KAI 1基因在肝癌组织中表达的研究
黑龙江省大庆油田总医院 1内科 2检验科 3药检室4外科 5中医科 163001
项目负责人 陈克林黑龙江省大庆油田总医院内科 163001
收稿日期 1998-07-28
Subject headings liver neoplasms; KAI 1 gene; gene expression; neoplasm metastasis
主题词 肝肿瘤；KAI 1基因；基因表达；肿瘤转移
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肝癌是常见的恶性肿瘤之一，早期发生血行转移是其主要特点. KAI1基因是1995年报道的抑制肿瘤转移的基因，位于人的第11条染色体的p11.2～13区域，其cDNA长2.4kb. KAI1基因在前列腺癌组织的表达下降，已证实其具有抑制人前列腺癌转移的作用[1]. 而在其他肿瘤中的表达情况及作用尚不清楚. 本文用Nouthern杂交方法对KAI1基因在易发生转移的肝癌组织中的表达进行了分析.
1 材料和方法
1.1 实验对象 ①正常肝脏组织标本. ②肝癌患者手术切除的肝癌组织块，且均经病理证实.
1.2 标本总RNA的提取[2]采用非超离心一步法.
, 百拇医药
1.3 DNA探针制备 载有KAI1基因的cDNA的质粒，由该基因的发现者美国国立卫生研究院董金堂提供. 质粒经转化导入感受态大肠杆菌、扩增、提取、EcoI和XhoI酶切、经低熔点琼脂糖凝胶电泳回收2.4kb片断，作为标记探针的模板. 采用随机引物标记试剂盒，以α-32P-dCTP为标记.
1.4 Nouthern印迹杂交[3] 每份RNA样品经甲醛琼脂糖凝胶变性电泳并转移到尼龙膜. 于42℃预杂交过夜. 然后将已经变性的放射性探针加入预杂交液中，混匀，42℃杂交24h～36h，68℃洗膜，放射自显影(见图1)，最后作密度扫描.
1.5 KAI1杂交结束后，尼龙膜经变性冲洗，去除KAI1探针，再行β-肌动蛋白杂交，作为内部参照标准(见图2).
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2 结果
共检测了7(G1～G7)例患者手术切除的肝癌组织块标本，其中1(G7)例作了癌、癌旁、无肿瘤部位肝组织三个部位的检测. 因KAI1基因在正常肝组织大量表达已被证实，固我们仅检测了1例正常肝组织(G0)作为标准. 以正常肝组织作为对照，以β-肌动蛋白为内部参照标准，计算各肝癌组织标本KAI1基因表达量及降低值，结果见表1(为了说明问题，我们同时采用目前常用的降低百分率和降低倍数二种计算方式). G7以无肿瘤部位肝组织作为对照计算癌和癌旁组织KAI1基因表达量及降低值见表2.
图1 KAI1基因杂交放射自显影结果.A，D为癌组织，B为正常肝组织，C为无肿瘤细胞部位肝组织，E为癌旁组织.
图2 β-肌动蛋白杂交放射自显影结果. A～E顺序同图1.
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表1 肝癌组织标本Nouthern杂交结果
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表2 同一患者(G7)不同部位标本Nouthern杂交结果比较
G正(对照)β-肌动蛋白/KAI1基因-各标本β-肌动蛋白/KAI1基因
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注：降低值(%)= ×100%
G正(对照)β- 肌动蛋白/KAI1基因
G正(对照)β-肌动蛋白/KAI1基因
降低倍数=
各标本β-肌动蛋白/KAI1基因
3 讨论
KAI1基因是应用人特异Alu元素-PCR方法克隆出来的肿瘤转移抑制基因，其表达的蛋白位于细胞膜上，有1个较大的细胞外亲水区域，该区有3个N端糖基化位点，N端连接的寡聚糖的变化同细胞转移表型有关，在细胞膜上位置及在细胞外糖基化位点说明KAI1基因在细胞和细胞之间以及细胞和细胞外基质之间的相互作用上有一定的功能，而这二种作用在肿瘤侵袭和转移中起着重要作用，同时说明该基因与细胞信息传递密切相关. KAI1基因在人的前列腺癌组织表达量比正常前列腺癌组织降低，通过转基因技术证实具有抑制前列腺癌转移的作用，但不影响肿瘤生长[1].
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KAI1基因在正常肝组织中大量表达，但在肝癌组织中表达如何尚不知道. 通过我们的实验，用Nouthern杂交的方法检测，肝癌组织中KAI1基因的表达比正常肝组织降低达27.9%～42.3%(或1.38～1.73倍). 从同一患者看，癌组织和癌旁组织比非肿瘤部位肝组织分别下降了42.9%(1.73倍)、25.7%(1.35倍)，说明肝癌细胞恶性程度越高，KAI1表达水平越低. 因此，我们推测KAI1基因表达降低可能是原发性肝细胞肝癌易发生早期转移的潜在因素之一，即由于这一基因作用下降，肝癌细胞易发生侵袭转移. 但由于检测例数相对较少，尚不能作出统计学上的相关性结论. 且KAI1基因在肝癌组织中低表达是由于基因突变、缺失、或基因调控发生变化，我们尚不知道，因而仅仅研究其表达情况是不够的，以后我们将进一步研究其作用机制和低表达原因.
在实验中，为了减少误差，我们采取了：①保证标本总RNA质量，选取A260/A280大于1.8，且18S和28S两条带完整清晰的标本. ②β-肌动蛋白作为定量内标参照，以调整可能由于加样量多少引起的误差.
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致谢 本文承蒙北京医科大学寇丽筠教授、张捷副教授指导和援助，特此致谢!
4 参考文献
1 Dong JT, Lamb PW, Rinker-Schaefer CW, Vukanovic J, Ichikawa T, Isaacs JT et al. KAI1, a metastasis suppressor gene
for prostate cancer on human chromosome 11p11.2. Science, 1995;268:884-886
2 Simms D, Cizdziel PE, Chomczynski P. TRIzolTM a new reagent for optimal single-step isolation of RNA.
Focus, 1993;15:99-102
3 J. 萨姆布鲁克， E.F.弗里奇， T.曼尼阿蒂斯(美). 分子克隆实验指南. 第2版. 北京：科学技术出版社，1992：362-371, http://www.100md.com(陈克林1 李海华1 李玉梅1 曹秀华2 刘 敏2 崔秀明2 王 浩3 赵祥明4 )
项目负责人 陈克林黑龙江省大庆油田总医院内科 163001
收稿日期 1998-07-28
Subject headings liver neoplasms; KAI 1 gene; gene expression; neoplasm metastasis
主题词 肝肿瘤；KAI 1基因；基因表达；肿瘤转移
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肝癌是常见的恶性肿瘤之一，早期发生血行转移是其主要特点. KAI1基因是1995年报道的抑制肿瘤转移的基因，位于人的第11条染色体的p11.2～13区域，其cDNA长2.4kb. KAI1基因在前列腺癌组织的表达下降，已证实其具有抑制人前列腺癌转移的作用[1]. 而在其他肿瘤中的表达情况及作用尚不清楚. 本文用Nouthern杂交方法对KAI1基因在易发生转移的肝癌组织中的表达进行了分析.
1 材料和方法
1.1 实验对象 ①正常肝脏组织标本. ②肝癌患者手术切除的肝癌组织块，且均经病理证实.
1.2 标本总RNA的提取[2]采用非超离心一步法.
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1.3 DNA探针制备 载有KAI1基因的cDNA的质粒，由该基因的发现者美国国立卫生研究院董金堂提供. 质粒经转化导入感受态大肠杆菌、扩增、提取、EcoI和XhoI酶切、经低熔点琼脂糖凝胶电泳回收2.4kb片断，作为标记探针的模板. 采用随机引物标记试剂盒，以α-32P-dCTP为标记.
1.4 Nouthern印迹杂交[3] 每份RNA样品经甲醛琼脂糖凝胶变性电泳并转移到尼龙膜. 于42℃预杂交过夜. 然后将已经变性的放射性探针加入预杂交液中，混匀，42℃杂交24h～36h，68℃洗膜，放射自显影(见图1)，最后作密度扫描.
1.5 KAI1杂交结束后，尼龙膜经变性冲洗，去除KAI1探针，再行β-肌动蛋白杂交，作为内部参照标准(见图2).
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2 结果
共检测了7(G1～G7)例患者手术切除的肝癌组织块标本，其中1(G7)例作了癌、癌旁、无肿瘤部位肝组织三个部位的检测. 因KAI1基因在正常肝组织大量表达已被证实，固我们仅检测了1例正常肝组织(G0)作为标准. 以正常肝组织作为对照，以β-肌动蛋白为内部参照标准，计算各肝癌组织标本KAI1基因表达量及降低值，结果见表1(为了说明问题，我们同时采用目前常用的降低百分率和降低倍数二种计算方式). G7以无肿瘤部位肝组织作为对照计算癌和癌旁组织KAI1基因表达量及降低值见表2.
图1 KAI1基因杂交放射自显影结果.A，D为癌组织，B为正常肝组织，C为无肿瘤细胞部位肝组织，E为癌旁组织.
图2 β-肌动蛋白杂交放射自显影结果. A～E顺序同图1.
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表1 肝癌组织标本Nouthern杂交结果
| G0(对照) | G1 | G2 | G3 | G4 | G5 | G6 | G7 | |
| 1.KAI1基因(IOD) | 887.1 | 528.1 | 599.4 | 545.9 | 672 | 521.4 | 491.3 | 542.3 |
| 2.β-肌动蛋白 | 1337.4 | 1209 | 1311.2 | 1327.3 | 1421.7 | 1377.4 | 1286.5 | 1430.8 |
| 3.降低值(%) | — | 33.4 | 30.3 | 36.3 | 27.9 | 42.3 | 41.8 | 42.2 |
| 降低倍数 | — | 1.50 | 1.43 | 1.59 | 1.38 | 1.73 | 1.72 | 1.73 |
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表2 同一患者(G7)不同部位标本Nouthern杂交结果比较
| G7癌 | G7癌旁 | G7正常 | |
| 1.KAI1基因(IOD) | 542.3 | 789.1 | 899.4 |
| 2.β-肌动蛋白 | 1430.8 | 1597.5 | 1353.1 |
| 3.降低值(%) | 42.9 | 25.7 | — |
| 4.降低倍数 | 1.75 | 1.35 | — |
G正(对照)β-肌动蛋白/KAI1基因-各标本β-肌动蛋白/KAI1基因
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注：降低值(%)= ×100%
G正(对照)β- 肌动蛋白/KAI1基因
G正(对照)β-肌动蛋白/KAI1基因
降低倍数=
各标本β-肌动蛋白/KAI1基因
3 讨论
KAI1基因是应用人特异Alu元素-PCR方法克隆出来的肿瘤转移抑制基因，其表达的蛋白位于细胞膜上，有1个较大的细胞外亲水区域，该区有3个N端糖基化位点，N端连接的寡聚糖的变化同细胞转移表型有关，在细胞膜上位置及在细胞外糖基化位点说明KAI1基因在细胞和细胞之间以及细胞和细胞外基质之间的相互作用上有一定的功能，而这二种作用在肿瘤侵袭和转移中起着重要作用，同时说明该基因与细胞信息传递密切相关. KAI1基因在人的前列腺癌组织表达量比正常前列腺癌组织降低，通过转基因技术证实具有抑制前列腺癌转移的作用，但不影响肿瘤生长[1].
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KAI1基因在正常肝组织中大量表达，但在肝癌组织中表达如何尚不知道. 通过我们的实验，用Nouthern杂交的方法检测，肝癌组织中KAI1基因的表达比正常肝组织降低达27.9%～42.3%(或1.38～1.73倍). 从同一患者看，癌组织和癌旁组织比非肿瘤部位肝组织分别下降了42.9%(1.73倍)、25.7%(1.35倍)，说明肝癌细胞恶性程度越高，KAI1表达水平越低. 因此，我们推测KAI1基因表达降低可能是原发性肝细胞肝癌易发生早期转移的潜在因素之一，即由于这一基因作用下降，肝癌细胞易发生侵袭转移. 但由于检测例数相对较少，尚不能作出统计学上的相关性结论. 且KAI1基因在肝癌组织中低表达是由于基因突变、缺失、或基因调控发生变化，我们尚不知道，因而仅仅研究其表达情况是不够的，以后我们将进一步研究其作用机制和低表达原因.
在实验中，为了减少误差，我们采取了：①保证标本总RNA质量，选取A260/A280大于1.8，且18S和28S两条带完整清晰的标本. ②β-肌动蛋白作为定量内标参照，以调整可能由于加样量多少引起的误差.
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致谢 本文承蒙北京医科大学寇丽筠教授、张捷副教授指导和援助，特此致谢!
4 参考文献
1 Dong JT, Lamb PW, Rinker-Schaefer CW, Vukanovic J, Ichikawa T, Isaacs JT et al. KAI1, a metastasis suppressor gene
for prostate cancer on human chromosome 11p11.2. Science, 1995;268:884-886
2 Simms D, Cizdziel PE, Chomczynski P. TRIzolTM a new reagent for optimal single-step isolation of RNA.
Focus, 1993;15:99-102
3 J. 萨姆布鲁克， E.F.弗里奇， T.曼尼阿蒂斯(美). 分子克隆实验指南. 第2版. 北京：科学技术出版社，1992：362-371, http://www.100md.com(陈克林1 李海华1 李玉梅1 曹秀华2 刘 敏2 崔秀明2 王 浩3 赵祥明4 )