用激光扫描共聚焦显微镜的软件进行消化学分子共存分析
作者：王春梅 黄晓峰 戴晓汶 潘伯荣 李振江 冯蕾
单位：王春梅 中国人民解放军第四军医大学 电镜室 陕西省西安市 710033；潘伯荣 中国人民解放军第四军医大学 长城医学信息网 陕西省西安市 710033；冯蕾 中国人民解放军第四军医大学 中心实验室 陕西省西安市 710033；黄晓峰 戴晓汶 李振江 中国人民解放军117医院病理科 浙江省杭州市 310013
关键词：激光扫描共聚焦显微镜；软件；消化学；分子共存分析
世界华人消化杂志990904 摘要 目的 如何应用激光扫描共聚焦显微镜的Lasersharp软件进行分子共存分析. 方法 使用Bio-Rad公司的Lasersharp软件分析肝癌和胃组织细胞中不同分子的共存. 结果 仔细进行样本制备和图象采集才能得到分子共存的可靠结果. 所有抗体应严格设立对照，确保抗体的特异性，并无交叉反应. 同时进行两个分子荧光标记，应使用间接荧光标记技术. 荧光素的发射波长应无重叠，如用Alexa488和丽丝胺罗丹明或Texas Red. 发射滤光片应达到可最大采集，同时又避免与其他荧光素发射光谱的相互渗透. 通常应用的一对荧光素是FITC和TRITC或FITC和Texas Red. 用抗体和共聚焦显微镜进行共存研究时根据激光光源的差别分别选用不同的荧光素. 当荧光素的发射光谱存在相互渗透时，应分别采集不同荧光素标记的图象. 使用氪/氩激光进行图象采集时，注意仔细平衡激发强度，即使在同时激发的情况下，也可得到充分光谱分离的图象. 结论 在图象采集时避免光谱渗透，并从所有图象中去除背底染色后，Lasersharp共存分析软件包可提供正确的共存系数.
, 百拇医药
中国图书馆分类号 R 57
Molecular co-localization analysis with the software of laser scanning confocal microscope in digestology
WANG Chun-Mei
Department of Electromicroscopy,PAN Bo-Rong
Room 12, Building 621,FENG Lei
Central Laboratory, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China
, 百拇医药
HUANG Xiao-Feng DAI Xiao-Wen LI Zhen-Jiang
Department of Pathology, Chinese PLA 117 Hospital, Hangzhou 310013, Zhejiang Province, China
Abstract AIM To analyse the molecular co-localization with Lasersharp software of laser scanning confocal microscope in digestology.
METHODS Molecular co-localization analysis of liver cancer and stomach tissues was performed with Lasersharp software of laser scanning confocal microscope (Bio-Rad Company). RESULTS Reliable results can be obtained by sufficient careful sample preparation and acquisition. All antibody controls should be established to ensure antibody specificity and no cross reactivity between antibodies. When two molecules are being labelled immunofluorescently, the indirect technique should be used. Fluorochromes should have well separated emissions, e.g., Alexa 488 and Lissamine rhodamine or Texas red. Emission filters should be optimized to maximize emission collection whilst avoiding bleed-through from other fluorochromes. Different fluorochromes should be selected in the molecular co-localization analysis. Sequential image was collected when bleed-through is present. With a Krypton/ Argon laser, careful balancing of the excitation intensities will produce images with sufficient spectral separation even in simultaneous mode. CONCLUSION The Lasersharp software co-localization package can provide valid coefficients if bleed-through is avoided during acquisition and background staining is subtracted from all images.
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Subject headings laser scanning confocal microscope; software; digestology; molecular co_location
0 引言
在生物学意义上，共存指的是两种或两种以上的分子精确的存在于同一空间位置. 这些分子通常是蛋白质分子，可通过荧光标记的相应抗体或探针进行观察. 在进行两种分子共存的研究中，可用绿色荧光抗体标记一种分子，用红色荧光抗体标记另一种分子. 这样任何共存的部位都可显示出黄色或橘色的荧光. 如标本相当薄，用普通荧光显微镜可进行明确的共存程度的评价. 然而，如果标本厚于几微米，就要鉴别这些黄色或橘色的光点是来自同一平面的同一位置呢，还是来自于不同平面的光点垂直重叠上去造成的. 共聚焦和多光子显微镜可很好地解决这一问题.
大多数共聚焦显微镜输出的是由多维体素(Voxel，计算机轴向体层摄影时所扫描的每一象素的体积单位)排列构成的数字信号. 在同一标本的同一部位，一种分子和另一种分子的共存可表示为图象上的体素或在某一特定水平上绿色荧光强度和另一特定水平上红色荧光强度.
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1 材料和方法
1.1 材料 肝癌和胃组织取自解放军117医院，为手术切除标本，经常规福尔马林固定，石蜡包埋后切片，厚5 μm. 所用抗体购自Dako公司和Sigma公司.
1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学染色 按文献[1]描述方法进行.
1.2.2 标本制备和图象采集 为可靠的确定共存的程度，应仔细进行样本制备和图象采集. 另外，在随后的图象分析中还要应用样本制备的知识. 应当清楚，如果在样本制备和图象采集时，不充分注意，软件可能生成误导的数值和图象. 以下各点应充分考虑.
1.2.2.1 抗体对照 所有抗体对照均应严格观察. 若同时进行两个分子荧光标记，提示应该应用间接荧光标记技术，这一技术可增强特异性同时可有信号放大作用. 如有共存或在下述情况下，可出现黄色或橘色的图象：①在两种被检测的分子的抗体存在交叉反应. 因此，进行任何共存的研究前，应进行一系列的未标记或单标记对照以评定交叉反应. ②若第一抗体分子与其他蛋白而不是目标蛋白分子相互作用，也可导致蛋白定位错误. 使背底染色过深而引起分析更为困难. ③荧光素的发射光谱重叠也可引起假阳性结果.
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1.2.2.2 荧光素选择 应尽可能选择发射光谱重叠可能性最小的荧光素. 这是因为绿色的发射光谱和红色的发射光谱可能相互的渗透(bleed-through)，因此可能引起标本上的一些并非有共存的点出现橘色的图象. 两种荧光素中较明亮的一种更易产生渗透现象. 若使用的绿色荧光素的发射光谱较窄，而红色的发射光谱在红色甚至是远红外的区域，则可获得最好的标 记结果. 在标记操作时应注意确保两种荧光探针(fluorophores)有相似的亮度. 应用普通的表面荧光进行检查时，由于人眼对远红外光的不敏感，因此在使用远红外滤光片时有一定的局限性. 这使得凭视觉进行评价十分困难. 因此，大多数使用者倾向于常规应用的一对荧光素是FITC和TRITC(它们的光谱重叠较小)或FITC和Texas Red(它们发射光谱极少重叠). 共聚焦显微镜激光的使用，因为用于观测的是探测头而不是人眼，使得绿色荧光素和远红外荧光素的联合应用成为可能，而且光电倍增管对远红外光更为敏感. 如要观察发射远红外光的荧光素，应考虑应用共聚焦显微镜. 免疫学上应用的发射远红外光线的荧光素不多，一种是Cy5，另一种是allophycocyanine(别藻蓝蛋白). 而且需要红色激光[氪/氩激光，(红色的氦氖Red HeNe)激光或红色二极管(Red diode)激光]. 用抗体和共聚焦显微镜进行共存研究时最好的荧光素组合是：①氩离子激光：Alexa 488或Cy2+Cy3[r-phycoerythrin(藻红蛋白)是最好的，它可以穿透组织到达目标]. 假如TRITC染色足够强的话也可使用Cy2和TRITC. ②氪/ 氩激光：Alexa 488+Lissamine rhodamine(丽丝胺罗丹明)或TRITC，或Texas Red+Cy5. ③氩+绿色氦氖(Green HeNe)激光：Alexa 488或Oregon green或BODIPY-FL+Lissamine rhodamine(丽丝胺罗丹明)或XRITC. ④氩+红色氦氖(Red HeNe)激光：Alexa 488+Cy5. ⑤氩+绿色氦氖(Green HeNe)激光+红色二极管(Red Diode)激光：Alexa 488+Lissamine rhodamine(丽丝胺罗丹明)+Cy5. 若一种探针是标记细胞核的，你可以有更多的选择权，如选7-aminoactinomycin-D(氨基放线菌素D)，其激发波长为543或568 ηm，发射波长为655 ηm.
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1.2.2.3 图象采集 除非你选择的两种荧光素的发射光谱没有重叠，否则只能用断续模式进行图象采集. 如使用的是氪/ 氩激光，仔细平衡激发强度，即使在同时激发的情况下，也可得到充分光谱分离的图象. 正常情况下，可迅速根据图象进行共存评价：若所有各点同时既有红色，又有绿色，可能是交叉反应引起. 假如有明显的绿色点，红色点，也有明显的黄色点，可能有共存现象. 如果用断续模式进行图象采集，在分别采集绿色和红色荧光信号时，应注意将增益(gain)设定到保证红色和绿色荧光信号强度相等，并且在饱和度(saturation)之下. 同样地，black水平应调节至足以去除背底噪音. 总之，确保抗体的特异性，并无交叉反应；荧光素的发射波长应无重叠，如用Alexa 488和Lissamine rhodamine(丽丝胺罗丹明)或Texas Red；发射滤光片应达到可最大采集，同时又避免与其他荧光素发射光谱的相互渗透；当荧光素的发射光谱存在相互渗透时，应分别采集不同荧光素标记的图象.
1.2.3 进行共存分析的理论 LaserSharp3.0版及其以后的版本含有共存分析功能. 程序可计算出一幅双色图象中代表共存部分的两个数值. 这些值称为共存系数(co-localisation coefficient)[1]. 这一计算是根据Pearson相关系数得出的，该系数用于描述图象或图形的重叠程度有良好的可信性. 共存系数根据下列公式进行计算：
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Cred=∑Ri,coloc/ ∑Ri
i i
此处∑Ri， coloc=具有绿色成分的所有红色象素强度的总和
Ri=图象中所有红色象素强度的总和
所以 假如Gi>0，则Ri, coloc=Ri
如果Gi=0，则Ri, coloc=0
Cgreen=∑Gi, coloc/∑Gi
i i
此处Gi，coloc=具有红色成分的所有绿色象素强度的总和
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∑Gi=图象中所有绿色象素强度的总和
所以 假如Ri>0，则Gi, coloc=Gi
如果Ri=0，则Gi, coloc=0系数Cred和图象中红色成分中含有的共存物质的荧光含量和红色成分的荧光总量成比例. 相似的系数Cgreen和图象中绿色成分中含有的共存物质的荧光含量和绿色成分的荧光总量成比例. 共存系数甚至在两种成分的荧光信号强度差别相当强时也可确定. 然而，从公式可看出，这里用共存象素的荧光强度重量(intensity weighting)来反映标记部位的荧光强度和数量的关系. 对于三通道图象，应分别计算出绿色和兰色通道，红色和兰色通道之间的共存系数. 软件提供了独立的背底选择和从图象中去除背底的功能，可在进行共存分析前去除背底. 荧光分析图(fluorogram)既可从整幅图象产生，也可从图象的任何一部分生成. 在这一复合图象(merged image)中，以散点图的方式表示不同颜色象素的强度和分布，允许使用者在散点图上选择象素的子集(subset)使得它在两种颜色上符合一定的强度标准，而后图象上这些象素即突出显示(highlight). 打开一个图象(应是一个含有两种成分的复合图象). 如需要特定的区域，可在SELECT菜单中选择一个包含要分析区域在内的矩形(rectangle)或多边形(polygon)区域. 而后选择image(图象)中的co-localisation(共存分析).
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1.2.4 数值的意义 共存系数总是在0和1之间. 0的意思是没有共存，1表示全部共存. 对于从两种颜色的复合图象中产生的任何一种颜色的共存系数，如Red 0.9，Green 0.45表示具有绿色成分的红色象素的荧光强度与选定区域中所有红色象素的强度的比率是0.9，即共存率相当高. 而具有红色成分的绿色象素的荧光强度与选定区域中总绿色荧光强度之比是0.45. 所以，红色象素与绿色象素的共存度是绿色象素与红色象素共存度的2倍.
2 结果
2.1 特定共存 脑垂体前叶的内分泌细胞用两种促肾上腺皮质激素和嗜铬颗粒素C[2]抗体进行染色. 分别用568 nm和488 nm激发(氩/ 氪激光)，用间断采集方式(sequentially)分别采集红色和绿色图象(图1a). 图1b和1c示LaserSharp共存分析对话框和从复合图象中生成的红色和绿色荧光强度的荧光分析图. 背底和渗透(bleed-through)从数据中(注意：不是从图象中)被选择并去除，同时显示两个共存系数(见后). 红色共存系数是Red=0.83，绿色共存系数是Green=1.0. 这意味着有某些红色象素中没有绿色成分，但它们大部分是共存的. 所有绿色象素都与剩余的红色象素共存. 图2a显示的是如何选择部分荧光分析图来分割图象数据，图2b显示所选择的象素用白色在图象上突出显示.
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图1a 免疫荧光标记垂体前叶内分泌细胞中促肾上腺皮质激素与嗜铬颗粒素，用间段采集方式分别采集红色(TR标记)绿色(FITC标记)以及复合图象.
图1b,1c 示Laser Sharp共存分析对话框和从复合图象中生成的红色(TR标记)和绿色(FITC标记)荧光强度的分析图，共存系数是Red=0.83，Green=1.00
图2a 显示如何选择部分荧光分析图来分割图象数据.
图2b 所选择的象素在图象上用白色突出显示.
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2.2 无共存 图3a显示了一些双标细胞，图象用568 nm和488 nm氩/氪激光激发，同时采集. 从图象可看出，绿色荧光图象的细胞核中有一些红色荧光重叠渗透(bleed-through). 如不去除这种重叠，即进行共存分析，将产生错误. 因此在图3b通过在红色图象中选择一个测量值255和从绿色图象中选择一个测量值208加以去除. 图3b, 3c可看出两者的共存系数如实际情况所示是0.00.
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图3a 免疫荧光双标记胃粘膜上皮细胞以及复合图象，红色为细胞核(TR 标记)，绿色为细胞质(FITC标记).
图3b 共存分析对话框显示双标物质共存系数是Red=0.00；Green=0.00
图3c 共存分析对话框显示双标物质共存系数是Red=0.00；Green=0.00
2.3 完全共存 图4a显示了胃粘膜组织中组织蛋白酶D(Texas Red标记)和嗜铬颗粒素A(FITC 标记)共存的红色图象和绿色图象[3]. 尽管红色和绿色信号的荧光强度有差别，但它们完全共存. 图4b，4c显示计算的共存系数都是1.0，真正反映了实际情况.
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图4a 免疫荧光双标记胃粘膜组织中组织蛋白酶D(TR标记)与嗜铬颗粒素A(FITC标记)共存.
图4b，4c 共存分析对话框显示其共存系数是Red=1.00；Green=1.00
2.4 部分共存 脑垂体前叶的内分泌细胞用两种催乳素(Texas Red标记)和嗜铬颗粒素C(FITC标记)抗体进行染色. 分别用568 nm和488 nm激发(氩/氪激光)，用间断采集方式(sequentially)分别采集红色和绿色图象(图5a)，两者之间有某些共存无背底，红色和绿色成分的荧光强度相似. 图5b, 5c共存分析显示共存系数分别为RED=1.00，GREEN=0.86. 这与实际情况基本相符. 说明所有红色成分都与绿色成分共存，但仅有86%的绿色成分与红色成分共存. 也可大致说明催乳素阳性的细胞中都呈嗜铬颗粒素C阳性. 因为荧光强度相对一致(几乎没有图象噪音)，强度重量值(intensity-weighted value)几乎与图象重叠区域相等.
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图5a 免疫荧光双标记脑垂体前叶内分泌细胞催乳素(TR标记)与嗜铬颗粒素(FITC标记)共存.
图5b，5c 共存分析对话框显示共存系数分别为Red=1.00，Green=0.86
3 总结
LaserSharp共存分析软件包在下列情况下，可提供正确的共存系数：
图象采集时避免光谱渗透(bleed-through).
从所有图象中去除背底染色.
通讯作者 王春梅，710033，陕西省西安市长乐西路17号，第四军医大学电镜室.
作者简介：王春梅，女，河北省人，汉族. 第三军医大学毕业，硕士，现在第四军医大学电子显微镜室工作，主要从事形态学研究，发表论文40篇，获军队科技进步奖1项.
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Correspondence to:WANG Chun-Mei, Department of Electromicroscopy, Fourth Military Medical University, 17 Changle Xilu, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China
Tel. +86.29.3374572， Fax.+86.29.3224890
Email.panbr169@pub.xaonline.com
4 参考文献
1 Manders EEM, Verbeek FJ, Aten JA. Measurement of co-localisation of objects in dual-colour confocal images. J Microsco, 1993;169(Pt3):375-382
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2 Wang CM, Huang XF, Zhao JW, Zhang YQ, Liu HL. Immunohistochemical localization of chromogranin C/ secretogranin Ⅱ in the anterior pituitary and its relationship with adrenocorticotropin-containing cells. Disi Junyi Daxue Xuebao, 1997; 18(Special issue):8-11
3 Wang CM, Huang XF, Pan BR, Dai XW, Ma FC, Zhao YL. Expression of chromogranin C/ secretogranin Ⅱ and pancreastatin in pancreatic ductal carcinoma. Huaren Xiaohua Zazhi, 1998;6:470-473
4 Huang XF, Wang CM，Dai XW, Pan BR, Yu LB, Fang L，Qian B, Zhao YL. Significance of cathepsin D and chromogranin A expression in human primary hepatocellular carcinomas. Huaren Xiaohua Zazhi, 1998;6:474-478
收稿日期 1999-06-28 修回日期 1999-07-12, http://www.100md.com(王春梅1 黄晓峰2 戴晓汶2 潘伯荣3 李振江2 冯蕾4)
单位：王春梅 中国人民解放军第四军医大学 电镜室 陕西省西安市 710033；潘伯荣 中国人民解放军第四军医大学 长城医学信息网 陕西省西安市 710033；冯蕾 中国人民解放军第四军医大学 中心实验室 陕西省西安市 710033；黄晓峰 戴晓汶 李振江 中国人民解放军117医院病理科 浙江省杭州市 310013
关键词：激光扫描共聚焦显微镜；软件；消化学；分子共存分析
世界华人消化杂志990904 摘要 目的 如何应用激光扫描共聚焦显微镜的Lasersharp软件进行分子共存分析. 方法 使用Bio-Rad公司的Lasersharp软件分析肝癌和胃组织细胞中不同分子的共存. 结果 仔细进行样本制备和图象采集才能得到分子共存的可靠结果. 所有抗体应严格设立对照，确保抗体的特异性，并无交叉反应. 同时进行两个分子荧光标记，应使用间接荧光标记技术. 荧光素的发射波长应无重叠，如用Alexa488和丽丝胺罗丹明或Texas Red. 发射滤光片应达到可最大采集，同时又避免与其他荧光素发射光谱的相互渗透. 通常应用的一对荧光素是FITC和TRITC或FITC和Texas Red. 用抗体和共聚焦显微镜进行共存研究时根据激光光源的差别分别选用不同的荧光素. 当荧光素的发射光谱存在相互渗透时，应分别采集不同荧光素标记的图象. 使用氪/氩激光进行图象采集时，注意仔细平衡激发强度，即使在同时激发的情况下，也可得到充分光谱分离的图象. 结论 在图象采集时避免光谱渗透，并从所有图象中去除背底染色后，Lasersharp共存分析软件包可提供正确的共存系数.
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Molecular co-localization analysis with the software of laser scanning confocal microscope in digestology
WANG Chun-Mei
Department of Electromicroscopy,PAN Bo-Rong
Room 12, Building 621,FENG Lei
Central Laboratory, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China
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Department of Pathology, Chinese PLA 117 Hospital, Hangzhou 310013, Zhejiang Province, China
Abstract AIM To analyse the molecular co-localization with Lasersharp software of laser scanning confocal microscope in digestology.
METHODS Molecular co-localization analysis of liver cancer and stomach tissues was performed with Lasersharp software of laser scanning confocal microscope (Bio-Rad Company). RESULTS Reliable results can be obtained by sufficient careful sample preparation and acquisition. All antibody controls should be established to ensure antibody specificity and no cross reactivity between antibodies. When two molecules are being labelled immunofluorescently, the indirect technique should be used. Fluorochromes should have well separated emissions, e.g., Alexa 488 and Lissamine rhodamine or Texas red. Emission filters should be optimized to maximize emission collection whilst avoiding bleed-through from other fluorochromes. Different fluorochromes should be selected in the molecular co-localization analysis. Sequential image was collected when bleed-through is present. With a Krypton/ Argon laser, careful balancing of the excitation intensities will produce images with sufficient spectral separation even in simultaneous mode. CONCLUSION The Lasersharp software co-localization package can provide valid coefficients if bleed-through is avoided during acquisition and background staining is subtracted from all images.
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Subject headings laser scanning confocal microscope; software; digestology; molecular co_location
0 引言
在生物学意义上，共存指的是两种或两种以上的分子精确的存在于同一空间位置. 这些分子通常是蛋白质分子，可通过荧光标记的相应抗体或探针进行观察. 在进行两种分子共存的研究中，可用绿色荧光抗体标记一种分子，用红色荧光抗体标记另一种分子. 这样任何共存的部位都可显示出黄色或橘色的荧光. 如标本相当薄，用普通荧光显微镜可进行明确的共存程度的评价. 然而，如果标本厚于几微米，就要鉴别这些黄色或橘色的光点是来自同一平面的同一位置呢，还是来自于不同平面的光点垂直重叠上去造成的. 共聚焦和多光子显微镜可很好地解决这一问题.
大多数共聚焦显微镜输出的是由多维体素(Voxel，计算机轴向体层摄影时所扫描的每一象素的体积单位)排列构成的数字信号. 在同一标本的同一部位，一种分子和另一种分子的共存可表示为图象上的体素或在某一特定水平上绿色荧光强度和另一特定水平上红色荧光强度.
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1 材料和方法
1.1 材料 肝癌和胃组织取自解放军117医院，为手术切除标本，经常规福尔马林固定，石蜡包埋后切片，厚5 μm. 所用抗体购自Dako公司和Sigma公司.
1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学染色 按文献[1]描述方法进行.
1.2.2 标本制备和图象采集 为可靠的确定共存的程度，应仔细进行样本制备和图象采集. 另外，在随后的图象分析中还要应用样本制备的知识. 应当清楚，如果在样本制备和图象采集时，不充分注意，软件可能生成误导的数值和图象. 以下各点应充分考虑.
1.2.2.1 抗体对照 所有抗体对照均应严格观察. 若同时进行两个分子荧光标记，提示应该应用间接荧光标记技术，这一技术可增强特异性同时可有信号放大作用. 如有共存或在下述情况下，可出现黄色或橘色的图象：①在两种被检测的分子的抗体存在交叉反应. 因此，进行任何共存的研究前，应进行一系列的未标记或单标记对照以评定交叉反应. ②若第一抗体分子与其他蛋白而不是目标蛋白分子相互作用，也可导致蛋白定位错误. 使背底染色过深而引起分析更为困难. ③荧光素的发射光谱重叠也可引起假阳性结果.
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1.2.2.2 荧光素选择 应尽可能选择发射光谱重叠可能性最小的荧光素. 这是因为绿色的发射光谱和红色的发射光谱可能相互的渗透(bleed-through)，因此可能引起标本上的一些并非有共存的点出现橘色的图象. 两种荧光素中较明亮的一种更易产生渗透现象. 若使用的绿色荧光素的发射光谱较窄，而红色的发射光谱在红色甚至是远红外的区域，则可获得最好的标 记结果. 在标记操作时应注意确保两种荧光探针(fluorophores)有相似的亮度. 应用普通的表面荧光进行检查时，由于人眼对远红外光的不敏感，因此在使用远红外滤光片时有一定的局限性. 这使得凭视觉进行评价十分困难. 因此，大多数使用者倾向于常规应用的一对荧光素是FITC和TRITC(它们的光谱重叠较小)或FITC和Texas Red(它们发射光谱极少重叠). 共聚焦显微镜激光的使用，因为用于观测的是探测头而不是人眼，使得绿色荧光素和远红外荧光素的联合应用成为可能，而且光电倍增管对远红外光更为敏感. 如要观察发射远红外光的荧光素，应考虑应用共聚焦显微镜. 免疫学上应用的发射远红外光线的荧光素不多，一种是Cy5，另一种是allophycocyanine(别藻蓝蛋白). 而且需要红色激光[氪/氩激光，(红色的氦氖Red HeNe)激光或红色二极管(Red diode)激光]. 用抗体和共聚焦显微镜进行共存研究时最好的荧光素组合是：①氩离子激光：Alexa 488或Cy2+Cy3[r-phycoerythrin(藻红蛋白)是最好的，它可以穿透组织到达目标]. 假如TRITC染色足够强的话也可使用Cy2和TRITC. ②氪/ 氩激光：Alexa 488+Lissamine rhodamine(丽丝胺罗丹明)或TRITC，或Texas Red+Cy5. ③氩+绿色氦氖(Green HeNe)激光：Alexa 488或Oregon green或BODIPY-FL+Lissamine rhodamine(丽丝胺罗丹明)或XRITC. ④氩+红色氦氖(Red HeNe)激光：Alexa 488+Cy5. ⑤氩+绿色氦氖(Green HeNe)激光+红色二极管(Red Diode)激光：Alexa 488+Lissamine rhodamine(丽丝胺罗丹明)+Cy5. 若一种探针是标记细胞核的，你可以有更多的选择权，如选7-aminoactinomycin-D(氨基放线菌素D)，其激发波长为543或568 ηm，发射波长为655 ηm.
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1.2.2.3 图象采集 除非你选择的两种荧光素的发射光谱没有重叠，否则只能用断续模式进行图象采集. 如使用的是氪/ 氩激光，仔细平衡激发强度，即使在同时激发的情况下，也可得到充分光谱分离的图象. 正常情况下，可迅速根据图象进行共存评价：若所有各点同时既有红色，又有绿色，可能是交叉反应引起. 假如有明显的绿色点，红色点，也有明显的黄色点，可能有共存现象. 如果用断续模式进行图象采集，在分别采集绿色和红色荧光信号时，应注意将增益(gain)设定到保证红色和绿色荧光信号强度相等，并且在饱和度(saturation)之下. 同样地，black水平应调节至足以去除背底噪音. 总之，确保抗体的特异性，并无交叉反应；荧光素的发射波长应无重叠，如用Alexa 488和Lissamine rhodamine(丽丝胺罗丹明)或Texas Red；发射滤光片应达到可最大采集，同时又避免与其他荧光素发射光谱的相互渗透；当荧光素的发射光谱存在相互渗透时，应分别采集不同荧光素标记的图象.
1.2.3 进行共存分析的理论 LaserSharp3.0版及其以后的版本含有共存分析功能. 程序可计算出一幅双色图象中代表共存部分的两个数值. 这些值称为共存系数(co-localisation coefficient)[1]. 这一计算是根据Pearson相关系数得出的，该系数用于描述图象或图形的重叠程度有良好的可信性. 共存系数根据下列公式进行计算：
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Cred=∑Ri,coloc/ ∑Ri
i i
此处∑Ri， coloc=具有绿色成分的所有红色象素强度的总和
Ri=图象中所有红色象素强度的总和
所以 假如Gi>0，则Ri, coloc=Ri
如果Gi=0，则Ri, coloc=0
Cgreen=∑Gi, coloc/∑Gi
i i
此处Gi，coloc=具有红色成分的所有绿色象素强度的总和
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∑Gi=图象中所有绿色象素强度的总和
所以 假如Ri>0，则Gi, coloc=Gi
如果Ri=0，则Gi, coloc=0系数Cred和图象中红色成分中含有的共存物质的荧光含量和红色成分的荧光总量成比例. 相似的系数Cgreen和图象中绿色成分中含有的共存物质的荧光含量和绿色成分的荧光总量成比例. 共存系数甚至在两种成分的荧光信号强度差别相当强时也可确定. 然而，从公式可看出，这里用共存象素的荧光强度重量(intensity weighting)来反映标记部位的荧光强度和数量的关系. 对于三通道图象，应分别计算出绿色和兰色通道，红色和兰色通道之间的共存系数. 软件提供了独立的背底选择和从图象中去除背底的功能，可在进行共存分析前去除背底. 荧光分析图(fluorogram)既可从整幅图象产生，也可从图象的任何一部分生成. 在这一复合图象(merged image)中，以散点图的方式表示不同颜色象素的强度和分布，允许使用者在散点图上选择象素的子集(subset)使得它在两种颜色上符合一定的强度标准，而后图象上这些象素即突出显示(highlight). 打开一个图象(应是一个含有两种成分的复合图象). 如需要特定的区域，可在SELECT菜单中选择一个包含要分析区域在内的矩形(rectangle)或多边形(polygon)区域. 而后选择image(图象)中的co-localisation(共存分析).
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1.2.4 数值的意义 共存系数总是在0和1之间. 0的意思是没有共存，1表示全部共存. 对于从两种颜色的复合图象中产生的任何一种颜色的共存系数，如Red 0.9，Green 0.45表示具有绿色成分的红色象素的荧光强度与选定区域中所有红色象素的强度的比率是0.9，即共存率相当高. 而具有红色成分的绿色象素的荧光强度与选定区域中总绿色荧光强度之比是0.45. 所以，红色象素与绿色象素的共存度是绿色象素与红色象素共存度的2倍.
2 结果
2.1 特定共存 脑垂体前叶的内分泌细胞用两种促肾上腺皮质激素和嗜铬颗粒素C[2]抗体进行染色. 分别用568 nm和488 nm激发(氩/ 氪激光)，用间断采集方式(sequentially)分别采集红色和绿色图象(图1a). 图1b和1c示LaserSharp共存分析对话框和从复合图象中生成的红色和绿色荧光强度的荧光分析图. 背底和渗透(bleed-through)从数据中(注意：不是从图象中)被选择并去除，同时显示两个共存系数(见后). 红色共存系数是Red=0.83，绿色共存系数是Green=1.0. 这意味着有某些红色象素中没有绿色成分，但它们大部分是共存的. 所有绿色象素都与剩余的红色象素共存. 图2a显示的是如何选择部分荧光分析图来分割图象数据，图2b显示所选择的象素用白色在图象上突出显示.
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图1a 免疫荧光标记垂体前叶内分泌细胞中促肾上腺皮质激素与嗜铬颗粒素，用间段采集方式分别采集红色(TR标记)绿色(FITC标记)以及复合图象.
图1b,1c 示Laser Sharp共存分析对话框和从复合图象中生成的红色(TR标记)和绿色(FITC标记)荧光强度的分析图，共存系数是Red=0.83，Green=1.00
图2a 显示如何选择部分荧光分析图来分割图象数据.
图2b 所选择的象素在图象上用白色突出显示.
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2.2 无共存 图3a显示了一些双标细胞，图象用568 nm和488 nm氩/氪激光激发，同时采集. 从图象可看出，绿色荧光图象的细胞核中有一些红色荧光重叠渗透(bleed-through). 如不去除这种重叠，即进行共存分析，将产生错误. 因此在图3b通过在红色图象中选择一个测量值255和从绿色图象中选择一个测量值208加以去除. 图3b, 3c可看出两者的共存系数如实际情况所示是0.00.
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图3a 免疫荧光双标记胃粘膜上皮细胞以及复合图象，红色为细胞核(TR 标记)，绿色为细胞质(FITC标记).
图3b 共存分析对话框显示双标物质共存系数是Red=0.00；Green=0.00
图3c 共存分析对话框显示双标物质共存系数是Red=0.00；Green=0.00
2.3 完全共存 图4a显示了胃粘膜组织中组织蛋白酶D(Texas Red标记)和嗜铬颗粒素A(FITC 标记)共存的红色图象和绿色图象[3]. 尽管红色和绿色信号的荧光强度有差别，但它们完全共存. 图4b，4c显示计算的共存系数都是1.0，真正反映了实际情况.
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图4a 免疫荧光双标记胃粘膜组织中组织蛋白酶D(TR标记)与嗜铬颗粒素A(FITC标记)共存.
图4b，4c 共存分析对话框显示其共存系数是Red=1.00；Green=1.00
2.4 部分共存 脑垂体前叶的内分泌细胞用两种催乳素(Texas Red标记)和嗜铬颗粒素C(FITC标记)抗体进行染色. 分别用568 nm和488 nm激发(氩/氪激光)，用间断采集方式(sequentially)分别采集红色和绿色图象(图5a)，两者之间有某些共存无背底，红色和绿色成分的荧光强度相似. 图5b, 5c共存分析显示共存系数分别为RED=1.00，GREEN=0.86. 这与实际情况基本相符. 说明所有红色成分都与绿色成分共存，但仅有86%的绿色成分与红色成分共存. 也可大致说明催乳素阳性的细胞中都呈嗜铬颗粒素C阳性. 因为荧光强度相对一致(几乎没有图象噪音)，强度重量值(intensity-weighted value)几乎与图象重叠区域相等.
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图5a 免疫荧光双标记脑垂体前叶内分泌细胞催乳素(TR标记)与嗜铬颗粒素(FITC标记)共存.
图5b，5c 共存分析对话框显示共存系数分别为Red=1.00，Green=0.86
3 总结
LaserSharp共存分析软件包在下列情况下，可提供正确的共存系数：
图象采集时避免光谱渗透(bleed-through).
从所有图象中去除背底染色.
通讯作者 王春梅，710033，陕西省西安市长乐西路17号，第四军医大学电镜室.
作者简介：王春梅，女，河北省人，汉族. 第三军医大学毕业，硕士，现在第四军医大学电子显微镜室工作，主要从事形态学研究，发表论文40篇，获军队科技进步奖1项.
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Correspondence to:WANG Chun-Mei, Department of Electromicroscopy, Fourth Military Medical University, 17 Changle Xilu, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China
Tel. +86.29.3374572， Fax.+86.29.3224890
Email.panbr169@pub.xaonline.com
4 参考文献
1 Manders EEM, Verbeek FJ, Aten JA. Measurement of co-localisation of objects in dual-colour confocal images. J Microsco, 1993;169(Pt3):375-382
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2 Wang CM, Huang XF, Zhao JW, Zhang YQ, Liu HL. Immunohistochemical localization of chromogranin C/ secretogranin Ⅱ in the anterior pituitary and its relationship with adrenocorticotropin-containing cells. Disi Junyi Daxue Xuebao, 1997; 18(Special issue):8-11
3 Wang CM, Huang XF, Pan BR, Dai XW, Ma FC, Zhao YL. Expression of chromogranin C/ secretogranin Ⅱ and pancreastatin in pancreatic ductal carcinoma. Huaren Xiaohua Zazhi, 1998;6:470-473
4 Huang XF, Wang CM，Dai XW, Pan BR, Yu LB, Fang L，Qian B, Zhao YL. Significance of cathepsin D and chromogranin A expression in human primary hepatocellular carcinomas. Huaren Xiaohua Zazhi, 1998;6:474-478
收稿日期 1999-06-28 修回日期 1999-07-12, http://www.100md.com(王春梅1 黄晓峰2 戴晓汶2 潘伯荣3 李振江2 冯蕾4)