胆石症患者肝细胞内源性β-葡萄糖醛酸酶的免疫电镜研究
1沈阳军区总医院肝胆外科 辽宁省沈阳市 110015
2中国医科大学病理教研室 辽宁省沈阳市 110001
3辽宁省人民医院病理科 辽宁省沈阳市 110015
辽宁省自然科学基金资助课题，No. 962252
项目负责人 杨波沈阳军区总医院肝胆外科 辽宁省沈阳市 110015
收稿日期 1999-03-06 接收日期 1999-04-22
, 百拇医药
Subject headings cholelithiasis; liver/enzymology; β-glucuronidas/analysis
主题词 胆结石；肝/酶学；β-葡萄糖醛酸酶/分析
人体组织细胞自身产生的内源性β-葡萄糖醛酸酶(β-G)的质和量与胆红素结石形成有关[1]. 我们选取胆红素结石及胆固醇结石肝细胞溶酶体为研究对象，参照肝细胞免疫电镜研究模型[2]，探讨β-G与不同类型胆结石的关系.
1 材料和方法
1.1 材料 1995/1998沈阳地区部分医院手术切除和(或)组织活检，经病理检查结果证实的胆红素结石肝组织28例，男18例，女10例，年龄22岁～78岁，平均42岁. 胆固醇结石肝组织15例，男5例，女10例，年龄24岁～46岁，平均37岁. 二组间性别. 年龄分布比较，差异无显著性
, 百拇医药
(P>0.05).
1.2 方法 留取新鲜组织标本，分别切成1mm3小组织块，立即投入Carson-Millong液中固定4h，PBS液冲洗数次，逐级乙醇脱水，White树脂包埋. 低温聚合，超薄切片机下制成70nm～80nm连续切片，贴附于镍网上，各取2张，随机分成对照组和实验组，每组43张. 浸湿的镍网室温下在1∶100兔抗人多克隆抗β-G抗体(美国阿拉巴马大学Ho KJ教授惠赠)中孵育2h，行第Ⅰ抗体染色，PBS液冲洗后，1∶25羊抗兔15nm胶体金抗体再染色1h，行第Ⅱ抗体标记，再行铀一铅复染，彻底冲洗后，CM10型透射电镜观察. 对照组中不加Ⅰ抗，用蒸馏水代替Ⅰ抗，其余实验条件与实验组相同. 具体方法参照文献[2].
统计学处理 计数方法参照Weidener et al[3]法，随机拍照10个任意分布区，照片最后选取同样放大倍数为27500倍，再输入IPS-500型图象分析仪处理，以1μm2为单位，测取肝细胞溶酶体内金标颗粒的数目，以均数±标准差表示(±s). 选取t检验.
, 百拇医药
2 结果
胆红素结石组肝细胞溶酶体内β-G测定金颗粒计数为(16±4)个/μm2，胆固醇结石组肝细胞溶酶体内金颗粒计数为(10±2)个/μm2，两组比较，差异有显著意义，P<0.01. 胆红素结石组男18例，金颗粒计数(17±4)个/μm2，与胆固醇结石组男5例(10±2)个/μm2比较，差异有显著意义，P<0.01. 胆红素结石组女10例(16±4)个/μm2与胆固醇结石组女10例(10±2)个/μm2比较，差异有显著意义，P<0.01. 胆红素结石男18例，金颗粒计数(17±4)个/μm2，与女10例(16±4)个/μm2比较，差异无显著意义，P>0.05. 胆固醇结石男5例(10±2)个/μm2与女10例(10±2)个/μm2比较，差异无显著意义，P>0.05.
, 百拇医药
3 讨论
β-G是哺乳动物体内组织及体液中的酸性水解酶，完成如下生理功能：①：与类固醇激素的结合作用；②：对结合的葡萄糖醛酸苷的水解作用；③参与细胞的增生[4]. 其中β-G对结合的葡萄糖醛酸苷的水解作用与胆红素结石形成关系密切. 人体β-G有内源性和外源性之分，其中外源性β-G，即胆道感染细菌繁殖产生的β-G，在胆红素结石形成中所起作用已得到肯定. 细菌酶解学说认为，胆红素结石形成与胆道感染细菌繁殖产生外源性β-G的量，作用的内环境(如pH，最适为7.0)，以及其抑制物的量与程度有关[5，6]. 关于内源性β-G，Ho et al[1]认为是机体自身组织细胞产生，合成并分泌的，所有哺乳类组织均存在，其中肝脏特别丰富. 它淖钍蕄H为4.6，在适宜情况下，也能水解胆汁中的结合型胆红素，因而结石可以在胆总管及肝内胆管中形成并增大. 目前内源性β-G质与量与胆红素结石形成是否相关，国内外学者尚无统一认识. 我们应用免疫电镜技术对肝细胞溶酶体中β-G进行定量研究是内源性β-G与胆红素结石成因关系形态学研究的初次探讨. 实验结果表明，内源性β-G在胆红素结石及胆固醇结石患者肝细胞溶酶体中含量有非常显著差异，即胆红素结石个体比胆固醇结石个体内源性β-G含量明显增高，两者有质的区别. 本文以形态学依据证实，胆红素结石患者肝组织细胞内β-G含量比胆固醇结石个体内源性β-G含量明显增高. 表明：内源性β-G作为人体内一种活性酶，是胆红素结石形成的相关因素之一.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Pathogenesis of the formation of pigment gallstons. The role of human biliary β-Glucuronidase. Med Today,
1992; 155:694-697
2 杨波，朱善德，杜晓炬，李顺明，杨捷润，李荫山. 人肝细胞超微结构β-葡萄糖醛酸酶分布的定位定量研究及意义.
中华实验外科杂志， 1996；13：342-343
3 Weidener, Semole JP, Welch WR. Tumer angiogenesis and metastasis cerrelation in invasive breast carcinoma.
, 百拇医药
N Engl J Med, 1991;324:1-4
4 HO KJ. A large scaled purification of β-Glucuronidase from human liver by immunoaffinity chromatography.
Biotech Appl Biochem, 1991;14:296-298
5 黄志强. 原发性肝胆管结石症. 见：吴阶平， 裘法祖主编. 黄家驷外科学. 第5版. 北京：人民卫生出版社，1994：1393-1395
6 高静涛，裴德恺. 胆道的病理生理学. 见：施维锦主编. 胆道外科学. 第1版. 上海：上海科学技术出版社，1993：52-55, 百拇医药(杨 波1 朱善德1 张 弘2 李 为3 杜晓炬1 于 众2 于安民2)
2中国医科大学病理教研室 辽宁省沈阳市 110001
3辽宁省人民医院病理科 辽宁省沈阳市 110015
辽宁省自然科学基金资助课题，No. 962252
项目负责人 杨波沈阳军区总医院肝胆外科 辽宁省沈阳市 110015
收稿日期 1999-03-06 接收日期 1999-04-22
, 百拇医药
Subject headings cholelithiasis; liver/enzymology; β-glucuronidas/analysis
主题词 胆结石；肝/酶学；β-葡萄糖醛酸酶/分析
人体组织细胞自身产生的内源性β-葡萄糖醛酸酶(β-G)的质和量与胆红素结石形成有关[1]. 我们选取胆红素结石及胆固醇结石肝细胞溶酶体为研究对象，参照肝细胞免疫电镜研究模型[2]，探讨β-G与不同类型胆结石的关系.
1 材料和方法
1.1 材料 1995/1998沈阳地区部分医院手术切除和(或)组织活检，经病理检查结果证实的胆红素结石肝组织28例，男18例，女10例，年龄22岁～78岁，平均42岁. 胆固醇结石肝组织15例，男5例，女10例，年龄24岁～46岁，平均37岁. 二组间性别. 年龄分布比较，差异无显著性
, 百拇医药
(P>0.05).
1.2 方法 留取新鲜组织标本，分别切成1mm3小组织块，立即投入Carson-Millong液中固定4h，PBS液冲洗数次，逐级乙醇脱水，White树脂包埋. 低温聚合，超薄切片机下制成70nm～80nm连续切片，贴附于镍网上，各取2张，随机分成对照组和实验组，每组43张. 浸湿的镍网室温下在1∶100兔抗人多克隆抗β-G抗体(美国阿拉巴马大学Ho KJ教授惠赠)中孵育2h，行第Ⅰ抗体染色，PBS液冲洗后，1∶25羊抗兔15nm胶体金抗体再染色1h，行第Ⅱ抗体标记，再行铀一铅复染，彻底冲洗后，CM10型透射电镜观察. 对照组中不加Ⅰ抗，用蒸馏水代替Ⅰ抗，其余实验条件与实验组相同. 具体方法参照文献[2].
统计学处理 计数方法参照Weidener et al[3]法，随机拍照10个任意分布区，照片最后选取同样放大倍数为27500倍，再输入IPS-500型图象分析仪处理，以1μm2为单位，测取肝细胞溶酶体内金标颗粒的数目，以均数±标准差表示(±s). 选取t检验.
, 百拇医药
2 结果
胆红素结石组肝细胞溶酶体内β-G测定金颗粒计数为(16±4)个/μm2，胆固醇结石组肝细胞溶酶体内金颗粒计数为(10±2)个/μm2，两组比较，差异有显著意义，P<0.01. 胆红素结石组男18例，金颗粒计数(17±4)个/μm2，与胆固醇结石组男5例(10±2)个/μm2比较，差异有显著意义，P<0.01. 胆红素结石组女10例(16±4)个/μm2与胆固醇结石组女10例(10±2)个/μm2比较，差异有显著意义，P<0.01. 胆红素结石男18例，金颗粒计数(17±4)个/μm2，与女10例(16±4)个/μm2比较，差异无显著意义，P>0.05. 胆固醇结石男5例(10±2)个/μm2与女10例(10±2)个/μm2比较，差异无显著意义，P>0.05.
, 百拇医药
3 讨论
β-G是哺乳动物体内组织及体液中的酸性水解酶，完成如下生理功能：①：与类固醇激素的结合作用；②：对结合的葡萄糖醛酸苷的水解作用；③参与细胞的增生[4]. 其中β-G对结合的葡萄糖醛酸苷的水解作用与胆红素结石形成关系密切. 人体β-G有内源性和外源性之分，其中外源性β-G，即胆道感染细菌繁殖产生的β-G，在胆红素结石形成中所起作用已得到肯定. 细菌酶解学说认为，胆红素结石形成与胆道感染细菌繁殖产生外源性β-G的量，作用的内环境(如pH，最适为7.0)，以及其抑制物的量与程度有关[5，6]. 关于内源性β-G，Ho et al[1]认为是机体自身组织细胞产生，合成并分泌的，所有哺乳类组织均存在，其中肝脏特别丰富. 它淖钍蕄H为4.6，在适宜情况下，也能水解胆汁中的结合型胆红素，因而结石可以在胆总管及肝内胆管中形成并增大. 目前内源性β-G质与量与胆红素结石形成是否相关，国内外学者尚无统一认识. 我们应用免疫电镜技术对肝细胞溶酶体中β-G进行定量研究是内源性β-G与胆红素结石成因关系形态学研究的初次探讨. 实验结果表明，内源性β-G在胆红素结石及胆固醇结石患者肝细胞溶酶体中含量有非常显著差异，即胆红素结石个体比胆固醇结石个体内源性β-G含量明显增高，两者有质的区别. 本文以形态学依据证实，胆红素结石患者肝组织细胞内β-G含量比胆固醇结石个体内源性β-G含量明显增高. 表明：内源性β-G作为人体内一种活性酶，是胆红素结石形成的相关因素之一.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Pathogenesis of the formation of pigment gallstons. The role of human biliary β-Glucuronidase. Med Today,
1992; 155:694-697
2 杨波，朱善德，杜晓炬，李顺明，杨捷润，李荫山. 人肝细胞超微结构β-葡萄糖醛酸酶分布的定位定量研究及意义.
中华实验外科杂志， 1996；13：342-343
3 Weidener, Semole JP, Welch WR. Tumer angiogenesis and metastasis cerrelation in invasive breast carcinoma.
, 百拇医药
N Engl J Med, 1991;324:1-4
4 HO KJ. A large scaled purification of β-Glucuronidase from human liver by immunoaffinity chromatography.
Biotech Appl Biochem, 1991;14:296-298
5 黄志强. 原发性肝胆管结石症. 见：吴阶平， 裘法祖主编. 黄家驷外科学. 第5版. 北京：人民卫生出版社，1994：1393-1395
6 高静涛，裴德恺. 胆道的病理生理学. 见：施维锦主编. 胆道外科学. 第1版. 上海：上海科学技术出版社，1993：52-55, 百拇医药(杨 波1 朱善德1 张 弘2 李 为3 杜晓炬1 于 众2 于安民2)