外周血单核细胞中丙型肝炎病毒RNA正负链检测的临床意义
中国医科大学附属二院传染科 辽宁省沈阳市 110003
项目负责人 吴海滨，110003，中国医科大学附属二院传染科，辽宁省沈阳市
Correspondence to Hai-Bin Wu, The Second Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110003, Liaoning Province, China
收稿日期 1998-05-15 接收日期 1998-05-29
Clinical significance of detection of positive and negative strands of HCVRNA in peripheral blood mononuclear cells
, 百拇医药
Hai-Bin Wu, Zhi-Wei Li and Ying Li
The Second Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110003, Liaoning Province, China
Abstract
AIM To study the relation of chronic hepatitis C and interferon therapy with the positive and negative strands of HCVRNA in PBMC.
, http://www.100md.com
METHODS Sera and PBMC of forty patients with chronic hepatitis C were separated. HCVRNA was extracted by acid guanidinium thiocyanate-phenon-chloroform. HCVRNA was detected with reverse transcription and polymerase chain reaction.
RESULTS Positive strands of HCVRNA were detected in 67.5 percent of sera and all negative strands in sera were negative. Positive rates of positive and negative strands of HCVRNA in PBMC were 57.5 percent and 35 percent. In three patients, the positive strands of HCVRNA were not detected in sera, but were detected in PBMC. When the IFN therapy was finished, 60 percent positive strands in sera became negative, 37.5 percent positive strands and 80 percent negative strands in PBMC became negative.
, http://www.100md.com
CONCLUSION HCV can infect PBMC and replicate in these cells, this might be a cause of chronic hepatitis C. The detection of positive and negative strands of HCVRNA in PBMC are very important to determine the curative effect and prognosis of IFN therapy.
Subject headings monocytes; hepatitis C virus; RNA, viral; interferon/therapeutic use
Wu HB, Li ZW, Li Y. Clinical significance of detection of positive and negative strands of HCV RNA in peripheral blood mononuclear cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,1999;7(3):220-221
, 百拇医药
摘要
目的 通过对外周血单个核细胞(PBMC)中HCVRNA正负链的检测,来探讨其与丙型肝炎慢性化及干扰素治疗的关系.
方法 慢性丙型肝炎患者40例,其中干扰素治疗者10例,分离血清及PBMC.异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法提取HCVRNA,应用逆转录-巢式PCR技术检测HCVRNA正负链.
结果 血清正链HCVRNA阳性率为67.5%,但负链均为阴性,PBMC中正链HCVRNA阳性率为57.5%,负链的阳性率为35.0%.其中3例患者血清中正链HCVRNA为阴性,而PBMC中为阳性.10例干扰素治疗者在治疗结束时血清正链HCVRNA60%转阴,PB-MC中负链HCVRNA80%转阴,而正链仅37.5%转阴.
, http://www.100md.com
结论 HCV能在PBMC中存在和复制,这可能是导致丙型肝炎易发生慢性化的原因之一.PBMC中HCVR-NA正负链的检测对于临床判断干扰素的疗效及预后有重要意义.
主题词 单核细胞;丙型肝炎病毒;RNA,病毒;干扰素/治疗应用
吴海滨, 李智伟, 李颖.外周血单核细胞中丙型肝炎病毒RNA正负链检测的临床意义.世界华人消化杂志,1999;7(3):220-221
0 引言
HCV属嗜肝正链RNA病毒，主要侵犯肝细胞. 近年研究证实，丙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)中可以检出正链HCVRNA，但负链的存在与否尚无定论[1，2]. 丙型肝炎易慢性化，干扰素治疗有效，但复发率较高，目前机制尚不清楚. 我们采用逆转录-巢式PCR技术对慢性丙型肝炎患者40例血清及PBMC中的HCVRNA进行检测，以探讨其与丙型肝炎慢性化及干扰素治疗的关系.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 标本 慢性丙型肝炎患者40例，其中干扰素治疗者10例，男30例，女10例，平均年龄36岁±11岁. 所有病例抗-HCV均阳性，甲，乙戊肝血清学均阴性，90%的病例有输血及注射血制品历史. 诊断标准符合上海第六届全国肝炎会议讨论修定的诊断标准[3]. 干扰素治疗方案为IFNα2b(长春生物制品研究所生产)，300万U，3次/wk，im，疗程6mo. 上述病例分别采取静脉血1mL和新鲜肝素抗凝血5mL，前者分离血清，后者用淋巴细胞分层液分离PBMC，用9g/L的无菌生理盐水洗4次，按每份1×106个细胞分装，所有标本均-70℃保存待检. PBMC和血清中的HCVRNA提取采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步抽提法[4].
, 百拇医药 1.2 HCVRNA正负链检测 ①PCR引物选择HCV基因组5’非编码区的两对引物(由上海细胞生物研究所合成)，外引物P1(07～26)5’-ACT，CCA，CCA，TAG，ATC，ACT，CC；外引物P2(248～229)5’-AAC，ACT，ACT，CGG，CTA，GCA，GT；内引物P3(46～65)5’-TTC，ACG，CAG，AAA，GCG，TCT，AG；内引物P4(190～171)5’-GTT，GAT，CCA，AGA，AAG，GAC，CC. ②逆转录-巢式PCR按文献[5]进行操作，阳性产物为145bp. 每次实验各设阳性、阴性及空白对照一份，正、负链HCVRNA同时检测做为平行对照.
2 结果
2.1 血清与PBMC中正链HCVRNA的检出 血清中正链HCVRNA的阳性率为67.5%(表1)，PBMC中正链HCVRNA的阳性率为57.5%. 40例患者血清中负链HCVRNA均为阴性，而PBMC中负链HCVRNA的阳性率为35.0%，且与正链同时存在.
, 百拇医药
表1 丙肝患者40例血清与PBMC中正链HCVRNA的检出(n=40)
2.2干扰素治疗组HCVRNA及血清ALT的变化 见表2.
, 百拇医药
表2 干扰素治疗组HCVRNA及血清ALT的变化
, 百拇医药
3 讨论
1989年Choo et al成功地克隆出HCVRNA以来，有关丙型肝炎的研究进展迅速. 本实验血清正链HCVRNA阳性率为67.5%，负链均为阴性，提示血清中可能仅有正链RNA的存在，而PBMC中正负链HCVRNA的阳性率分别为57.5%和35.0%，说明HCV能在PBMC中存在与复制，即肝细胞并非HCV感染与复制的唯一场所. 表1中3例患者PBMC中正链HCVRNA阳性而血清中却为阴性，提示PBMC可能是HCVRNA的储存场所之一，使病毒感染持续存在，成为丙型肝炎易发生慢性化的原因之一.
丙型肝炎易发生慢性化，自然治愈者很少. 目前许多研究结果证实，免疫因素是丙型肝炎患者肝细胞损害的主要原因[6]，HCV在PBMC中的存在与复制，可导致慢性丙型肝炎患者的免疫缺陷，是引起肝细胞损伤的重要因素之一.
, http://www.100md.com
干扰素是目前治疗丙型肝炎较有效的药物，有效率达50%～60%，但长期稳定者仅10%～25%，复发率较高，其产生机制尚不清楚. 本结果显示干扰素能有效地抑制病毒的复制和改善肝功能，但还未达到彻底清除病毒的目的. 治疗结束时血清ALT 66.7%恢复正常，血清正链HCVRNA有60%转阴，PBMC中负链80%转阴，而其内正链HCVRNA仅有37.5%转阴，这可能成为干扰素治疗结束后肝炎复发的原因之一. 所以PBMC中HCVRNA正、负链的检测对于临床判断干扰素的疗效及预后意义可能更大.
4 参考文献
1 Takehara T, Hayashi N, Mita E. Detection of minus strand of hepatitis C and polymerase chain reation: implication for hepatitis
, 百拇医药
C virus replication in infected tissue. Hepatology, 1992;15:387-390
2 Zignego, Machia D, Monti M. Infection of peripheral mononuclear blood cells by hepatitis C virus. J Hepatol, 1992;15:382-386
3 病毒性肝炎防治方案(试行). 中华内科学杂志， 1991；30：8-16
4 Chomczynski P, Sacchi N. Singlestep method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate phenol chloroform
extraction. Anal Biochem, 1987;162:156-159
5 刘芳华，田庚善，傅希贤. 精细胞及单个核细胞中丙型肝炎病毒RNA及其负链的检测. 中华医学杂志，1994；74：284-286
6 刘玉兰，陶其敏. 丙型肝炎的病理学进展. 肝脏病杂志，1995；3：56-58, 百拇医药(吴海滨 李智伟 李颖)
项目负责人 吴海滨，110003，中国医科大学附属二院传染科，辽宁省沈阳市
Correspondence to Hai-Bin Wu, The Second Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110003, Liaoning Province, China
收稿日期 1998-05-15 接收日期 1998-05-29
Clinical significance of detection of positive and negative strands of HCVRNA in peripheral blood mononuclear cells
, 百拇医药
Hai-Bin Wu, Zhi-Wei Li and Ying Li
The Second Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110003, Liaoning Province, China
Abstract
AIM To study the relation of chronic hepatitis C and interferon therapy with the positive and negative strands of HCVRNA in PBMC.
, http://www.100md.com
METHODS Sera and PBMC of forty patients with chronic hepatitis C were separated. HCVRNA was extracted by acid guanidinium thiocyanate-phenon-chloroform. HCVRNA was detected with reverse transcription and polymerase chain reaction.
RESULTS Positive strands of HCVRNA were detected in 67.5 percent of sera and all negative strands in sera were negative. Positive rates of positive and negative strands of HCVRNA in PBMC were 57.5 percent and 35 percent. In three patients, the positive strands of HCVRNA were not detected in sera, but were detected in PBMC. When the IFN therapy was finished, 60 percent positive strands in sera became negative, 37.5 percent positive strands and 80 percent negative strands in PBMC became negative.
, http://www.100md.com
CONCLUSION HCV can infect PBMC and replicate in these cells, this might be a cause of chronic hepatitis C. The detection of positive and negative strands of HCVRNA in PBMC are very important to determine the curative effect and prognosis of IFN therapy.
Subject headings monocytes; hepatitis C virus; RNA, viral; interferon/therapeutic use
Wu HB, Li ZW, Li Y. Clinical significance of detection of positive and negative strands of HCV RNA in peripheral blood mononuclear cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,1999;7(3):220-221
, 百拇医药
摘要
目的 通过对外周血单个核细胞(PBMC)中HCVRNA正负链的检测,来探讨其与丙型肝炎慢性化及干扰素治疗的关系.
方法 慢性丙型肝炎患者40例,其中干扰素治疗者10例,分离血清及PBMC.异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法提取HCVRNA,应用逆转录-巢式PCR技术检测HCVRNA正负链.
结果 血清正链HCVRNA阳性率为67.5%,但负链均为阴性,PBMC中正链HCVRNA阳性率为57.5%,负链的阳性率为35.0%.其中3例患者血清中正链HCVRNA为阴性,而PBMC中为阳性.10例干扰素治疗者在治疗结束时血清正链HCVRNA60%转阴,PB-MC中负链HCVRNA80%转阴,而正链仅37.5%转阴.
, http://www.100md.com
结论 HCV能在PBMC中存在和复制,这可能是导致丙型肝炎易发生慢性化的原因之一.PBMC中HCVR-NA正负链的检测对于临床判断干扰素的疗效及预后有重要意义.
主题词 单核细胞;丙型肝炎病毒;RNA,病毒;干扰素/治疗应用
吴海滨, 李智伟, 李颖.外周血单核细胞中丙型肝炎病毒RNA正负链检测的临床意义.世界华人消化杂志,1999;7(3):220-221
0 引言
HCV属嗜肝正链RNA病毒，主要侵犯肝细胞. 近年研究证实，丙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)中可以检出正链HCVRNA，但负链的存在与否尚无定论[1，2]. 丙型肝炎易慢性化，干扰素治疗有效，但复发率较高，目前机制尚不清楚. 我们采用逆转录-巢式PCR技术对慢性丙型肝炎患者40例血清及PBMC中的HCVRNA进行检测，以探讨其与丙型肝炎慢性化及干扰素治疗的关系.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 标本 慢性丙型肝炎患者40例，其中干扰素治疗者10例，男30例，女10例，平均年龄36岁±11岁. 所有病例抗-HCV均阳性，甲，乙戊肝血清学均阴性，90%的病例有输血及注射血制品历史. 诊断标准符合上海第六届全国肝炎会议讨论修定的诊断标准[3]. 干扰素治疗方案为IFNα2b(长春生物制品研究所生产)，300万U，3次/wk，im，疗程6mo. 上述病例分别采取静脉血1mL和新鲜肝素抗凝血5mL，前者分离血清，后者用淋巴细胞分层液分离PBMC，用9g/L的无菌生理盐水洗4次，按每份1×106个细胞分装，所有标本均-70℃保存待检. PBMC和血清中的HCVRNA提取采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步抽提法[4].
, 百拇医药 1.2 HCVRNA正负链检测 ①PCR引物选择HCV基因组5’非编码区的两对引物(由上海细胞生物研究所合成)，外引物P1(07～26)5’-ACT，CCA，CCA，TAG，ATC，ACT，CC；外引物P2(248～229)5’-AAC，ACT，ACT，CGG，CTA，GCA，GT；内引物P3(46～65)5’-TTC，ACG，CAG，AAA，GCG，TCT，AG；内引物P4(190～171)5’-GTT，GAT，CCA，AGA，AAG，GAC，CC. ②逆转录-巢式PCR按文献[5]进行操作，阳性产物为145bp. 每次实验各设阳性、阴性及空白对照一份，正、负链HCVRNA同时检测做为平行对照.
2 结果
2.1 血清与PBMC中正链HCVRNA的检出 血清中正链HCVRNA的阳性率为67.5%(表1)，PBMC中正链HCVRNA的阳性率为57.5%. 40例患者血清中负链HCVRNA均为阴性，而PBMC中负链HCVRNA的阳性率为35.0%，且与正链同时存在.
, 百拇医药
表1 丙肝患者40例血清与PBMC中正链HCVRNA的检出(n=40)
| 类 别 | n (%) |
| 血清(+) PBMC(+) | 20 (50.0%) |
| 血清(+) PBMC(-) | 7 (17.5%) |
| 血清(-) PBMC(+) | 3 (7.5%) |
| 血清(-) PBMC(-) | 10 (25.0%) |
2.2干扰素治疗组HCVRNA及血清ALT的变化 见表2.
, 百拇医药
表2 干扰素治疗组HCVRNA及血清ALT的变化
| 指标 | 治 疗 前 | 治 疗 结 束 时 | |
| 阳性率或异常率 | 阳性率异常率 | 阴转率(复常率) | |
| 血清ALT | 90% (9/10) | 30% (3/10) | 67% (6/9) |
| 血清正链RNA | 100% (10/10) | 40% (4/10) | 60% (6/10) |
| PBMC中正链RNA | 80% (8/10) | 50% (5/10) | 38% (3/8) |
| PBMC中负链RNA | 50% (5/10) | 10% (1/10) | 80% (4/5) |
, 百拇医药
3 讨论
1989年Choo et al成功地克隆出HCVRNA以来，有关丙型肝炎的研究进展迅速. 本实验血清正链HCVRNA阳性率为67.5%，负链均为阴性，提示血清中可能仅有正链RNA的存在，而PBMC中正负链HCVRNA的阳性率分别为57.5%和35.0%，说明HCV能在PBMC中存在与复制，即肝细胞并非HCV感染与复制的唯一场所. 表1中3例患者PBMC中正链HCVRNA阳性而血清中却为阴性，提示PBMC可能是HCVRNA的储存场所之一，使病毒感染持续存在，成为丙型肝炎易发生慢性化的原因之一.
丙型肝炎易发生慢性化，自然治愈者很少. 目前许多研究结果证实，免疫因素是丙型肝炎患者肝细胞损害的主要原因[6]，HCV在PBMC中的存在与复制，可导致慢性丙型肝炎患者的免疫缺陷，是引起肝细胞损伤的重要因素之一.
, http://www.100md.com
干扰素是目前治疗丙型肝炎较有效的药物，有效率达50%～60%，但长期稳定者仅10%～25%，复发率较高，其产生机制尚不清楚. 本结果显示干扰素能有效地抑制病毒的复制和改善肝功能，但还未达到彻底清除病毒的目的. 治疗结束时血清ALT 66.7%恢复正常，血清正链HCVRNA有60%转阴，PBMC中负链80%转阴，而其内正链HCVRNA仅有37.5%转阴，这可能成为干扰素治疗结束后肝炎复发的原因之一. 所以PBMC中HCVRNA正、负链的检测对于临床判断干扰素的疗效及预后意义可能更大.
4 参考文献
1 Takehara T, Hayashi N, Mita E. Detection of minus strand of hepatitis C and polymerase chain reation: implication for hepatitis
, 百拇医药
C virus replication in infected tissue. Hepatology, 1992;15:387-390
2 Zignego, Machia D, Monti M. Infection of peripheral mononuclear blood cells by hepatitis C virus. J Hepatol, 1992;15:382-386
3 病毒性肝炎防治方案(试行). 中华内科学杂志， 1991；30：8-16
4 Chomczynski P, Sacchi N. Singlestep method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate phenol chloroform
extraction. Anal Biochem, 1987;162:156-159
5 刘芳华，田庚善，傅希贤. 精细胞及单个核细胞中丙型肝炎病毒RNA及其负链的检测. 中华医学杂志，1994；74：284-286
6 刘玉兰，陶其敏. 丙型肝炎的病理学进展. 肝脏病杂志，1995；3：56-58, 百拇医药(吴海滨 李智伟 李颖)