘤中ADM浓度均显著高于FADM组(P<0.01，表1)，而血浆、心、肺中ADM浓度显著降低(P<0.01). 肾组织中ADM浓度1，5h以FADM组为高(分别为P<0.05，P<0.01)，但15h时两组间无显著差别(P>0.05). 给药后1，5h以NADM组大鼠的肝肿瘤药物浓度为最高(分别为20.64μg/g，8.84μg/g)，而15h时以肝脏药物浓度为最高(5.05μg/g)，肝肿瘤药物浓度下降快于肝脏. 心脏1，5，15h时NADM组平均药物浓度分别为0.16μg/g，0.07μg/g，0.03μg/g，均显著低于FADM组，且均为NADM组中最低浓度值.
2.2 药效学
2.2.1 肿瘤体积及肿瘤生长率 治疗前各组间肿瘤体积无显著性差异(P>0.05)，治疗后NS组肿瘤增长显著，部分大鼠出现转移瘤灶或与周围组织粘连. FADM及ADM+NP组肿瘤增长显著减缓(P<0.01，表2)，但二者间比较无明显统计学差异(P>0.05). NADM组肿瘤生长率又显著低于FADM，ADM+NP组(P<0.01)，无转移或粘连发生.
表1 肝动脉注射FADM和NADM后1，5，15h大鼠体内药物分布(μg/g,x±s,n=5)
△血浆的药物浓度单位为mg/L. aP<0.05，bP<0.01，vs FADM组.
表2 大鼠NADM治疗前后肿瘤体积及平均肿瘤生长率(x±s)
bP<0.01，vs NS组；dP<0.01，vs FADM，ADM+NP组.
2.2.2 肿瘤坏死范围 大鼠肝肿瘤组织坏死范围见表3. 镜下见NS组肿瘤细胞增生活跃，核分裂相多见，瘤组织中心可见少量瘤细胞变性坏死，周边有不同程度假包膜形成. FADM及ADM+NP组核分裂数减少，瘤组织以中、重度坏死为主，瘤周可见炎性细胞浸润. NADM组以重度坏死为主，其中完全坏死2例(图2～4).
表3 大鼠NADM治疗后肿瘤坏死程度
*完全坏死2例.
2.2.3 生命延长率 FADM，ADM+NP以及NADM组动物平均生存天数较NS组均显著延长(均为P<0.01，表4)，而NADM组又显著长于FADM，ADM+NP组(P<0.05).
表4 大鼠NADM治疗后平均生存期及生命延长率(%)(x±s)
bP<0.01，vs NS组；cP<0.05，vs FADM，ADM+NP组.
图1 阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯毫微粒的电镜照片. ×30000
图2 生理盐水组，瘤细胞增生活跃. HE×200
图3 游离阿霉素组，肿瘤半数坏死. HE×200
图4 阿霉素毫微粒组，大部分瘤细胞死亡. HE×100
3 讨论
毫微粒是以天然或合成高分子为载体，利用聚合反应制成的固态胶体微粒，大小为10nm～1000nm. 大量实验表明，毫微粒作为药物载体具有低毒、稳定、生物相容性好、免疫原性小、可生物降解等特点，并具有一定的缓释和组织靶向功能，毫微粒运载化疗药用于载瘤动物模型可提高疗效并减轻药物毒副作用[3，4]. 本实验中最令人感兴趣的发现是NADM大大增加了药物在肿瘤组织的分布. 我们分析毫微粒肝肿瘤靶向行为的机制在于：①本实验中采用大鼠W256移植性肝癌模型，其肿瘤血供以肝动脉为主，门脉不参与或仅参与瘤灶外缘的部分营养(类似于人类HCC血供情况)[5]，而正常肝组织的血供以门脉为主，因此，NADM从肝动脉灌注后，将主要经过肿瘤组织. ②药代动力学研究表明，采用动脉途径给药时，药物表现出明显的首过效应，其靶器官分布量显著高于静脉给药方式，这也是介入治疗学的理论基础[6]. ③HCC恶性程度极高，瘤区内血管快速增生，血供丰富，血流量大，对药物产生“虹吸”作用. ④瘤区血管迂曲紊乱且粗细不均，血流缓慢，NADM易于停留. ⑤瘤组织中残存的Kupffer细胞对NADM的吞噬. ⑥载药毫微粒表面的粘附性及小的粒径，增加了药物与瘤血管壁的接触时间与接触面积. ⑦毫微粒有助于药物透过血管壁，增加药物的血管外分布[7]. ⑧毫微粒改变了ADM的消除动力学. 曾有报道，FADM的消除T1/2是23.7h±7.7h，而NADM的消除T1/2延长为85.9h±19.2h[8]. ⑨毫微粒对实体瘤有一定的靶向性，如：Reszka et al[9]将NADM静脉注射于荷B16黑素瘤小鼠，1h后测得NADM组平均药物浓度为1.25μg/g，而FADM组仅为 0.09μg/g. 对骨肉瘤、神经胶质瘤的研究也取得了相似的结果[10，11]. ⑩毫微筛谋淠ぷ嘶疲增加瘤细胞乃至耐药瘤细胞内的药物积聚[8，12]. B11Chiannilkulchai[13]用透射电镜检查发现肝脏对NADM具有强大的摄取能力，成为有效的药物贮库；降解的NADM不断释放游离药物，形成局部药物浓度梯度，促使ADM向肿瘤组织弥散. 我们在实验中发现，瘤组织中药物浓度下降速度明显快于肝脏，其原因可能在于药物的再分布，因此，这种“药物贮库”机制可能在后期起到主要作用.
此外，本实验进一步证实了毫微粒对网状内皮系统，特别是对肝、脾的靶向作用. 同时，毫微粒减少了药物在心脏的分布，从而增加了使用安全性. Verdun et al[4]采用静脉给药途径亦取得了相似的结果.
药效学研究发现，NADM的疗效明显强于FADM，毫微粒运载其他种类抗癌药的疗效研究中也取得了相似的结果[3]. 我们认为主要原因在于NADM改变了药物的体内分布特征，使肿瘤局部的ADM浓度明显增高. 此外，毫微粒还有助于克服瘤组织耐药性[12]，以及大大减轻了药物的心脏毒性. 总之，毫微粒是一类具有开发、应用前景的新型药物载体，可望在肝癌的临床介入治疗中发挥巨大作用.
4 参考文献
1 杨继金，朱永法，左长京，刘崎，田建民，王振堂. 大白鼠转移性肝癌模型的制作. 中华放射学杂志，1993；27(1)：122-123
2 何素梅，魏树礼，吴传斌，王培玉，卢炜. 反相高效液相色谱荧光检测法测定血浆或肝组织中阿霉素含量.
药物分析杂志，1994；14(1)：8-11
3 Sharma D, Chelvi TP, Kaur J, Chakravorty K, De TK, Maitra A .et al. Novel Taxol formulation:
polyvinylpyrrolidone nanoparticleencapsulated Taxol for drug delivery in cancer therapy. Oncol Res,1996;8(7-8):281-286
4 Verdun C, Brasseur F, Vranckx H, Couvreur P, Roland M. Tissue distribution of doxorubicin associated with
polyisohexylcyanoacrylate nanoparticles. Cancer Chemother Pharmacol, 1990;26(1):13-18
5 曾蒙苏，张宏伟，周康荣，陆宏祺，严惠芳. 供影像学诊断实验的大鼠移植肝癌模型的可行性研究.
临床放射学杂志，1996；15(1)：56-59
6 Fety R, Lucas C, Solere P. Hepatic intra arterial infusion of fotemustine: pharmacokinetics.
Cancer Chemother Pharmacol,1992;31(1):118-122
7 Andrieu V, Fessi H, Dubrasquet M, Devissaguet JP, Puisieux F, Benita S et al. Pharmacokinetic evaluation of
indomethacin nanocapsules. Drug Des Deliv, 1989;4(4):295-302
8 Astier A, Doat B, Ferrer MJ, Benoit G, Fleury J, Rolland A et al.Enhancement of adriamycin antitumor activity by its binding with
an intracellular sustained release form polymethacrylate nanospheres, in U937 cells. Cancer Res, 1988;48(7):1835-1841
9 Reszka R, Beck P, Fichtner I, Hentschel M, Richter J, Kreuter J. Body distribution of free, liposomal and nanoparticle
associated mitoxantrone in B16 melanoma bearing mice. J Pharmacol Exp Ther, 1997;280(1):232-237
10 Zimmer C, Weissleder R, Poss K, Bogdanova A, Wright SC, Enochs WS. MR imaging of phagocytosis in experimental
gliomas. Radiology,1995;197(2):533-538
11 de Verdiere AC, Dubernet C, Nemati F, Soma E, Appel M, Ferte J et al.Reversion of multidrug resistance with
polyalkylcyanoacrylate nanoparticles: towards a mechanism of action. Br J Cancer, 1997;76(2):198-205
12 Gipps EM, Arshady R, Kreuter J, Speiser PP. Distribution of polyhexylcyanoacrylate nanoparticles in nude mice bearing
human osteosarcoma. J Pharm Sci,1986;75(2):256-263
13 Chiannilkulchai N, Ammoury N, Caillou B, Devissaguet JP, Couvreur P. Hepatic tissue distribution of doxorubicinloaded
nanoparticles after i.v. administrati on in reticulosarcoma M5076 metastasis bearing mice.
Cancer Chemother Pharmacol,1990;26(2):122-126, 百拇医药(陈江浩1 王执民1 吴道澄2 徐山淡1 陈海微3 文爱东4)
陈江浩，男，1972-10-29生，陕西省宝鸡市人，汉族. 1995年第四军医大学医疗系毕业，1998年第四军医大学硕士研究生毕业，主要从事肿瘤的介入治疗研究，发表论文3篇.
项目负责人 陈江浩，710038，陕西省西安市，第四军医大学唐都医院介入放射科.
Correspondence to Jiang-Hao Chen, Department of Interventional Radiology, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710038, Shaanxi Province, China
Tel. +86·29·3510595-77154
收稿日期 1998-06-29
Drug distribution and therapeutic effect of nanoparticle-associated adriamycin injected into
hepatic artery of hepatoma-bearing rats
Jiang-Hao Chen1, Zhi-Min Wang1, Dao-Cheng Wu2, Shan-Dan Xu1, Hai-Wei Chen3 and Ai-Dong Wen4
1Department of Interventional Radiology, Tangdu Hospital,2Departments of Chemistry, and 3Microbiology, Faculty of Preclinical Medicine,
4Department of Pharmacy, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710038, Shaanxi Province, China
Abstract
AIM To investigate the drug distribution and therapeutic effect of nanoparticle-associated adriamycin (NADM) after perfusion into the hepatic artery of hepatoma-bearing rats.
METHODS Walker-256 (W256) carcinosarcoma cells were surgically implanted into the left liver lobe of 90 male SD rats, which were divided into 6 groups at random, with 15 rats for each group. NADM and free adriamycin (FADM) were injected into the hepatic artery of animals on the 7th day after the tumor inoculation. The dose of adriamycin in each formulation was 2mg/kg body weight, and the concentration was 1.0g/L. At 1, 5 and 15 hours after drug administration, 5 animals in each group were sacrificed and the adriamycin concentrations in the plasma, liver, heart, spleen, lungs, kidneys, and tumor were determined by using a reverse phase high performance liquid chromatography with fluorescence detector (RP-HPLC) technique. Normal saline (NS), FADM, adriamycin mixed with unloaded nanoparticles (ADM+NP), and NADM were injected into the remaining 4 groups.
RESULTS NADM increased the adriamycin concentrations significantly in the liver, spleen and tumor of rats at 1, 5, and 15 hours after injection (P<0.01), as compared to FADM, whereas the concentrations in the plasma, heart and lungs were markedly decreased (P<0.01). The survival time was significantly prolonged in animals receiving NADM (P<0.01), the tumor growth inhibition was more remarkable (P<0.01) and necrosis was more extensive as compared with those treated with FADM or ADM+NP.
CONCLUSION The in vivo distribution of adriamycin could be modified by its encapsulation in nanoparticles and administration via the hepatic artery, and the tumor has a higher drug concentration. NADM was more effective in the treatment of hepatoma as compared with ADM and ADM+NP.
Subject headings liver neoplasms/drug therapy; adriamycin/therapeutic use; adriamycin/metabolism;
adriamycin/pharmacology; disease models, animal
Chen JH, Wang ZM, Wu DC, Xu SD, Chen HW, Wen AD. Drug distribution and therapeutic effect of nanoparticle-associated adriamycin injected into hepatic artery of hepatoma-bearing rats. Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(12):1048-1051
摘要
目的 研究阿霉素毫微粒(NADM)经肝动脉灌注后在荷肝肿瘤鼠体内的药物分布与药效.
方法 SD纯系大鼠90只，建立W256移植性肝癌模型并随机分为6组，每组15只动物，其中2组供药物分布研究，4组供药效研究. 药物分布组经肝动脉以2mg/kg药物剂量分别注入NADM与游离阿霉素(FADM)，每组于给药后1，5，15h各处死5只大鼠，分别提取血浆、肝、心、脾、肺、肾、肝肿瘤样品，采用反相高效液相色谱荧光检测法测定药物浓度；药效组经肝动脉分别灌注生理盐水(NS)，FADM、阿霉素加空白毫微粒(ADM+NP)和NADM.
结果 给药后1，5，15h时NADM组大鼠肝、脾、肝肿瘤中阿霉素浓度均显著高于FADM组(P<0.01)，而血浆、心、肺中阿霉素浓度则显著降低(P<0.01). 与FADM及ADM+NP组相比，经NADM治疗的大鼠生存期显著延长(P<0.01)，对肿瘤生长的抑制更为明显(P<0.01)，肿瘤坏死更广泛，更彻底.
结论 NADM经肝动脉给药后改变了阿霉素的体内分布特征，对肝肿瘤表现出明显的靶向性，并显著提高阿霉素的疗效.
主题词 肝肿瘤/药物疗法；阿霉素/治疗/用；阿霉素/代谢；阿霉素/药理学；疾病模型，动物
陈江浩, 王执民, 吴道澄, 徐山淡, 陈海微, 文爱东.肝动脉灌注阿霉素毫微粒在荷肝瘤鼠体内的药物分布及药效研究.
华人消化杂志,1998;6(12):1048-1051
0 引言
近年来临床实践证实，经导管动脉化疗(TAC)可明显改善中晚期肝癌(HCC)患者的生存质量，其机制在于：TAC较静脉给药显著提高了肝脏的药物分布. 毫微粒(nanoparticles)是一类由天然或合成高分子材料制成的纳米级固态胶体载药微粒，实验表明其在动物体内的分布有明显的靶向性，主要集中于网状内皮系统如肝、脾等. 因此，从理论上分析，TAC与毫微粒技术相结合应可在HCC的治疗中取得良好的协同作用. 为此，我们研制出阿霉素毫微粒(adriamycin-loaded nanoparticles， NADM)并对其经肝动脉灌注后在荷肝瘤鼠体内的药物分布及抗癌效果进行了研究.
1 材料和方法
1.1 材料 NADM的制备及检测：NADM为我科与学校化学教研室以α-聚氰基丙烯酸正丁酯为载体材料，采用经改进的界面聚合法制备，外观呈橙红色半透明状胶体溶液，透射电镜显示呈圆整规则球形微粒，大小均匀，分散良好(图1). 粒径分布22nm～130nm，平均粒径93nm±12nm. 荧光比色法测定包封率82.6%，载药量40.9%，存放3mo渗漏率小于3%. 动物肝癌模型的建立及分组：SD纯系大白鼠90只，220g～250g，♂，学校实验动物中心提供. 大鼠Walker-256瘤株，购自上海医药工业研究院. 全部大鼠依文献[1] 法建立移植性肝癌模型并随机分为6组，每组15只，其中2组供药物分布研究，4组供药效研究.
1.2 方法 给药方法：于种瘤后7d行动脉灌注. 麻醉、消毒后剖腹，暴露肝脏. 手术显微镜下以自制导管经胃十二指肠动脉行肝固有动脉插管，药物分布组分别注射游离阿霉素(FADM)和NADM，药效组分别注射生理盐水(NS)，FADM，阿霉素加空白毫微粒(ADM+NP)和NADM. 药物剂量2mg/kg，药物浓度均为1.0g/L. 药物分布研究：药物分布组于给药后1，5，15h各处死大鼠5只，分别提取血浆1.0mL，肝、心、脾、肺、肾、肝肿瘤组织样品各1.0g，采用反相高效液相色谱荧光检测法(RP-HPLC)测定药物浓度[2]，色谱条件：流动相为甲醇-0.01mol/L磷酸二氢铵-冰醋酸(70∶30∶0.5)混合液，流速1.0mL/min，激发波长450nm，发射波长530nm、室温.药效研究：根据下列指标进行疗效判定. A. 肿瘤生长率：于治疗后7d再次开腹，测取肿瘤长径(a)和短径(b)；计算肿瘤体积V=a·b2/2，再求得肿瘤生长率%G=V治疗后/V治疗前. B.肿瘤坏死范围：各组随机取7只大鼠，于给药后7d处死，完整切取瘤块及周围组织，置100mL/L福尔马林液中固定，取瘤体最大剖面作2～3处病理切片，HE染色，光镜下根据坏死组织所占比例分为轻度(0%～30%)、中度(30%～70%)及重度(70%～100%). C.生命延长率：记录各组所余8只大鼠治疗后的生存天数，以NS组为对照组计算生命延长率%ILS=治疗组平均存活天数/对照组平均存活天数.
2 结果
2.1 体内药物分布 给药后1，5，15h NADM组大鼠肝、脾、肝肿瘤中ADM浓度均显著高于FADM组(P<0.01，表1)，而血浆、心、肺中ADM浓度显著降低(P<0.01). 肾组织中ADM浓度1，5h以FADM组为高(分别为P<0.05，P<0.01)，但15h时两组间无显著差别(P>0.05). 给药后1，5h以NADM组大鼠的肝肿瘤药物浓度为最高(分别为20.64μg/g，8.84μg/g)，而15h时以肝脏药物浓度为最高(5.05μg/g)，肝肿瘤药物浓度下降快于肝脏. 心脏1，5，15h时NADM组平均药物浓度分别为0.16μg/g，0.07μg/g，0.03μg/g，均显著低于FADM组，且均为NADM组中最低浓度值.
2.2 药效学
2.2.1 肿瘤体积及肿瘤生长率 治疗前各组间肿瘤体积无显著性差异(P>0.05)，治疗后NS组肿瘤增长显著，部分大鼠出现转移瘤灶或与周围组织粘连. FADM及ADM+NP组肿瘤增长显著减缓(P<0.01，表2)，但二者间比较无明显统计学差异(P>0.05). NADM组肿瘤生长率又显著低于FADM，ADM+NP组(P<0.01)，无转移或粘连发生.
表1 肝动脉注射FADM和NADM后1，5，15h大鼠体内药物分布(μg/g,x±s,n=5)
| 1h | 5h | 15h | ||||
| FADM | NADM | FADM | NADM | FADM | NADM | |
| 血浆△ | 1.27±0.32 | 0.38±0.19b | 0.58±0.21 | 0.22±0.08b | 0.23±0.03 | 0.14±0.04b |
| 心 | 0.57±0.20 | 0.16±0.05b | 0.40±0.11 | 0.07±0.03b | 0.12±0.06 | 0.03±0.01b |
| 肝 | 1.87±0.32 | 15.32±3.08b | 0.86±0.27 | 8.37±2.95b | 0.40±0.20 | 5.05±1.45b |
| 脾 | 1.35±0.28 | 8.64±1.82b | 0.70±0.32 | 5.24±2.35b | 0.31±0.09 | 2.34±0.74b |
| 肺 | 1.56±0.50 | 0.63±0.28b | 1.12±0.49 | 0.33±0.16b | 0.47±0.16 | 0.18±0.08b |
| 肾 | 1.84±0.66 | 0.83±0.21a | 1.30±0.49 | 0.51±0.18b | 0.49±0.21 | 0.31±0.14 |
| 肿瘤 | 2.25±1.15 | 20.64±5.41b | 1.39±0.62 | 8.84±3.94b | 0.45±0.17 | 3.82±1.08b |
△血浆的药物浓度单位为mg/L. aP<0.05，bP<0.01，vs FADM组.
表2 大鼠NADM治疗前后肿瘤体积及平均肿瘤生长率(x±s)
| 组别 | 体积(cm3) | 肿瘤生长率 | |
| 治疗前 | 治疗后 | ||
| NS | 0.086±0.049 | 2.521±0.840 | 31.550±7.975 |
| FADM | 0.083±0.035 | 0.149±0.072 | 1.883±0.708b |
| ADM+NP | 0.079±0.036 | 0.161±0.105 | 1.896±0.565b |
| NADM | 0.079±0.033 | 0.087±0.038 | 1.106±0.275d |
bP<0.01，vs NS组；dP<0.01，vs FADM，ADM+NP组.
2.2.2 肿瘤坏死范围 大鼠肝肿瘤组织坏死范围见表3. 镜下见NS组肿瘤细胞增生活跃，核分裂相多见，瘤组织中心可见少量瘤细胞变性坏死，周边有不同程度假包膜形成. FADM及ADM+NP组核分裂数减少，瘤组织以中、重度坏死为主，瘤周可见炎性细胞浸润. NADM组以重度坏死为主，其中完全坏死2例(图2～4).
表3 大鼠NADM治疗后肿瘤坏死程度
| 分级 | NS | FADM | ADM+NP | NADM |
| 轻 | 6 | 2 | 1 | 0 |
| 中 | 1 | 3 | 5 | 2 |
| 重 | 0 | 2 | 1 | 5 |
*完全坏死2例.
2.2.3 生命延长率 FADM，ADM+NP以及NADM组动物平均生存天数较NS组均显著延长(均为P<0.01，表4)，而NADM组又显著长于FADM，ADM+NP组(P<0.05).
表4 大鼠NADM治疗后平均生存期及生命延长率(%)(x±s)
| 组别 | 平均生存期(d) | 生命延长率 |
| NS | 11.88±2.80 | — |
| FADM | 20.75±6.34 | 74.66b |
| ADM+NP | 19.13±5.75 | 61.03c |
| NADM | 32.50±12.97 | 173.57d |
bP<0.01，vs NS组；cP<0.05，vs FADM，ADM+NP组.
图1 阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯毫微粒的电镜照片. ×30000
图2 生理盐水组，瘤细胞增生活跃. HE×200
图3 游离阿霉素组，肿瘤半数坏死. HE×200
图4 阿霉素毫微粒组，大部分瘤细胞死亡. HE×100
3 讨论
毫微粒是以天然或合成高分子为载体，利用聚合反应制成的固态胶体微粒，大小为10nm～1000nm. 大量实验表明，毫微粒作为药物载体具有低毒、稳定、生物相容性好、免疫原性小、可生物降解等特点，并具有一定的缓释和组织靶向功能，毫微粒运载化疗药用于载瘤动物模型可提高疗效并减轻药物毒副作用[3，4]. 本实验中最令人感兴趣的发现是NADM大大增加了药物在肿瘤组织的分布. 我们分析毫微粒肝肿瘤靶向行为的机制在于：①本实验中采用大鼠W256移植性肝癌模型，其肿瘤血供以肝动脉为主，门脉不参与或仅参与瘤灶外缘的部分营养(类似于人类HCC血供情况)[5]，而正常肝组织的血供以门脉为主，因此，NADM从肝动脉灌注后，将主要经过肿瘤组织. ②药代动力学研究表明，采用动脉途径给药时，药物表现出明显的首过效应，其靶器官分布量显著高于静脉给药方式，这也是介入治疗学的理论基础[6]. ③HCC恶性程度极高，瘤区内血管快速增生，血供丰富，血流量大，对药物产生“虹吸”作用. ④瘤区血管迂曲紊乱且粗细不均，血流缓慢，NADM易于停留. ⑤瘤组织中残存的Kupffer细胞对NADM的吞噬. ⑥载药毫微粒表面的粘附性及小的粒径，增加了药物与瘤血管壁的接触时间与接触面积. ⑦毫微粒有助于药物透过血管壁，增加药物的血管外分布[7]. ⑧毫微粒改变了ADM的消除动力学. 曾有报道，FADM的消除T1/2是23.7h±7.7h，而NADM的消除T1/2延长为85.9h±19.2h[8]. ⑨毫微粒对实体瘤有一定的靶向性，如：Reszka et al[9]将NADM静脉注射于荷B16黑素瘤小鼠，1h后测得NADM组平均药物浓度为1.25μg/g，而FADM组仅为 0.09μg/g. 对骨肉瘤、神经胶质瘤的研究也取得了相似的结果[10，11]. ⑩毫微筛谋淠ぷ嘶疲增加瘤细胞乃至耐药瘤细胞内的药物积聚[8，12]. B11Chiannilkulchai[13]用透射电镜检查发现肝脏对NADM具有强大的摄取能力，成为有效的药物贮库；降解的NADM不断释放游离药物，形成局部药物浓度梯度，促使ADM向肿瘤组织弥散. 我们在实验中发现，瘤组织中药物浓度下降速度明显快于肝脏，其原因可能在于药物的再分布，因此，这种“药物贮库”机制可能在后期起到主要作用.
此外，本实验进一步证实了毫微粒对网状内皮系统，特别是对肝、脾的靶向作用. 同时，毫微粒减少了药物在心脏的分布，从而增加了使用安全性. Verdun et al[4]采用静脉给药途径亦取得了相似的结果.
药效学研究发现，NADM的疗效明显强于FADM，毫微粒运载其他种类抗癌药的疗效研究中也取得了相似的结果[3]. 我们认为主要原因在于NADM改变了药物的体内分布特征，使肿瘤局部的ADM浓度明显增高. 此外，毫微粒还有助于克服瘤组织耐药性[12]，以及大大减轻了药物的心脏毒性. 总之，毫微粒是一类具有开发、应用前景的新型药物载体，可望在肝癌的临床介入治疗中发挥巨大作用.
4 参考文献
1 杨继金，朱永法，左长京，刘崎，田建民，王振堂. 大白鼠转移性肝癌模型的制作. 中华放射学杂志，1993；27(1)：122-123
2 何素梅，魏树礼，吴传斌，王培玉，卢炜. 反相高效液相色谱荧光检测法测定血浆或肝组织中阿霉素含量.
药物分析杂志，1994；14(1)：8-11
3 Sharma D, Chelvi TP, Kaur J, Chakravorty K, De TK, Maitra A .et al. Novel Taxol formulation:
polyvinylpyrrolidone nanoparticleencapsulated Taxol for drug delivery in cancer therapy. Oncol Res,1996;8(7-8):281-286
4 Verdun C, Brasseur F, Vranckx H, Couvreur P, Roland M. Tissue distribution of doxorubicin associated with
polyisohexylcyanoacrylate nanoparticles. Cancer Chemother Pharmacol, 1990;26(1):13-18
5 曾蒙苏，张宏伟，周康荣，陆宏祺，严惠芳. 供影像学诊断实验的大鼠移植肝癌模型的可行性研究.
临床放射学杂志，1996；15(1)：56-59
6 Fety R, Lucas C, Solere P. Hepatic intra arterial infusion of fotemustine: pharmacokinetics.
Cancer Chemother Pharmacol,1992;31(1):118-122
7 Andrieu V, Fessi H, Dubrasquet M, Devissaguet JP, Puisieux F, Benita S et al. Pharmacokinetic evaluation of
indomethacin nanocapsules. Drug Des Deliv, 1989;4(4):295-302
8 Astier A, Doat B, Ferrer MJ, Benoit G, Fleury J, Rolland A et al.Enhancement of adriamycin antitumor activity by its binding with
an intracellular sustained release form polymethacrylate nanospheres, in U937 cells. Cancer Res, 1988;48(7):1835-1841
9 Reszka R, Beck P, Fichtner I, Hentschel M, Richter J, Kreuter J. Body distribution of free, liposomal and nanoparticle
associated mitoxantrone in B16 melanoma bearing mice. J Pharmacol Exp Ther, 1997;280(1):232-237
10 Zimmer C, Weissleder R, Poss K, Bogdanova A, Wright SC, Enochs WS. MR imaging of phagocytosis in experimental
gliomas. Radiology,1995;197(2):533-538
11 de Verdiere AC, Dubernet C, Nemati F, Soma E, Appel M, Ferte J et al.Reversion of multidrug resistance with
polyalkylcyanoacrylate nanoparticles: towards a mechanism of action. Br J Cancer, 1997;76(2):198-205
12 Gipps EM, Arshady R, Kreuter J, Speiser PP. Distribution of polyhexylcyanoacrylate nanoparticles in nude mice bearing
human osteosarcoma. J Pharm Sci,1986;75(2):256-263
13 Chiannilkulchai N, Ammoury N, Caillou B, Devissaguet JP, Couvreur P. Hepatic tissue distribution of doxorubicinloaded
nanoparticles after i.v. administrati on in reticulosarcoma M5076 metastasis bearing mice.
Cancer Chemother Pharmacol,1990;26(2):122-126, 百拇医药(陈江浩1 王执民1 吴道澄2 徐山淡1 陈海微3 文爱东4)