不需酚抽提的DNA提取方法的建立
1广州军区广州总医院肿瘤科 广州市 510010
2南方医院全军消化病研究所 广州市 510515
*本课题为全军大肠癌九五攻关课题资助项目 NO.96Z028
项目负责人 林金容广州军区广州总医院肿瘤科 广州市 510010
收稿日期 1998-11-19
Subject headings DNA/analysis; polymerase chain reaction; methods
主题词 DNA/分析;聚合酶链反应;方法
1 材料和方法
1.1 材料 石蜡包埋组织(大肠癌组织)为近年来本院普外科手术切除标本,应用10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋. PCR扩增仪购自美国Elmerkin 公司,Taq酶购自Promega公司,蛋白酶K购自德国Merck公司.
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 ①参照Frank方法改进:具体操作简述如下:取5μm石蜡切片组织,常规脱蜡,取其中一张切片做常规苏木素-伊红(HE)染色,观察肿瘤细胞所在部位,然后取另外切片挑取目的细胞刮入0.5mL Eppendorf管,加入0.1mL pH 8.0 50mmol/L Tris-HCl及200mg/L蛋白酶K,37℃反应过夜,然后煮沸10min,灭活蛋白酶K,10000r/min,离心15min,弃沉淀,上清直接做PCR. ②按上述方法取5μm石蜡切片组织,常规酚-氯仿法提取DNA,最后沉淀物溶于DDH2O中.
1.2.2 PCR扩增 参照常规方法. 引物为家族性腺瘤性息肉病基因(Fimilial adenomatous polyposis coli, APC). 总反应体积为25μL,其中含4μL DNA提取液,上、下游引物各12.5pmol,200μmol/L×dNTP,1×扩增缓冲液、1.5mmol/L MgCl2,50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl (pH 8.3),DNA Taq酶0.75U. 覆盖石蜡油后97℃变性8min,进入下列循环35次,扩增条件为94℃,40s,56℃,30s,72℃,40s,最后72℃再延伸7min.
2 结果
采用①②提取的DNA经过PCR扩增,银染聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,均可看到133bp棕色带,表明2种方法均可以得到较玫慕峁
3 讨论
本文参照Frank方法略加改进从石蜡包埋组织中提取DNA,并用于PCR的扩增,获得了较满意的结果. 与常规酚-氯仿抽提方法提取DNA相比,具有下列优点:①方法简单方便,只需一步法提取DNA,不需要酚-氯仿抽提及乙醇沉淀. ②提高了效果. 由于本方法不需要经过酚-氯仿抽提,避免了常规方法提取过程中DNA的损失,儿乎所有目的DNA均被用于PCR扩增,提高了PCR扩增效果. ③提高了特异性. 由于先行HE染色,选取目的细胞用于DNA提取,排除了细胞间质及红细胞等因素及非目的DNA的干扰,所以提高了特异性. 另外由于红细胞对PCR扩增有一定的抑制作用,所以亦提高了效果. ④消化液中不含有SDS及钠离子,二者均对PCR有一定的影响,所以亦提高了PCR扩增的效果. ⑤对于含极少量目的DNA的提取具有更重大意义. 如法医鉴定、脱落细胞及活检组织等., 百拇医药(林金容1 刘晓霞2 姜 泊2 张亚历2 林 鸿2 周殿元2)
2南方医院全军消化病研究所 广州市 510515
*本课题为全军大肠癌九五攻关课题资助项目 NO.96Z028
项目负责人 林金容广州军区广州总医院肿瘤科 广州市 510010
收稿日期 1998-11-19
Subject headings DNA/analysis; polymerase chain reaction; methods
主题词 DNA/分析;聚合酶链反应;方法
1 材料和方法
1.1 材料 石蜡包埋组织(大肠癌组织)为近年来本院普外科手术切除标本,应用10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋. PCR扩增仪购自美国Elmerkin 公司,Taq酶购自Promega公司,蛋白酶K购自德国Merck公司.
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 ①参照Frank方法改进:具体操作简述如下:取5μm石蜡切片组织,常规脱蜡,取其中一张切片做常规苏木素-伊红(HE)染色,观察肿瘤细胞所在部位,然后取另外切片挑取目的细胞刮入0.5mL Eppendorf管,加入0.1mL pH 8.0 50mmol/L Tris-HCl及200mg/L蛋白酶K,37℃反应过夜,然后煮沸10min,灭活蛋白酶K,10000r/min,离心15min,弃沉淀,上清直接做PCR. ②按上述方法取5μm石蜡切片组织,常规酚-氯仿法提取DNA,最后沉淀物溶于DDH2O中.
1.2.2 PCR扩增 参照常规方法. 引物为家族性腺瘤性息肉病基因(Fimilial adenomatous polyposis coli, APC). 总反应体积为25μL,其中含4μL DNA提取液,上、下游引物各12.5pmol,200μmol/L×dNTP,1×扩增缓冲液、1.5mmol/L MgCl2,50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl (pH 8.3),DNA Taq酶0.75U. 覆盖石蜡油后97℃变性8min,进入下列循环35次,扩增条件为94℃,40s,56℃,30s,72℃,40s,最后72℃再延伸7min.
2 结果
采用①②提取的DNA经过PCR扩增,银染聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,均可看到133bp棕色带,表明2种方法均可以得到较玫慕峁
3 讨论
本文参照Frank方法略加改进从石蜡包埋组织中提取DNA,并用于PCR的扩增,获得了较满意的结果. 与常规酚-氯仿抽提方法提取DNA相比,具有下列优点:①方法简单方便,只需一步法提取DNA,不需要酚-氯仿抽提及乙醇沉淀. ②提高了效果. 由于本方法不需要经过酚-氯仿抽提,避免了常规方法提取过程中DNA的损失,儿乎所有目的DNA均被用于PCR扩增,提高了PCR扩增效果. ③提高了特异性. 由于先行HE染色,选取目的细胞用于DNA提取,排除了细胞间质及红细胞等因素及非目的DNA的干扰,所以提高了特异性. 另外由于红细胞对PCR扩增有一定的抑制作用,所以亦提高了效果. ④消化液中不含有SDS及钠离子,二者均对PCR有一定的影响,所以亦提高了PCR扩增的效果. ⑤对于含极少量目的DNA的提取具有更重大意义. 如法医鉴定、脱落细胞及活检组织等., 百拇医药(林金容1 刘晓霞2 姜 泊2 张亚历2 林 鸿2 周殿元2)