大鼠肝纤维化基质金属蛋白酶及其抑制因子的表达
1中国人民解放军第一军医大学南方医院肝胆血管外科 广东省广州市 510515
2中国人民解放军第一军医大学珠江医院肝胆外科 广东省广州市 510282
项目负责人 黄宇琦中国人民解放军第一军医大学南方医院肝胆血管外科 广东省广州市 510515
收稿日期 1999-04-28
Subject headings liver cirrhosis; metalloproteinase; gene expression
主题词 肝硬化；金属蛋白酶；基因表达
, http://www.100md.com
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一族依赖Zn离子而降解各种细胞外基质的蛋白酶. 肝内主要基质金属蛋白酶MMP-1，MMP-2和组织金属蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1)表达不平衡与肝纤维化的发生发展紧密相关.
1 材料和方法
清洁型Wistar♂大鼠140只，分肝纤维化模型组和正常对照组各70只. 两组动物按预定处死时间点各分为7个亚组. 应用40%(V/V)CCl4纯花生油溶液予肝纤维化模型组大鼠腹腔内注射，0.2mL/100g，2次/wk，对照组用生理盐水代替CCl4作腹腔内注射，在0，2，5，7，9，11，13wk时模型组与对照组分别活杀6只～8只，切取肝脏右叶迅速投入液氮后转入-70℃保存待用. 应用SABC免疫组化法测定MMP-1，MMP-2和TIMP-1酶蛋白；同时根据Genebank资料设计MMP-1，MMP-2及TIMP-1基因序列引物，一步法抽提标本总RNA，同条件下进行RT-PCR. 产物经2%琼脂糖凝胶电泳后进行凝胶成象扫描定量分析. 采用看家基因GAPDH mRNA表达值作参照，计算MMP-1，MMP-2和TIMP-1 mRNA表达相对值.
, 百拇医药
2 结果
免疫组化检测MMP-1，MMP-2和TIMP-1酶蛋白的表达时发现无论正常肝脏还是受损伤的肝脏都有阳性着色，正常肝脏组织中阳性着色仅出现于汇管区血管壁或胆管壁周围. 损伤早期肝组织在肝窦周围细胞亦有散在阳性着色. 但纤维分隔形成之后阳性着色即明显集中在增生的纤维条索板表面或中间. 相比而言，MMP-2和TIMP-1的阳性着色比MMP-1要显著. 尤其是TIMP-1随着纤维化的发展表达更突出. 动态mRNA表达水平分析显示，MMP-1表达值相对恒定；MMP-2表达值有缓慢上升，在进展期(9wk)最高；TIMP-1表达值则呈逐步上升趋势，晚期(13wk)纤维化时达到最高峰. 三者mRNA表达相对值(x±s)在0，2，9， 13wk时分别是：MMP-1为0.35±0.12，0.38±0.09，0.37±0.21，0.33±0.15，P>0.05；MMP-2为0.65±0.19，1.07±0.31，6.83±1.25，3.05±0.68，P<0.05；TIMP-1为0.52±0.17，2.65±0.51，5.46±0.87，7.11±1.02，P<0.01.
, 百拇医药
3 讨论
肝纤维化是肝脏受损伤之后细胞外基质尤其Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原过度增生沉积、降解减少造成的病理性结果. 具有降解细胞外基质功能的基质金属蛋白酶及其抑制因子在纤维化形成过程中发挥重要的作用. TIMP-1不但可以抑制MMP-1和MMP-2酶原的活化，而且可以与活性化的MMP相结合导致MMP失去降解功能. 本实验表明虽然MMP-1，MMP-2在肝纤维化过程中表达并无下降，甚至MMP-2还有缓慢表达增加，但是由于TIMP-1表达逐渐增强，所以大大抑制前二者的活化和活性. MMP-1，MMP-2与TIMP-1之间相互作用的正常动态平衡被破坏，增生的胶原纤维等细胞外基质降解减少，沉积增多，促进了肝纤维化的形成. 因此我们认为通过上调MMP-1，MMP-2或下调TIMP-1基因表达以及抑制TIMP-1活性将是治疗肝纤维化的新途径., 百拇医药(黄宇琦1 高 毅2 杨继震2 方石岗2 王 宇2)
2中国人民解放军第一军医大学珠江医院肝胆外科 广东省广州市 510282
项目负责人 黄宇琦中国人民解放军第一军医大学南方医院肝胆血管外科 广东省广州市 510515
收稿日期 1999-04-28
Subject headings liver cirrhosis; metalloproteinase; gene expression
主题词 肝硬化；金属蛋白酶；基因表达
, http://www.100md.com
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一族依赖Zn离子而降解各种细胞外基质的蛋白酶. 肝内主要基质金属蛋白酶MMP-1，MMP-2和组织金属蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1)表达不平衡与肝纤维化的发生发展紧密相关.
1 材料和方法
清洁型Wistar♂大鼠140只，分肝纤维化模型组和正常对照组各70只. 两组动物按预定处死时间点各分为7个亚组. 应用40%(V/V)CCl4纯花生油溶液予肝纤维化模型组大鼠腹腔内注射，0.2mL/100g，2次/wk，对照组用生理盐水代替CCl4作腹腔内注射，在0，2，5，7，9，11，13wk时模型组与对照组分别活杀6只～8只，切取肝脏右叶迅速投入液氮后转入-70℃保存待用. 应用SABC免疫组化法测定MMP-1，MMP-2和TIMP-1酶蛋白；同时根据Genebank资料设计MMP-1，MMP-2及TIMP-1基因序列引物，一步法抽提标本总RNA，同条件下进行RT-PCR. 产物经2%琼脂糖凝胶电泳后进行凝胶成象扫描定量分析. 采用看家基因GAPDH mRNA表达值作参照，计算MMP-1，MMP-2和TIMP-1 mRNA表达相对值.
, 百拇医药
2 结果
免疫组化检测MMP-1，MMP-2和TIMP-1酶蛋白的表达时发现无论正常肝脏还是受损伤的肝脏都有阳性着色，正常肝脏组织中阳性着色仅出现于汇管区血管壁或胆管壁周围. 损伤早期肝组织在肝窦周围细胞亦有散在阳性着色. 但纤维分隔形成之后阳性着色即明显集中在增生的纤维条索板表面或中间. 相比而言，MMP-2和TIMP-1的阳性着色比MMP-1要显著. 尤其是TIMP-1随着纤维化的发展表达更突出. 动态mRNA表达水平分析显示，MMP-1表达值相对恒定；MMP-2表达值有缓慢上升，在进展期(9wk)最高；TIMP-1表达值则呈逐步上升趋势，晚期(13wk)纤维化时达到最高峰. 三者mRNA表达相对值(x±s)在0，2，9， 13wk时分别是：MMP-1为0.35±0.12，0.38±0.09，0.37±0.21，0.33±0.15，P>0.05；MMP-2为0.65±0.19，1.07±0.31，6.83±1.25，3.05±0.68，P<0.05；TIMP-1为0.52±0.17，2.65±0.51，5.46±0.87，7.11±1.02，P<0.01.
, 百拇医药
3 讨论
肝纤维化是肝脏受损伤之后细胞外基质尤其Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原过度增生沉积、降解减少造成的病理性结果. 具有降解细胞外基质功能的基质金属蛋白酶及其抑制因子在纤维化形成过程中发挥重要的作用. TIMP-1不但可以抑制MMP-1和MMP-2酶原的活化，而且可以与活性化的MMP相结合导致MMP失去降解功能. 本实验表明虽然MMP-1，MMP-2在肝纤维化过程中表达并无下降，甚至MMP-2还有缓慢表达增加，但是由于TIMP-1表达逐渐增强，所以大大抑制前二者的活化和活性. MMP-1，MMP-2与TIMP-1之间相互作用的正常动态平衡被破坏，增生的胶原纤维等细胞外基质降解减少，沉积增多，促进了肝纤维化的形成. 因此我们认为通过上调MMP-1，MMP-2或下调TIMP-1基因表达以及抑制TIMP-1活性将是治疗肝纤维化的新途径., 百拇医药(黄宇琦1 高 毅2 杨继震2 方石岗2 王 宇2)