原位末端标记法检测双歧杆菌的完整肽聚糖诱导实验性大肠癌的凋亡 王立生 潘令嘉 李明松 孙 勇 施 理 张亚历 周殿
第一军医大学南方医院全军消化内科研究所 广东省广州市 510515
项目负责人 王立生第一军医大学南方医院全军消化内科研究所 广东省广州市 510515
收稿日期 1999-04-08 接收日期 1999-06-23
Subject headings bifidobacterium; peptidoglycan; colorectal neoplasms；apoptosis
主题词 双歧杆菌；肽聚糖；细胞凋亡
完整肽多糖(Whole peptidoglycan, WPG)是双歧杆菌细胞壁的最主要成分，在体内能抑制多种肿瘤的发生与发展，但其抑瘤机制尚未完全阐明[1]. WPG对肿瘤细胞凋亡的影响尚未见报道. 本文以大肠癌裸鼠移植瘤为动物模型，用原位末端标记法(In situ end labeling, ISEL)观察了大肠癌移植瘤凋亡细胞的分布及其数量，旨在探讨它的抑瘤机制.
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1 材料和方法
1.1 材料 BALB/c(nu/nu)6～8周龄，♀，体重约18g～22g，购于本校实验动物中心，并饲养于其SPF级动物室. dNTP及biotin UTP购自德国宝灵曼公司，Klenow大片段为Promega公司产品，胃蛋白酶购于Sigma公司，辣根过氧化物标记亲和素(HRP-Avidin)购自北京中山生物技术公司，RPMI-1640购于Gibco公司. WPG按Sekine介绍的方法从分叉双歧杆菌细胞壁中提取而成，并经过鉴定[2]. 由重庆医科大学检验系胡宏教授惠赠. Lovo细胞株为人未分化结肠细胞，引自本校病理教研室. 按常规传代于含100mL/L小牛血清的RPMI-1640培养液中，待细胞长至单层后，以2.5g/L胰蛋白酶消化贴壁细胞，收集并调整细胞数为1×1010/L.
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1.2 方法
1.2.1 大肠癌裸鼠移植瘤模型的建立及WPG的处理 肿瘤对照组：20只裸小鼠，实验的d1将1×109/L (0.2mL)的Lovo细胞接种于裸小鼠的左前肢背部皮下，d2起腹腔注射PBS液0.2mL，1次/d，连续5d；WPG注射组：20只裸小鼠，实验的d1接种的Lovo细胞数量、部位、程序同肿瘤对照组，d2起腹腔注射分叉双歧杆菌的完整肽聚糖0.25mg(1×109个双歧杆菌)，1次/d，连续5d，于实验的d21处死动物，剥离瘤体，取材，按常规以100mL/L中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，片厚约4μm，贴于明胶处理过的载玻片上， 组织学检查证实为未分化大肠腺癌.
1.2.2 原位末端标记法染色 按谭晓华et al[3]介绍的方法进行. 切片常规脱蜡，梯度乙醇、水化；切片浸入2×SSC液中
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(含300mmol/L氯化钠，30mmol/L柠檬酸钠，pH 7.0)，80℃浸泡20min；5g/L胃蛋白酶(pH 2.0)37℃消化10min；滴加Buffer A液(含50mmol/L Tris_HCl, 5mmol/L MgCl2. 10mmol/L β-巯基乙醇，0.05g/L BSA pH 7.5)，室温放置5min，弃去Buffer A液，滴加标记液50μL(含0.005mmol/L dNTP， 0.005mmol/L biotin-16-dUTP, 25kU/L Klenow大片段)，25℃温育1h；滴加10mL/L H2O2-甲醇溶液，室温15min，以阻断内源性过氧化物酶，滴加HRP-Avidin 50μL，37℃ 30min；DAB-H2O2显色，苏木素复染，常规脱水，透明，封片. 以上除第(4)步骤外，每一步骤间均以PBS液振洗3次，每次3min，阴性对照片于第5步改加不含Klenow大片段的标记液，余相同. ISEL阳性细胞核呈棕黄色，背景清晰，在显微镜下用16D目镜测微器计数网格中的阳性细胞数，共计数500个细胞，取其均值作为每例的阳性细胞密度. 组间均数以t检验作统计学处理.
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2 结果
ISEL阳性细胞核呈棕黄色，背景清晰. 肿瘤对照组移植瘤的ISEL阳性细胞呈散在分布，数量极少，其阳性细胞数量为21个±9个. WPG注射组的ISEL阳性细胞呈片状或弥漫分布，阳性细胞数量为248个±15个，明显多于肿瘤对照组(P<0.01).
3 讨论
细胞凋亡是有核细胞在一定条件下启动自身内部调节机制而发生的细胞死亡. 目前检测细胞凋亡的手段和方法主要有电镜，流式细胞仪，DNA降解片段的凝胶电泳及ISEL等. 其中ISEL可用于常规石蜡切片，染色结果能与组织学结构相对比，因而能确定凋亡细胞的部位. 此外由于该法具有较高的敏感性，放大作用强，只要存在少量的DNA断裂即可出现阳性反应，因而它不仅能原位检测凋亡细胞，而且还能观察到早期凋亡细胞的存在[4] . 本文用该法观察了分叉双歧杆菌的WPG对大肠癌移植瘤细胞的影响 发现肿瘤对照组仅见极少量散在分布的ISEL阳性细胞，而WPG注射组则可见多量的阳性细胞呈片状或弥漫分布，提示分叉双歧杆菌的WPG能诱导大肠癌转移细胞的凋亡.
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WPG作为双歧杆菌细胞壁中的固有成分，它保持了全菌的一些重要生物学特性，如抗感染，抗衰老，抗突变及免疫赋活等. 此外它在体内具有显著的抑瘤效应. Sekine et al[1]，证实婴儿型双歧杆菌的WPG能显著抑制小鼠皮下移植的Meth A纤维肉瘤的生长. Ishihara et al[5]将青春型双歧杆菌的WPG注射于恶性黑素瘤患者的皮肤转移灶内，发现它能使肿瘤转移灶体积明显缩小，效果和IFN-γ相当，并且无任何毒副作用. 我们也观察到分叉双歧杆菌的WPG对大肠癌裸鼠转移瘤的生长具有明显的抑制作用. 目前认为WPG的抑瘤机制主要是通过激活机体免疫系统的巨噬细胞和NK细胞，使之产生多量的IL-1，IL-6，TNF-α及IFN-γ等细胞毒性效应分子[6]. 结合本文实验结果，我们认为WPG的另一抑瘤途径是诱导肿瘤细胞的凋亡.
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4 参考文献
1 Sekine K, Ohta J, Ohnishi M, Nicaide K. significance of bacterial structure of WPG related to antitumoral activity,Biotherapy, 1990;6:329-335
2 乐军. 胡宏. 双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖的分离纯化. 中国微生态学杂志，1997；9：10-13
3 谭晓华，张亚历，姜泊，李明松，周殿元. 常规组织切片凋亡细胞原位末端标记方法，细胞生物学杂志，1997；19：48-50
4 Gavrieli Y, Sherman Y, Shmuel A, Sasson B. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear
, 百拇医药
DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992;119:493-501
5 Ishihara K. Hayasaka K, Yamazaki N, Cortot A. Current status of melanoma treatment with interferon, cytokines and other
biological response modifiers in Japan. J Invest Dermatol, 1989;92(5 Suppl)326S-328S
6 Sekine K, Ohta J, Pnishi M, Tatsuki T, Shimokawa Y. Toida T, Kawashima T, Hashimoto Y. Analysis of antitumor properties of
effector cells stimulated with a cell wall preparation (WPG) of bifidobacterium infantis. Biol Pharm Bull, 1995;18:148-153, 百拇医药(原位末端标记法检测双歧杆菌的完整肽聚糖诱导实验性大肠癌的凋亡 王立生 潘令嘉 李明松 )
项目负责人 王立生第一军医大学南方医院全军消化内科研究所 广东省广州市 510515
收稿日期 1999-04-08 接收日期 1999-06-23
Subject headings bifidobacterium; peptidoglycan; colorectal neoplasms；apoptosis
主题词 双歧杆菌；肽聚糖；细胞凋亡
完整肽多糖(Whole peptidoglycan, WPG)是双歧杆菌细胞壁的最主要成分，在体内能抑制多种肿瘤的发生与发展，但其抑瘤机制尚未完全阐明[1]. WPG对肿瘤细胞凋亡的影响尚未见报道. 本文以大肠癌裸鼠移植瘤为动物模型，用原位末端标记法(In situ end labeling, ISEL)观察了大肠癌移植瘤凋亡细胞的分布及其数量，旨在探讨它的抑瘤机制.
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1 材料和方法
1.1 材料 BALB/c(nu/nu)6～8周龄，♀，体重约18g～22g，购于本校实验动物中心，并饲养于其SPF级动物室. dNTP及biotin UTP购自德国宝灵曼公司，Klenow大片段为Promega公司产品，胃蛋白酶购于Sigma公司，辣根过氧化物标记亲和素(HRP-Avidin)购自北京中山生物技术公司，RPMI-1640购于Gibco公司. WPG按Sekine介绍的方法从分叉双歧杆菌细胞壁中提取而成，并经过鉴定[2]. 由重庆医科大学检验系胡宏教授惠赠. Lovo细胞株为人未分化结肠细胞，引自本校病理教研室. 按常规传代于含100mL/L小牛血清的RPMI-1640培养液中，待细胞长至单层后，以2.5g/L胰蛋白酶消化贴壁细胞，收集并调整细胞数为1×1010/L.
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1.2 方法
1.2.1 大肠癌裸鼠移植瘤模型的建立及WPG的处理 肿瘤对照组：20只裸小鼠，实验的d1将1×109/L (0.2mL)的Lovo细胞接种于裸小鼠的左前肢背部皮下，d2起腹腔注射PBS液0.2mL，1次/d，连续5d；WPG注射组：20只裸小鼠，实验的d1接种的Lovo细胞数量、部位、程序同肿瘤对照组，d2起腹腔注射分叉双歧杆菌的完整肽聚糖0.25mg(1×109个双歧杆菌)，1次/d，连续5d，于实验的d21处死动物，剥离瘤体，取材，按常规以100mL/L中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，片厚约4μm，贴于明胶处理过的载玻片上， 组织学检查证实为未分化大肠腺癌.
1.2.2 原位末端标记法染色 按谭晓华et al[3]介绍的方法进行. 切片常规脱蜡，梯度乙醇、水化；切片浸入2×SSC液中
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(含300mmol/L氯化钠，30mmol/L柠檬酸钠，pH 7.0)，80℃浸泡20min；5g/L胃蛋白酶(pH 2.0)37℃消化10min；滴加Buffer A液(含50mmol/L Tris_HCl, 5mmol/L MgCl2. 10mmol/L β-巯基乙醇，0.05g/L BSA pH 7.5)，室温放置5min，弃去Buffer A液，滴加标记液50μL(含0.005mmol/L dNTP， 0.005mmol/L biotin-16-dUTP, 25kU/L Klenow大片段)，25℃温育1h；滴加10mL/L H2O2-甲醇溶液，室温15min，以阻断内源性过氧化物酶，滴加HRP-Avidin 50μL，37℃ 30min；DAB-H2O2显色，苏木素复染，常规脱水，透明，封片. 以上除第(4)步骤外，每一步骤间均以PBS液振洗3次，每次3min，阴性对照片于第5步改加不含Klenow大片段的标记液，余相同. ISEL阳性细胞核呈棕黄色，背景清晰，在显微镜下用16D目镜测微器计数网格中的阳性细胞数，共计数500个细胞，取其均值作为每例的阳性细胞密度. 组间均数以t检验作统计学处理.
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2 结果
ISEL阳性细胞核呈棕黄色，背景清晰. 肿瘤对照组移植瘤的ISEL阳性细胞呈散在分布，数量极少，其阳性细胞数量为21个±9个. WPG注射组的ISEL阳性细胞呈片状或弥漫分布，阳性细胞数量为248个±15个，明显多于肿瘤对照组(P<0.01).
3 讨论
细胞凋亡是有核细胞在一定条件下启动自身内部调节机制而发生的细胞死亡. 目前检测细胞凋亡的手段和方法主要有电镜，流式细胞仪，DNA降解片段的凝胶电泳及ISEL等. 其中ISEL可用于常规石蜡切片，染色结果能与组织学结构相对比，因而能确定凋亡细胞的部位. 此外由于该法具有较高的敏感性，放大作用强，只要存在少量的DNA断裂即可出现阳性反应，因而它不仅能原位检测凋亡细胞，而且还能观察到早期凋亡细胞的存在[4] . 本文用该法观察了分叉双歧杆菌的WPG对大肠癌移植瘤细胞的影响 发现肿瘤对照组仅见极少量散在分布的ISEL阳性细胞，而WPG注射组则可见多量的阳性细胞呈片状或弥漫分布，提示分叉双歧杆菌的WPG能诱导大肠癌转移细胞的凋亡.
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WPG作为双歧杆菌细胞壁中的固有成分，它保持了全菌的一些重要生物学特性，如抗感染，抗衰老，抗突变及免疫赋活等. 此外它在体内具有显著的抑瘤效应. Sekine et al[1]，证实婴儿型双歧杆菌的WPG能显著抑制小鼠皮下移植的Meth A纤维肉瘤的生长. Ishihara et al[5]将青春型双歧杆菌的WPG注射于恶性黑素瘤患者的皮肤转移灶内，发现它能使肿瘤转移灶体积明显缩小，效果和IFN-γ相当，并且无任何毒副作用. 我们也观察到分叉双歧杆菌的WPG对大肠癌裸鼠转移瘤的生长具有明显的抑制作用. 目前认为WPG的抑瘤机制主要是通过激活机体免疫系统的巨噬细胞和NK细胞，使之产生多量的IL-1，IL-6，TNF-α及IFN-γ等细胞毒性效应分子[6]. 结合本文实验结果，我们认为WPG的另一抑瘤途径是诱导肿瘤细胞的凋亡.
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4 参考文献
1 Sekine K, Ohta J, Ohnishi M, Nicaide K. significance of bacterial structure of WPG related to antitumoral activity,Biotherapy, 1990;6:329-335
2 乐军. 胡宏. 双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖的分离纯化. 中国微生态学杂志，1997；9：10-13
3 谭晓华，张亚历，姜泊，李明松，周殿元. 常规组织切片凋亡细胞原位末端标记方法，细胞生物学杂志，1997；19：48-50
4 Gavrieli Y, Sherman Y, Shmuel A, Sasson B. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear
, 百拇医药
DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992;119:493-501
5 Ishihara K. Hayasaka K, Yamazaki N, Cortot A. Current status of melanoma treatment with interferon, cytokines and other
biological response modifiers in Japan. J Invest Dermatol, 1989;92(5 Suppl)326S-328S
6 Sekine K, Ohta J, Pnishi M, Tatsuki T, Shimokawa Y. Toida T, Kawashima T, Hashimoto Y. Analysis of antitumor properties of
effector cells stimulated with a cell wall preparation (WPG) of bifidobacterium infantis. Biol Pharm Bull, 1995;18:148-153, 百拇医药(原位末端标记法检测双歧杆菌的完整肽聚糖诱导实验性大肠癌的凋亡 王立生 潘令嘉 李明松 )