诱生型一氧化氮合酶在腹腔感染大鼠肝细胞中的表达
1同济医科大学附属同济医院外科 湖北省武汉市 430030
2长航总医院内科 湖北省武汉市 430015
项目负责人 陈刚同济医科大学附属同济医院外科 湖北省武汉市 430030
收稿日期 1999-01-04 接收日期 1999-05-01
Subject headings abdominal infection; nitric oxide synthase; liver
主题词 腹腔感染；一氧化氮合酶；肝
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 ♂ Wistar大鼠30只(体质量220g±20g)，10周龄～12周龄，由同济医科大学实验动物中心提供. 标准致病菌(大肠杆菌ATCC-25922)，由美国菌种保藏中心提供. 还原型辅酶Ⅱ(β-NADPH)与硝基四唑氮蓝(NBT)为美国Sigma公司产品，多聚甲醛与Triton X-100为德国MERCK公司产品，余试剂为国产分析纯.
1.2 方法 大鼠随机分为5组(每组6只)，其中正常对照组1组(组Ⅰ)，实验组4组，分别于术后2h(组Ⅱ)，8h(组Ⅲ)，24h(组Ⅳ)，48h(组Ⅴ)处死取材. 腹腔注射标准致病菌液(1×1011/L) 1mL，制成大鼠腹腔感染模型. 各组动物分别于规定时间处死取材，常规制片. 行还原型辅酶Ⅱ黄递酶组织化学染色：①正常染色：切片以0.1mol/L PBS漂洗后，放入孵育液内于37℃恒温箱内孵育3min，孵育液由1.2mmol/L的β-NADPH，0.5mmol/L的NBT和3g/L的Triton X-100(pH 8.0)组成. 取出切片放入0.01mol/L PBS(pH 7.4)中终止反应. 常规裱片，梯度酒精脱水，二甲苯透明及中性树脂封片. ②阴性对照：孵育液中不含β-NADPH；孵育液中不含NBT；将肝组织切片加热84℃，5min，破坏NOS活性. 余试剂和方法与正常染色相同. 图象分析：用MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统，以象素点长0.785μm，在1.718e+0.5μm2测量角下测得切片的积分光度和平均灰度.
, 百拇医药
2 结果
2.1 镜下观察(×100) 正常染色切片：正常对照组视野所见均为正常肝细胞，未见阳性细胞. 感染2h组切片肝细胞索形态正常，在中央静脉周围隐约可见数个着浅蓝色的弱阳性细胞. 感染8h组可在中央静脉周围见到环行排列的着深蓝色的强阳性细胞和部分着浅蓝色的弱阳性细胞. 感染24h组在中央静脉周围见到大量着深蓝色的强阳性细胞，多连结成片，其外围有部分着浅蓝色的弱阳性细胞. 感染48h组强阳性细胞数量有所减少，但仍可见到大量环绕中央静脉分布的强阳性细胞，其外围有部分弱阳性细胞. 阴性对照染色切片：所有各组切片均未见任何细胞呈NOS阳性染色反应.
2.2 图象分析 采用积分光度与平均灰度两项指标. 积分光度越高，平均灰度越低，均说明阳性细胞数量越多. 图象分析结果显示，积分光度与平均灰度除对照组与感染2h组之间无显著性差异外，余各组两两之间比较均有显著性差异(P<0.01，表1).
, 百拇医药
表1 腹腔感染大鼠肝细胞iNOS表达图象分析结果
, 百拇医药
3 讨论
我们对大鼠腹腔感染体内模型的研究表明，腹腔感染时，肝细胞确有iNOS的表达，但在2h时基本未见，8h前后才有明显的iNOS的表达，24h左右达到峰值，48h仍维持较高水平的表达. 这与国外肝细胞体外培养的研究结果有所不同，Geller et al[1]的研究发现，体外培养的人肝细胞在受到细菌内毒素(LPS)和(或)细胞因子(Cytokines)刺激后，iNOSmRNA一般在2h～4h能检测到，6h～8h达到峰值，24h降到峰值的25%，48h仅为可检出水平. 分析这种差异的原因，一是细胞培养是在上清中一次性加入定量的LPS和(或)cytokines，其作用直接而迅速；而本实验则是在大鼠腹腔内注入致病菌，由于细菌在体内产生毒素和繁殖都有一个过程，故肝细胞表达iNOS的时相较晚. 但由于细菌可在体内迅速繁殖，产生大量LPS，并通过全身炎症反应综合征中的所谓“瀑布效应”形成大量cytokines[2]，其刺激是持续的，故肝细胞可持续高效地表达iNOS. 二是我们研究的是肝细胞iNOS表达的情况，而非iNOSmRNA转录水平的变化. 后者须采用分子生物学技术进一步予以研究，以了解体内感染模型中是否有iNOSmRNA持续高效的表达. 我们的另一发现是iNOS阳性染色的肝细胞大多围绕中央静脉分布，越靠近中央静脉的肝细胞显色越深. 这可能是血管周围刺激iNOS表达的因子浓度较高的缘故，但其确切的机制尚不清楚. 本结果表明，腹腔感染时，肝细胞可持续高效地表达iNOS. 这可能对腹腔感染的发生，发展具有重要意义. 腹腔感染是常见的，往往也是十分凶险的外科感染性疾病，严重时可导致患者死亡，且死因多为感染性休克和多器官系统功能衰竭. 我们的实验结果提示，在腹腔感染及其并发症的发生，发展过程中，确有iNOS和NO的参与， 而肝脏是合成NO的重要器官. 这与国外相关的研究结论是一致的[3，4]，但参与的程度与机制尚有待进一步研究证实.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Geller DA, Nussler AK, Silvio MD, Lowenstein CJ, Shapiro RA, Wang SC, Simmons RL, Billiar TR. Cytokines, endotoxin,and glucocorticoids regulate the expression of inducible nitric oxide synthase in Hepatocytes.
Proc Natl Acad Sci USA, 1993;90:522-526
2 黄艹 延庭. 全身炎症反应综合征. 中华医学杂志，1996；76：629-631
3 Wang JF, Spolarics Z, Greenberg SS. Lipopolysaccharide (LPS) in vivo stimulates nitric oxide production by the perfused
rat liver. FASEB Journal, 1993;7(A243):1405
4 Geller DA, Billiar TR. Should surgeons clone genes The strategy behind the cloning of the human inducible nitric oxide synthase
gene. Archives of Surgery, 1993;128:1212-1220, 百拇医药(陈 刚1 龚海燕2 邹声泉1 陈 忠1)
2长航总医院内科 湖北省武汉市 430015
项目负责人 陈刚同济医科大学附属同济医院外科 湖北省武汉市 430030
收稿日期 1999-01-04 接收日期 1999-05-01
Subject headings abdominal infection; nitric oxide synthase; liver
主题词 腹腔感染；一氧化氮合酶；肝
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 ♂ Wistar大鼠30只(体质量220g±20g)，10周龄～12周龄，由同济医科大学实验动物中心提供. 标准致病菌(大肠杆菌ATCC-25922)，由美国菌种保藏中心提供. 还原型辅酶Ⅱ(β-NADPH)与硝基四唑氮蓝(NBT)为美国Sigma公司产品，多聚甲醛与Triton X-100为德国MERCK公司产品，余试剂为国产分析纯.
1.2 方法 大鼠随机分为5组(每组6只)，其中正常对照组1组(组Ⅰ)，实验组4组，分别于术后2h(组Ⅱ)，8h(组Ⅲ)，24h(组Ⅳ)，48h(组Ⅴ)处死取材. 腹腔注射标准致病菌液(1×1011/L) 1mL，制成大鼠腹腔感染模型. 各组动物分别于规定时间处死取材，常规制片. 行还原型辅酶Ⅱ黄递酶组织化学染色：①正常染色：切片以0.1mol/L PBS漂洗后，放入孵育液内于37℃恒温箱内孵育3min，孵育液由1.2mmol/L的β-NADPH，0.5mmol/L的NBT和3g/L的Triton X-100(pH 8.0)组成. 取出切片放入0.01mol/L PBS(pH 7.4)中终止反应. 常规裱片，梯度酒精脱水，二甲苯透明及中性树脂封片. ②阴性对照：孵育液中不含β-NADPH；孵育液中不含NBT；将肝组织切片加热84℃，5min，破坏NOS活性. 余试剂和方法与正常染色相同. 图象分析：用MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统，以象素点长0.785μm，在1.718e+0.5μm2测量角下测得切片的积分光度和平均灰度.
, 百拇医药
2 结果
2.1 镜下观察(×100) 正常染色切片：正常对照组视野所见均为正常肝细胞，未见阳性细胞. 感染2h组切片肝细胞索形态正常，在中央静脉周围隐约可见数个着浅蓝色的弱阳性细胞. 感染8h组可在中央静脉周围见到环行排列的着深蓝色的强阳性细胞和部分着浅蓝色的弱阳性细胞. 感染24h组在中央静脉周围见到大量着深蓝色的强阳性细胞，多连结成片，其外围有部分着浅蓝色的弱阳性细胞. 感染48h组强阳性细胞数量有所减少，但仍可见到大量环绕中央静脉分布的强阳性细胞，其外围有部分弱阳性细胞. 阴性对照染色切片：所有各组切片均未见任何细胞呈NOS阳性染色反应.
2.2 图象分析 采用积分光度与平均灰度两项指标. 积分光度越高，平均灰度越低，均说明阳性细胞数量越多. 图象分析结果显示，积分光度与平均灰度除对照组与感染2h组之间无显著性差异外，余各组两两之间比较均有显著性差异(P<0.01，表1).
, 百拇医药
表1 腹腔感染大鼠肝细胞iNOS表达图象分析结果
| 检测指标 | 组别 | 组间自由度 | 组内自由度 | ||||
| Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅳ | Ⅴ | |||
| 积分光度 | 2.73±0.12 | 2.86±0.09 | 14.35±0.72 | 28.11±0.66 | 20.12±0.14 | 4 | 25b |
| 平均灰度 | 203.62±0.75 | 202.58±1.10 | 182.88±2.03 | 164.79±3.50 | 181.11±1.69 | 4 | 25b |
, 百拇医药
3 讨论
我们对大鼠腹腔感染体内模型的研究表明，腹腔感染时，肝细胞确有iNOS的表达，但在2h时基本未见，8h前后才有明显的iNOS的表达，24h左右达到峰值，48h仍维持较高水平的表达. 这与国外肝细胞体外培养的研究结果有所不同，Geller et al[1]的研究发现，体外培养的人肝细胞在受到细菌内毒素(LPS)和(或)细胞因子(Cytokines)刺激后，iNOSmRNA一般在2h～4h能检测到，6h～8h达到峰值，24h降到峰值的25%，48h仅为可检出水平. 分析这种差异的原因，一是细胞培养是在上清中一次性加入定量的LPS和(或)cytokines，其作用直接而迅速；而本实验则是在大鼠腹腔内注入致病菌，由于细菌在体内产生毒素和繁殖都有一个过程，故肝细胞表达iNOS的时相较晚. 但由于细菌可在体内迅速繁殖，产生大量LPS，并通过全身炎症反应综合征中的所谓“瀑布效应”形成大量cytokines[2]，其刺激是持续的，故肝细胞可持续高效地表达iNOS. 二是我们研究的是肝细胞iNOS表达的情况，而非iNOSmRNA转录水平的变化. 后者须采用分子生物学技术进一步予以研究，以了解体内感染模型中是否有iNOSmRNA持续高效的表达. 我们的另一发现是iNOS阳性染色的肝细胞大多围绕中央静脉分布，越靠近中央静脉的肝细胞显色越深. 这可能是血管周围刺激iNOS表达的因子浓度较高的缘故，但其确切的机制尚不清楚. 本结果表明，腹腔感染时，肝细胞可持续高效地表达iNOS. 这可能对腹腔感染的发生，发展具有重要意义. 腹腔感染是常见的，往往也是十分凶险的外科感染性疾病，严重时可导致患者死亡，且死因多为感染性休克和多器官系统功能衰竭. 我们的实验结果提示，在腹腔感染及其并发症的发生，发展过程中，确有iNOS和NO的参与， 而肝脏是合成NO的重要器官. 这与国外相关的研究结论是一致的[3，4]，但参与的程度与机制尚有待进一步研究证实.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Geller DA, Nussler AK, Silvio MD, Lowenstein CJ, Shapiro RA, Wang SC, Simmons RL, Billiar TR. Cytokines, endotoxin,and glucocorticoids regulate the expression of inducible nitric oxide synthase in Hepatocytes.
Proc Natl Acad Sci USA, 1993;90:522-526
2 黄艹 延庭. 全身炎症反应综合征. 中华医学杂志，1996；76：629-631
3 Wang JF, Spolarics Z, Greenberg SS. Lipopolysaccharide (LPS) in vivo stimulates nitric oxide production by the perfused
rat liver. FASEB Journal, 1993;7(A243):1405
4 Geller DA, Billiar TR. Should surgeons clone genes The strategy behind the cloning of the human inducible nitric oxide synthase
gene. Archives of Surgery, 1993;128:1212-1220, 百拇医药(陈 刚1 龚海燕2 邹声泉1 陈 忠1)