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编号:10696126
幽门螺杆菌fla-A基因的变异
http://www.100md.com 1999年4月15日 《世界华人消化杂志》 1999年第4期
     1广东省顺德市大良医院 528300

    2第一军医大学南方医院全军消化内科研究所 广东省广州市 510515

    余毅,女,1965-10-19生,广东省中山市人. 1986年广州军区军医学校毕业,1992/1993第一军医大学南方医院进修内镜诊断

    及幽门螺杆菌研究,从事内科学消化系病专业,主治医师.

    项目负责人
徐智民,510515,广州市同和南方医院全军消化内科研究所.

    Correspondence to Zhi-Min Xu, PLA Institute for Digestive Diseases, Nanfang Hospital, the First Military Medical University,Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
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    E-mail xu_zm@ usa. net

    收稿日期 1998-07-07

    Variability of flaA gene of Helicobacter pylori

    Yi Yu1, Zhi-Min Xu2, Xi-Qi Ou1, Shan Song2 and Miao-Ying Zhang1

    1Department of Daliang Hospital, Shunde 510300, Guangdong Province, China
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    2PLA Institute for Digestive Diseases, Nanfang Hospital, the First Military Medical University, Guangzhou 510515,Guangdong Province, China

    


    Abstract

    AIM To study the variability and pathogenecity of Helicobacter pylori (Hp).

    METHODS
PCR was performed in fifty-two biopsy specimens of gastric mucosa and 18 strains of Hp for 16S rRNA gene and flagellin Agene (flaA). And then PCR RFLP and RFLP-SSCP were also analyzed.
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    RESULTS
Seven flaA genotypes were found by PCR-RFLP in 43 strains of Hp (detecting rate of variance was 16.3%), but 37 were found by PCR-RFLP-SSCP in the same group of cases (detecting rate of variance was 86.0%).

    CONCLUSION
Very large variability in flaA gene of Hp was detected by PCR-RFLP-SSCP, which is a more effective method than PCR-RFLP to identify Hp strains in human stomach.

    Subject headings Helicobacter pylori; flaA gene; stomach diseases
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    Yu Y, Xu ZM, Ou XQ, Song S, Zhang MY. Variability of fla-A gene of Helicobacter pylori.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,1999;7(4):323-325

    

    摘要


    目的 鞭毛是幽门螺杆菌(Hp)的重要侵袭因子,本研究拟检测Hp鞭毛素A基因的变异性,进而研究其与Hp致病性的关系.

    方法 我们对52例胃粘膜活检标本和18株Hp临床分离株进行Hp特异的16SrRNA基因和鞭毛素A基因PCR扩增和PCR-RFLP及PCR-RFLP-SSCP分析.
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    结果 对43例Hp(+)的flaA基因PCR-RFLP(HindⅢ)大约可分7个型(变异检出率为16.3%),而PCR-RFLP-SSCP可分37个型(变异检出率为86.0%),两者有非常显著性差异.

    结论 flaA基因变异性极大,PCR-RFLP-SSCP优于PCR-RFLP,是检测其变异的有效方法.

    主题词 螺杆菌,幽门;鞭毛素A基因;胃疾病

    余毅, 徐智民, 欧锡祺, 宋姗, 张妙英.幽门螺杆菌fla-A基因的变异.世界华人消化杂志,1999;7(4):323-325

    

    0 引言

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    幽门螺杆菌(Hp)是人类胃病的重要病原菌. 作为致病因素之一的Hp鞭毛,在其致病过程中起重要的作用[1-7]. 同时Hp的鞭毛从结构到基因型,均存在很大的差异[2-7]. 因此,表现在不同的Hp菌株所致人类病变也可能存在差异. 为研究Hp鞭毛基因的变异情况,我们采用Hp特异鞭毛A基因(flaA)引物,研究Hp鞭毛基因的变异的多态性.

    1 材料和方法

    1.1 材料
①标本来源:本研究检测72例标本,包括人胃粘膜活检标本52例和临床Hp分离株18例. ②引物设计:本研究采用Ho et al[8]设计的Hp特异16S rRNA基因正链引物Hp 1(5’-GCGCAATCAGCGTCAGGTAATG-3’)和反链Hp 2(5’-GCTAAGAGATCAGCCTATGTCC-3’)PCR扩增用于鉴定Hp(扩增长度509bp)(由上海生化所合成);采用Leying[3]设计的Hp鞭毛蛋白A基因(flaA)引物Fla1(5’-ATGGCTTTTCAGGTCAATAC-3',1~20nt)和Fla2(5’-CTTAAGATATTTTG TTGAA CG-3',1500~1521nt)(由加拿大合成)PCR(扩增长度1521bp)用于检测Hp株之间的差异性. ③PCR试剂及器材:10×PCR反应缓冲液(500mmol/L KCl, Tris-HCl (pH 9.0)和10g/L Triton X-100;MgCl2 25mmol/L,dNTP, Tag酶购自南方医院基因检测中心,DNA分子质量标准物购自北京天象人公司,HindⅢ由天象人公司购得. 所用DNA扩增仪(Perkin Elmer-480)、电泳仪(Bio-RAD/PAC300)、电泳槽(Bio-Rad,Protean Ⅱ XI Cell)、恒压恒流电流电泳仪(DF-C,北京东方仪器厂)、28B型垂直电泳槽(北京)、水平电泳槽(北京东方仪器厂)及恒温循环器(HX-10555,军科院)由第一军医大学南方医院提供.
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    1.2 方法 胃粘膜标本采用10g/L SDS+蛋白酶K消化,苯酚∶氯仿∶异戊醇脱蛋白、乙酸钠及乙醇沉淀模板DNA,临床分离株直接将Hp菌落刮入灭菌双蒸水中,冻融后直接作为模板. 实验方法和步骤:①内镜下胃窦粘膜活检,用于Hp分离培养或抽提DNA;②PCR检测:在25μL反应体积中含dNTP各2.0mmol/L,1×PCR缓冲液,Fla1和Fla2各500nmol/L,DNA模板2μL,Tag酶1U,上覆2滴轻矿物油. PCR过程:将没有加酶及dNTP的PCR混合液95℃预变性5min→80℃×3min(加酶和dNTP)→(94℃×1min→47℃×1min→72℃×2min)×10循环→(94℃×30s→47℃×30s→72℃×1min)×25循环→72℃ 10min结束. 用于16S rRNA基因扩增的复性温度为55℃. ③PCR产物的琼脂糖凝胶电泳:吸取PCR产物6μL~8μL,在10g/L~15g/L的琼脂糖凝胶上100V×15min电泳,紫外分析仪上观察结果;④PCR-RFLP:PCR产物10μL用内切酶HindⅢ 2U+Buffer B于37℃消化2h,取10μL行丙烯酰胺凝胶电泳(2000V),PAGE凝胶行银染观察其酶切产物的多态性. ⑤PCR-RFLP-SSCP:取上述酶切产物10μL,电泳前+等量SSCP上样缓冲液于95℃变性10min,在低温(<4℃)下上样及丙烯酰胺凝胶电泳(2000V),PAGE凝胶行银染观察Hp鞭毛基因HindⅢ酶切片段单链构象的多态性.
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    2 结果

    我们对52例胃粘膜标本采用Hp特异16S rRNA基因引物的PCR检出Hp 27例(阳性率为51.9%),而采用Hp特异的flaA基因引物的PCR检出Hp 25例,阳性率为48.1%,相对于Hp-16S rRNA基因的PCR的阳性率92.6%. 两者比较无显著性差异. 另对18例Hp临床分离株均可扩增出特异的flaA带,阳性率100%. 43株Hp的flaA基因PCR-RFLP(HindⅢ)大约可分7个型(变异检出率为16.3%),而PCR-RFLP-SSCP可分37个型(变异检出率为86.0%),两者有非常显著性差异(图1).

    1 Hp flaA的PCR-RFLP和PCR-RFLP-SSCP (70g/L PAGE, 1200V·h,银染)*R:PCR-RFLP, S:PCR-RFLP-SSCP
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    3 讨论

    我们观察到Hp的鞭毛有双级的单根鞭毛和多根鞭毛,部分临床株光镜下观察动力不明显或电镜下也难以观察到鞭毛,而鞭毛是Hp重要的致病因子之一. 文献报道,Hp的鞭毛基因变异很大,其研究一般采用PCR-RFLP的方法[5]. 而我们采用PCR-RFLP-SSCP方法,首先选用鞭毛flaA基因引物对其进行PCR检测,在PCR基础上对其产物行酶切片段长度的多态性分析(RFLP)和单链构象多态性分析(SSCP).

    本研究结果表明,Hp-flaA基因的PCR-RFLP可以检测出其基因型的差异,且差异的检出率与国外报道的结果接近[5],但由于DNA的酶切反应受位点的限制,只要不是发生于位点的变异,而采用PCR-RFLP检出差异的很小. PCR-SSCP是将DNA的两条单链解开,在非变性PAGE凝胶中形成一定的空间结构,导致在电场中的泳动速度不一,形成一定的构象差异. 但其对DNA的片段大小有一定的要求,片段一般需小于400bp,且片段越小,检出点突变的机会越高,一般以200bp左右最为合适. 本研究选用的Hp flaA基因PCR产物达1521bp,采用PCR-SSCP便难以得到差异的结果. 为此,我们在PCR-RFLP的基础上,将PCR产物消化成一系列的片段,再进行SSCP电泳,使变异的检出率有明显的提高(16.3% vs 86.0%). 因此,PCR-RFLP-SSCP是鉴定菌株,了解变异的敏感方法.
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    鞭毛基因型的差异,可影响到Hp鞭毛动力的强弱、也可能与其粘附的强弱有关. Hp的感染首先需依靠其鞭毛动力,从致命的酸性胃液迅速穿入胃粘膜粘液层中定植,进而粘附于胃上皮细胞表面并在胃粘液层中扩展. Hp感染人胃后,为抵抗人类的自洁作用,也依靠其动力和粘附性,继续在胃内寄生,导致人类的胃病的发生和发展. 当然,影响Hp感染和导致人类胃病的因素尚有多种,如Hp的尿素酶、CagA,VacA等都与Hp的致病性有一定的关系. 除鞭毛基因外,鞭毛特异的ATP酶(flagellar-specific ATPase, FliⅠ)[10]也是影响Hp鞭毛动力的重要因素. 找出Hp基因差异与Hp株的致病性关系是非常困难的,需要大量的检测和对比研究. 我们在Hp flaA基因的变异检测方面做了一些工作,本研究证明,基于大片段的PCR-RFLP-SSCP是区分不同Hp株的理想方法,进而可检测不同Hp flaA基因型与其致病的关系.

, 百拇医药     4 参考文献

    1 Newell DG. Virulence factors of Helicobacter pylori. Scand J Gastroenterol, 1991;187(Suppl):31-38

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, 百拇医药
    Mol Microbiol, 1992;6;2863-2874

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