转染Bcl-2反义核酸对胃癌细胞药物敏感性的影响
1中国人民解放军海军313医院内二科 辽宁省葫芦岛市 125000
2中国人民解放军第四军医大学消化疾病研究所 陕西省西安市 710033
项目负责人 王佐佑中国人民解放军海军313医院内二科 辽宁省葫芦岛市 125000
收稿日期 1999-04-15 接收日期 1999-06-03
Subject headings stomach neoplasms/drug therapy; oligonucleotides, antisense; Bcl-2 protooncogene
主题词 胃肿瘤/药物疗法；寡核苷酸类，反义；Bcl-2原癌基因
, http://www.100md.com
以手术根治为主的胃癌综合治疗，五年生存率只有37.7%，对胃癌的化疗并未取得理想的效果[1]. Bcl-2基因的异常表达，不仅与胃癌的发生有关，其抗凋亡作用的发挥，势必影响化疗效果[2]；肿瘤细胞对化疗药物存在多药耐药现象，缘于多种机制，Bcl-2基因的异常表达可能与之有关[3]. 我们通过pDOR载体将Bcl-2反义核酸转染胃癌细胞，观察转导细胞对化疗药物顺铂(DDP)、5-氟脲嘧啶(5-FU)、长春新碱(VCR)的敏感性调变，能否逆转耐药，为胃癌的治疗探索新的途径.
1 材料和方法
1.1 材料 人胃癌细胞SGC7901引自军科院，本所保存150mL/L小牛血清的PRM1640培养传代(37℃、饱和湿度、50mL/L 二氧化碳)；耐药细胞SGC/VCR本所建系，0.1mg/L终浓度培养维持耐药. 转染Bcl-2反义核酸的胃癌细胞AntiBcl-27901，AntiBcl-2/VCR由肖冰博士后提供，系利用限制性内切酶技术构建Bcl-2反义核酸真核表达载体，脂质体介导转染SGC7901，SGC/VCR，经4wk G418筛选，克隆细胞扩增培养建系.
, 百拇医药
1.2 方法 取对数生长期的细胞，计数后接种96孔板，培养24h，加药. 药物浓度按小、正常、大浓度设置，正常浓度mg/L=(mg×体表面积)/体质量×100÷60，小浓度为正常浓度的1/10，大浓度则是其10倍，各组均设对照，100mL/L小牛血清的PRM1640培养72h后，每孔加50g/L MTT 20μL，继续培养4h，弃上清，加DMSO 150μL，待结晶完全溶解，测A490nm (OD)值，计算抑瘤率.
2 结果
转导细胞AntiBcl-27901对3种药物的敏感性不同程度增高，药物抑瘤率提高(表1). DDP在小剂量时的药物敏感性增强最明显，抑瘤率是在SGC7901细胞的2倍，5-Fu则在正常剂量时的药物敏感性提高最显著. Anti Bcl-2/VCR对VCR仍呈耐药，但对DDP，5-Fu的敏感性增强(表2).
, 百拇医药
表1 三种药物对AntiBcl-27901的抑瘤率(%)
, 百拇医药
方差分析发现VCR三种剂量条件下各组OD值，无显著差异P1=0.52(SGC7901)，P2=0.207(AntiBcl-27901). DDP, 5FU组OD值方差分析P<0.01.
表2 三种药物对AntiBcl-2/VCR的抑瘤率(%)
, 百拇医药
注：两种细胞各自在不同药物三种剂量条件下的OD值，方差分析P值均<0.01.
3 讨论
多数化疗药物以及放射治疗均通过诱发细胞凋亡而发挥抗肿瘤活性，Bcl-2明确的抗凋亡作用，使肿瘤细胞对化疗、放疗的敏感性降低. Huang et al[4]在多种细胞系上，通过转染Bcl-2基因发现，Bcl-2蛋白与腺病毒蛋白E1B19KD在抗凋亡作用方面相似. 在本实验中，转染Bcl-2反义核酸，使Bcl-2蛋白表达下调，细胞对顺铂、5-氟脲嘧啶的敏感性增强，这表明，细胞表达Bcl-2与化疗药物敏感性有关，SGC7901胃癌细胞表达Bcl-2能够降低化疗药物的毒性，联合应用Bcl-2反义核酸与某些细胞毒药物有可能提高化疗效果，减少药物剂量，减轻药物毒副作用. 在人类罹患的各类癌症中，超过半数表达高水平的Bcl-2蛋白[3]，而至今，对凋亡发生的确切机制知之不多，对Bcl-2在癌组织中的过度表达以及Bcl-2抗凋亡机制尚不清楚，在这种情况下，利用Bcl-2反义核酸使Bcl-2蛋白表达下调促进癌细胞的凋亡，以达到治疗肿瘤的目的，不失为一种可行的选择.
, 百拇医药
肿瘤细胞存在多药耐药现象，肿瘤细胞过度表达Bcl-2也可能是多药耐药机制之一. 转染Bcl-2反义核酸的antiBcl-2/VCR细胞并未逆转对长春新碱耐药，说明Bcl-2蛋白表达不是SGC7901细胞对VCR耐药的主要因素；但对DDP，5-FU敏感性增强. 以上资料提示，对初次化疗后再次化疗的患者，转染Bcl-2反义核酸，有可能提高化疗效果.
Bcl-2反义脱氧寡聚核苷酸，不用载体，既可达细胞内，使Bcl-2蛋白表达下调，Reed证实，二者存在量效关系[5]. 但Bcl-2蛋白下调与化疗药物毒性间有无量效关系还不清楚. 不同组织起源、不同分化程度、不同Bcl-2蛋白表达水平的恶性肿瘤间可能存在差异. Harnois et al[6]在体外培养的胆管癌细胞系上发现，用18个硷基的Bcl-2反义脱氧寡聚核苷酸，使Bcl-2蛋白下调50%，Beauvericin诱导的早期凋亡(4h)增加3倍. Cotter et al[7]发现，Bcl-2反义脱氧寡聚核苷酸可阻止因t(14，18)染色体易位的人淋巴瘤细胞，在免疫缺陷小鼠体内成瘤. Webb et al[8]将Bcl-2反义脱氧寡聚核苷酸进行Ⅰ期临床试验，9例经2次化疗后复发的非何杰金淋巴瘤患者，1例完全缓解，后续化疗后，有6/8例部分缓解. 对于胃癌等实体瘤，如何保证Bcl-2反义脱氧寡聚核苷酸在体内有效发挥作用，有待于深入探讨.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 郑芝田主编. 胃肠病学. 第2版，北京：人民卫生出版社，1992：381
2 Lauwers GY, Scott GV, Hendricks J. Immunohistochemical evidence of aberrant Bcl-2 protein expression in gastric epithelial
dysplasia. Cancer, 1994;13:2900-2904
3 Reed JC. Promise and problems of Bcl-2 antisense therapy. J Nat Can Inst, 1997;89:988-990
, http://www.100md.com 4 Huang D, Cory S, Strasser A. Bcl-2, Bcl-X1 and adenovirus protein E1B19KD are functionally equivalent in their ability to inhibit
cell death. Oncogene, 1997;14:405-414
5 Reed JC, Stein C, Eubasinghe C, Haldar S, Croce CM, Yum S, Cohen J. Antisense-mediated inhibition of Bcl-2
protooncogene expression and leukemic cell growth and survival: comparions of phosphodiester and phosphorothioate
, 百拇医药
oligodeoxynucleotides. Cancer Res, 1990;50:6565-6570
6 Harnois DM, Que FG, Celli A, Larusso NF, Gores GJ. Bcl-2 is overexpression and alters the threshold for apoptosis in
a cholangiocarcinoma cell line. Hepatology, 1997;26:884-890
7 Cotter FE, Johnson P, Hall P, Pocock C, Mahdi N, Cowell JK. Antisense oligonucleotides suppress B-cell lymphoma growth in a SCID
hu mouse model. Oncogene, 1994;9:3049-3055
8 Webb A, Cunningham D, Cotter F, Clarke P, Stefano F, Ross P, Corbo M, Dziewanowska Z. Bcl-2 antisense therapy in patients
with non-Hodgkin lymphoma. Lancet, 1997;349:1137-1141, http://www.100md.com(王佐佑1 肖 冰2 时永全2 赵燕秋2 樊代明2)
2中国人民解放军第四军医大学消化疾病研究所 陕西省西安市 710033
项目负责人 王佐佑中国人民解放军海军313医院内二科 辽宁省葫芦岛市 125000
收稿日期 1999-04-15 接收日期 1999-06-03
Subject headings stomach neoplasms/drug therapy; oligonucleotides, antisense; Bcl-2 protooncogene
主题词 胃肿瘤/药物疗法；寡核苷酸类，反义；Bcl-2原癌基因
, http://www.100md.com
以手术根治为主的胃癌综合治疗，五年生存率只有37.7%，对胃癌的化疗并未取得理想的效果[1]. Bcl-2基因的异常表达，不仅与胃癌的发生有关，其抗凋亡作用的发挥，势必影响化疗效果[2]；肿瘤细胞对化疗药物存在多药耐药现象，缘于多种机制，Bcl-2基因的异常表达可能与之有关[3]. 我们通过pDOR载体将Bcl-2反义核酸转染胃癌细胞，观察转导细胞对化疗药物顺铂(DDP)、5-氟脲嘧啶(5-FU)、长春新碱(VCR)的敏感性调变，能否逆转耐药，为胃癌的治疗探索新的途径.
1 材料和方法
1.1 材料 人胃癌细胞SGC7901引自军科院，本所保存150mL/L小牛血清的PRM1640培养传代(37℃、饱和湿度、50mL/L 二氧化碳)；耐药细胞SGC/VCR本所建系，0.1mg/L终浓度培养维持耐药. 转染Bcl-2反义核酸的胃癌细胞AntiBcl-27901，AntiBcl-2/VCR由肖冰博士后提供，系利用限制性内切酶技术构建Bcl-2反义核酸真核表达载体，脂质体介导转染SGC7901，SGC/VCR，经4wk G418筛选，克隆细胞扩增培养建系.
, 百拇医药
1.2 方法 取对数生长期的细胞，计数后接种96孔板，培养24h，加药. 药物浓度按小、正常、大浓度设置，正常浓度mg/L=(mg×体表面积)/体质量×100÷60，小浓度为正常浓度的1/10，大浓度则是其10倍，各组均设对照，100mL/L小牛血清的PRM1640培养72h后，每孔加50g/L MTT 20μL，继续培养4h，弃上清，加DMSO 150μL，待结晶完全溶解，测A490nm (OD)值，计算抑瘤率.
2 结果
转导细胞AntiBcl-27901对3种药物的敏感性不同程度增高，药物抑瘤率提高(表1). DDP在小剂量时的药物敏感性增强最明显，抑瘤率是在SGC7901细胞的2倍，5-Fu则在正常剂量时的药物敏感性提高最显著. Anti Bcl-2/VCR对VCR仍呈耐药，但对DDP，5-Fu的敏感性增强(表2).
, 百拇医药
表1 三种药物对AntiBcl-27901的抑瘤率(%)
| 药物浓度(mg/L) | AntiBcl-27901 | SGC7901 | |
| DDP | 1 | 87 | 39 |
| 10 | 100 | 94 | |
| 100 | 100 | 96 | |
| 5FU | 7 | 60 | 58 |
| 70 | 97 | 47 | |
| 700 | 61 | 26 | |
| VCR* | 0.1 | 37 | 0 |
| 1 | 26 | 14 | |
| 10 | 31 | 35 |
, 百拇医药
方差分析发现VCR三种剂量条件下各组OD值，无显著差异P1=0.52(SGC7901)，P2=0.207(AntiBcl-27901). DDP, 5FU组OD值方差分析P<0.01.
表2 三种药物对AntiBcl-2/VCR的抑瘤率(%)
| 药物浓度(mg/L) | AntiBcl-2/VCR | SGC7901 | |
| DDP | 1 | 81 | 69 |
| 10 | 87 | 87 | |
| 100 | 88 | 89 | |
| 5FU | 7 | 49 | 29 |
| 70 | 46 | 48 | |
| 700 | 56 | 58 | |
| VCR* | 0.1 | 0 | 37 |
| 1 | 18 | 35 | |
| 10 | 27 | 40 |
, 百拇医药
注：两种细胞各自在不同药物三种剂量条件下的OD值，方差分析P值均<0.01.
3 讨论
多数化疗药物以及放射治疗均通过诱发细胞凋亡而发挥抗肿瘤活性，Bcl-2明确的抗凋亡作用，使肿瘤细胞对化疗、放疗的敏感性降低. Huang et al[4]在多种细胞系上，通过转染Bcl-2基因发现，Bcl-2蛋白与腺病毒蛋白E1B19KD在抗凋亡作用方面相似. 在本实验中，转染Bcl-2反义核酸，使Bcl-2蛋白表达下调，细胞对顺铂、5-氟脲嘧啶的敏感性增强，这表明，细胞表达Bcl-2与化疗药物敏感性有关，SGC7901胃癌细胞表达Bcl-2能够降低化疗药物的毒性，联合应用Bcl-2反义核酸与某些细胞毒药物有可能提高化疗效果，减少药物剂量，减轻药物毒副作用. 在人类罹患的各类癌症中，超过半数表达高水平的Bcl-2蛋白[3]，而至今，对凋亡发生的确切机制知之不多，对Bcl-2在癌组织中的过度表达以及Bcl-2抗凋亡机制尚不清楚，在这种情况下，利用Bcl-2反义核酸使Bcl-2蛋白表达下调促进癌细胞的凋亡，以达到治疗肿瘤的目的，不失为一种可行的选择.
, 百拇医药
肿瘤细胞存在多药耐药现象，肿瘤细胞过度表达Bcl-2也可能是多药耐药机制之一. 转染Bcl-2反义核酸的antiBcl-2/VCR细胞并未逆转对长春新碱耐药，说明Bcl-2蛋白表达不是SGC7901细胞对VCR耐药的主要因素；但对DDP，5-FU敏感性增强. 以上资料提示，对初次化疗后再次化疗的患者，转染Bcl-2反义核酸，有可能提高化疗效果.
Bcl-2反义脱氧寡聚核苷酸，不用载体，既可达细胞内，使Bcl-2蛋白表达下调，Reed证实，二者存在量效关系[5]. 但Bcl-2蛋白下调与化疗药物毒性间有无量效关系还不清楚. 不同组织起源、不同分化程度、不同Bcl-2蛋白表达水平的恶性肿瘤间可能存在差异. Harnois et al[6]在体外培养的胆管癌细胞系上发现，用18个硷基的Bcl-2反义脱氧寡聚核苷酸，使Bcl-2蛋白下调50%，Beauvericin诱导的早期凋亡(4h)增加3倍. Cotter et al[7]发现，Bcl-2反义脱氧寡聚核苷酸可阻止因t(14，18)染色体易位的人淋巴瘤细胞，在免疫缺陷小鼠体内成瘤. Webb et al[8]将Bcl-2反义脱氧寡聚核苷酸进行Ⅰ期临床试验，9例经2次化疗后复发的非何杰金淋巴瘤患者，1例完全缓解，后续化疗后，有6/8例部分缓解. 对于胃癌等实体瘤，如何保证Bcl-2反义脱氧寡聚核苷酸在体内有效发挥作用，有待于深入探讨.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 郑芝田主编. 胃肠病学. 第2版，北京：人民卫生出版社，1992：381
2 Lauwers GY, Scott GV, Hendricks J. Immunohistochemical evidence of aberrant Bcl-2 protein expression in gastric epithelial
dysplasia. Cancer, 1994;13:2900-2904
3 Reed JC. Promise and problems of Bcl-2 antisense therapy. J Nat Can Inst, 1997;89:988-990
, http://www.100md.com 4 Huang D, Cory S, Strasser A. Bcl-2, Bcl-X1 and adenovirus protein E1B19KD are functionally equivalent in their ability to inhibit
cell death. Oncogene, 1997;14:405-414
5 Reed JC, Stein C, Eubasinghe C, Haldar S, Croce CM, Yum S, Cohen J. Antisense-mediated inhibition of Bcl-2
protooncogene expression and leukemic cell growth and survival: comparions of phosphodiester and phosphorothioate
, 百拇医药
oligodeoxynucleotides. Cancer Res, 1990;50:6565-6570
6 Harnois DM, Que FG, Celli A, Larusso NF, Gores GJ. Bcl-2 is overexpression and alters the threshold for apoptosis in
a cholangiocarcinoma cell line. Hepatology, 1997;26:884-890
7 Cotter FE, Johnson P, Hall P, Pocock C, Mahdi N, Cowell JK. Antisense oligonucleotides suppress B-cell lymphoma growth in a SCID
hu mouse model. Oncogene, 1994;9:3049-3055
8 Webb A, Cunningham D, Cotter F, Clarke P, Stefano F, Ross P, Corbo M, Dziewanowska Z. Bcl-2 antisense therapy in patients
with non-Hodgkin lymphoma. Lancet, 1997;349:1137-1141, http://www.100md.com(王佐佑1 肖 冰2 时永全2 赵燕秋2 樊代明2)