MNNG加吐温20和维生素D3对大鼠前胃的影响
中国人民解放军222医院消化实验室 吉林省吉林市 132011
高国林，男，1952-08-03生，辽宁省彰武县人，汉族. 1975年于大连军医学校毕业，现任解放军222医院消化实验室主管技师，发表医学论文51篇，获军队科技进步奖5项.
项目负责人 高国林，132011，吉林省吉林市，中国人民解放军222医院消化实验室.
Correspondence to Guo-Lin Gao, Gastroenterological Center, Hospital No. 222 PLA, Jilin 132011, Jilin Province, China
收稿日期 1999-04-08 接收日期 1999-07-18
, 百拇医药
Effect of vitamin D3 on forestomach carcinogenesis induced by N-methyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidine
and tween 20 in rats
Guo-Lin Gao, Yuan Yang, Cai-Wen Ren and Si-Feng Yang
Gastroenterological Center, Hospital No. 222 PLA, Jilin 132011, Jilin Province, China
, 百拇医药
Abstract
AIM To investigate the correlation between changes of microvessel and forestomach carcinogenesis in the rats.
METHODS Forestomach carcinogenesis in rats was induced by topical administration of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG, 150mg·L-1) and tween 20(0.4%) in drinking water. Four weeks later, rats were switched to the diet containing 1, 25-dihydroxyvitamin D3[1，25(OH)2D3，2.5 and 5.0mg·kg-1]. Animals were killed at week 8, 16,24 and 32, respectively.
, 百拇医药
RESULTS At week 16, rats given MNNG and tween 20 showed increase in microvessel density and proliferation of endothelial cells. At the end of the experiment, the incidence of forestomach carcinoma in rats receiving 1, 25 (OH)2D3 (5.0mg·kg-1) was dramatically higher (65%) than that of rats receiving MNNG and tween 20 (10%).
CONCLUSION The endothelial cell proliferation and increased microvessel density in mucosa of forestomach occurred at precancerous stage during chemical-induced carcinogenesis.
, 百拇医药
Subject headings rats, N-methyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidine; proliferation; endothelial cell; microvessel;
gastric carcinogenesis/pathology
Gao GL, Yang Y, Ren CW, Yang SF. Effect of vitamin D3 on forestomach carcinogenesis induced by N methyl N'nitro N nitroso-guanidine and tween 20 in rats. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,1999;7(9):763-765
, 百拇医药
摘要
目的 研究胃癌发生、发展过程中,间质组织中血管反应与肿瘤的关系.
方法 经水摄入N-甲基-N1-基-N-亚硝基胍(MNNG)和表面活性剂(吐温20)诱发大鼠肿瘤,饲料中添加维生素D3(VitD3)对肿瘤进行预防.每8wk处死大鼠7只,32wk实验结束.
结果 wk16实验组大鼠前胃鳞状上皮形态主要以血管密度增加、血管内皮细胞增生,32wk(MNNG)+表面活性剂和VitD3组肿瘤发生率高于MNNG组(10%),肿瘤发生率为65%.
结论 该组动物诱癌实验表明,肿瘤形成前主要以血管新生、血管EC增生为主的病理性变化.
, 百拇医药
主题词 胃肿瘤;血管新生;甲硝基亚硝胍;聚山梨酯类;维生素D3
高国林, 杨原, 任彩文, 杨思凤.MNNG加吐温20和维生素D3对大鼠前胃的影响.世界华人消化杂志,1999;7(9):763-765
0 引言
应用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱发大鼠腺胃肿瘤的报道较多[1，2]. 应用MNNG+表面活性剂诱发大鼠前胃鳞状上皮肿瘤，同时应用维生素D3(VitD3)对肿瘤进行预防. 在实验过程中经主动脉活体灌注墨汁，动态观察上皮组织间血管密度增高和血管内皮细胞增生(EC)，与肿瘤的关系进行观察.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 MNNG为Sigma公司产品，纯度99.0%，贮放在4℃冰箱内，将MNNG黄色晶体溶解于蒸馏水中使其成为300mg/L母液，用时加等量4g/L吐温20水溶液，配成150mg/L溶液，供大鼠自由吸饮. 饲料中添加VitD3，将VitD3与饲料均匀混合. 使其浓度达2.5和5.0mg/1kg.
1.2 实验用Wistar♂大鼠150只(由白求恩医科大学实验动物中心提供)，随机分为4组，实验组每组40只，对照组30只，Ⅰ组为对照组，Ⅱ组自由吸饮MNNG+吐温20水溶液，进常规饲料，Ⅲ，Ⅳ除自由吸饮MNNG+吐温20水溶液外，在饲料中分别添加VitD3(2.5和5.0mg). 8，16，24wk分别处死7只，余下大鼠全部处死. 每批取3只大鼠在乙醚麻醉下经主动脉灌注墨汁. 胃沿大弯侧剪开，同其他脏器固定于100mL/L. 中性福尔马林溶液中，血管密度按Bsam方法计数3个血管最高区，取平均值.
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2 结果
实验组大鼠分期分批处死，动态观察实验过程中诱癌剂对实验大鼠前胃、腺胃及其他组织在形态学上改变，进一步了解肿瘤发生前后组织学和形态特征的变化. 实验wk83个实验组大鼠前胃鳞状上皮没有异常改变，wk16各实验组大鼠的前胃鳞状上皮组织形态主要以血管密度增多、血管EC增生为主的形态变化(图1)，有的区域鳞状上皮增厚；由3～5层细胞增至8层. 形成内生或外生性改变，有的区域形成轻度乳头样改变(图2). wk24前胃沿上皮基底血管窦样扩张，血管EC增生就更为明显，有的血管腔被增生的EC阻塞. MNNG+吐温20和VitD3(5.0mg)组可见前胃、腺胃均有原位癌发生(图3).
实验组大鼠前胃、腺胃肿瘤发生率在32wk时各实验组均有增加，尤以MNNG+吐温20和VitD3(5.0mg)组的肿瘤发生率为最高，从该组20只大鼠的前胃、腺胃同时发生原位癌至浸润癌[3]. 前胃肿瘤以内生和外生性乳头状瘤恶性变为主，鳞状细胞癌发生率占该组的65.0%(13/20)，除一只大鼠发生肝发肝癌外，12只大鼠有大小不一的肝囊肿发生，详见表1.
, 百拇医药
每组取12只大鼠在乙醚麻醉下，经主动脉灌注墨汁，观察血管EC增生对鳞状上皮细胞的影响(图4)，结果表明增生的血管EC阻断或不全阻断对局部鳞状上皮组织的血液供给，导致组织呈区域性上皮变性. 坏死、脱落. 在肿瘤形成的间质血管数量明显减少，而在肿瘤外周血管密度增加，与肿瘤中心形成鲜明的对比. 免疫组化检测40只大鼠的血管内皮细胞增生因子(VEGF)和增生细胞核抗原(PCNA)；实验组PCNA阳性率为63.3%；增生的血管EC被VEGF染成阳性，为71.2%；对照组血管EC染阴性.
图1 第16wk实验组大鼠前胃血管密度增加，血管内灌注墨汁末经组织染色×100
图2 增生的鳞状上皮形成乳头，鳞状上皮细胞增生活跃，HE染色，×100
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图3 第24wk实验组大鼠前胃形成原位癌，HE染色，×100
图4 墨汁灌注标本，HE染色. 血管与周围组织形成鲜明对比，×400
图5 前胃鳞癌间质血管EC被VEGF染棕黄色，VEGF组化染色，×100
图6 增生的鳞状上皮细胞染阳性. PCNA组化染色，×400
表1 32wk实验组大鼠前胃鳞癌统计表
, 百拇医药
3 讨论
本组实验动物从所获结果可以看出，实验组大鼠前胃鳞状上皮癌及乳头状瘤的恶变率最高组为65.0%，最低组只有10.0%. 而且均可以见到前胃、腺胃同时发生肿瘤. 对照组前胃、腺胃均末见肿瘤发生，两组间肿瘤发生率有非常显著差异(P>0.01). 由张宗显观察MNNG加吐温20实验表明可以促进前胃上皮恶变，18mo(77wk)前胃癌发生率为37.0%. 根据报道饲料中添加VitD3，对化学致癌剂诱发动物肿瘤有预防作用[4]，也有人指出无论体内还是体外实验均可抑制多种肿瘤细胞的发生[5]. VitD3对大鼠胃癌的发生是否也有预防作用，尚未见报道：该实验添加VitD3旨在降低实验组大鼠胃癌发病率，但是最终结果表明，VitD3不但没有起到预防大鼠胃癌的发生，反而加速实验组大鼠胃癌的形成[5，6]，特别对前胃鳞状上皮的作用更明显. VitD3在诱发大鼠胃癌过程中，有剂量相关和时间相关的作用，这是因为胃粘膜组织中的VitD3受体比较少，另一方面，VitD3，即可以靶向肿瘤细胞也可以靶向血管内皮细胞，因此MNNG、吐温20和饲料中添加VitD3可以加速血管内皮细胞增生，促进肿瘤形成.
, http://www.100md.com
虽然有的报道吐温20对前胃鳞状上皮有促进恶变的作用，需要较长时间，约18mo(77wk). 本组动物实验仅用8mo(32wk)，MNNG+吐温20组前胃主要以内生和外生性乳头状瘤为主的病变，32wk仅有2只大鼠发生鳞状细胞癌(原位癌). 而MNNG+吐温20和饲料中添加VitD3(5.0mg)组前胃鳞状细胞癌发生率为65.0%，两组间有非常显著差异(P>0.01). 实验组大鼠增生的血管内皮细胞被VEGF标记为阳性，阳性率高于对照组，这一结果说明，MNNG+吐温20和VitD3，对促进肿瘤形成有作用.
该组大鼠诱癌实验表明，肿瘤形成之前，主要以血管新生、血管内皮细胞增生为主的病变. 一旦肿瘤形成，从肿瘤中心部位开始血管的密度逐渐减少乃至消失，在肿瘤外周仍然可见大量新生血管和增生的血管EC，增生的EC生长活跃，异形性变和阻塞血管腔. 显微镜下观察结果证明，肿瘤外周血管密度越高，血管内皮细胞增生的越明显，血管腔阻塞的越重，肿瘤细胞生长的越活跃. 通过本组动物实验观察，我们认为这些增生的血管内皮细胞不但阻断局部组织有效血液循环，同时也直接形成肿瘤组织. 因此，抑制肿瘤间质血管EC增生可能有助于肿瘤的预防. 这一结果应进一步深入探讨.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Zhang ZX, Li YQ, Sun ZX. Zlnfluenc of surfactupon induction of digstve tract tumors by MNNG.
Zhonghua Binglixue Zazhi, 1986;15:6-7
2 Zhang RZ, Liu YP, Zu SX. The infuluence of castation ontheinduction on gastric adenocarcinoma by N methyl N-1 nitro
N nitrosoguanidine(MNNG) in xistar rats. Zhonghua Binglixue Zazhi, 1989;18:128-130
, 百拇医药
3 Gao GL, Yang UAN, Yang SF, He J. Gastric carcinogenesis and yea ctivity of microvessel induced by N-methyl-N'-nitro-Nnitroso
-guanidine(MNNG) in rats. Huaren Xiaohua Zazhi, 1998;6:109-111
4 Bogari S, Lee KC, Delellis RA. Mcrovessel quantiication and prognosis in invasive breast carcinoma. Hum pathol, 1992;23:755-761
5 Majewskisi S, Szmuylo A, Marczak M. Inhibition of tumor cell induced angiogensis by retinoids; 1,25-dihydroxyvitamin D3 and
their combination. Cancer Lett, 1993;75:35-41
6 Toshio K, Kiyoshi S, Kazuhiro C.1, 25-dihydroxyvitamin D3 markedlly enhances chemically-induced tranfomation in BALB 3T3 cells.
Gann, 1983;74:611-614, 百拇医药(高国林 杨原 任彩文 杨思凤)
高国林，男，1952-08-03生，辽宁省彰武县人，汉族. 1975年于大连军医学校毕业，现任解放军222医院消化实验室主管技师，发表医学论文51篇，获军队科技进步奖5项.
项目负责人 高国林，132011，吉林省吉林市，中国人民解放军222医院消化实验室.
Correspondence to Guo-Lin Gao, Gastroenterological Center, Hospital No. 222 PLA, Jilin 132011, Jilin Province, China
收稿日期 1999-04-08 接收日期 1999-07-18
, 百拇医药
Effect of vitamin D3 on forestomach carcinogenesis induced by N-methyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidine
and tween 20 in rats
Guo-Lin Gao, Yuan Yang, Cai-Wen Ren and Si-Feng Yang
Gastroenterological Center, Hospital No. 222 PLA, Jilin 132011, Jilin Province, China
, 百拇医药
Abstract
AIM To investigate the correlation between changes of microvessel and forestomach carcinogenesis in the rats.
METHODS Forestomach carcinogenesis in rats was induced by topical administration of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG, 150mg·L-1) and tween 20(0.4%) in drinking water. Four weeks later, rats were switched to the diet containing 1, 25-dihydroxyvitamin D3[1，25(OH)2D3，2.5 and 5.0mg·kg-1]. Animals were killed at week 8, 16,24 and 32, respectively.
, 百拇医药
RESULTS At week 16, rats given MNNG and tween 20 showed increase in microvessel density and proliferation of endothelial cells. At the end of the experiment, the incidence of forestomach carcinoma in rats receiving 1, 25 (OH)2D3 (5.0mg·kg-1) was dramatically higher (65%) than that of rats receiving MNNG and tween 20 (10%).
CONCLUSION The endothelial cell proliferation and increased microvessel density in mucosa of forestomach occurred at precancerous stage during chemical-induced carcinogenesis.
, 百拇医药
Subject headings rats, N-methyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidine; proliferation; endothelial cell; microvessel;
gastric carcinogenesis/pathology
Gao GL, Yang Y, Ren CW, Yang SF. Effect of vitamin D3 on forestomach carcinogenesis induced by N methyl N'nitro N nitroso-guanidine and tween 20 in rats. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,1999;7(9):763-765
, 百拇医药
摘要
目的 研究胃癌发生、发展过程中,间质组织中血管反应与肿瘤的关系.
方法 经水摄入N-甲基-N1-基-N-亚硝基胍(MNNG)和表面活性剂(吐温20)诱发大鼠肿瘤,饲料中添加维生素D3(VitD3)对肿瘤进行预防.每8wk处死大鼠7只,32wk实验结束.
结果 wk16实验组大鼠前胃鳞状上皮形态主要以血管密度增加、血管内皮细胞增生,32wk(MNNG)+表面活性剂和VitD3组肿瘤发生率高于MNNG组(10%),肿瘤发生率为65%.
结论 该组动物诱癌实验表明,肿瘤形成前主要以血管新生、血管EC增生为主的病理性变化.
, 百拇医药
主题词 胃肿瘤;血管新生;甲硝基亚硝胍;聚山梨酯类;维生素D3
高国林, 杨原, 任彩文, 杨思凤.MNNG加吐温20和维生素D3对大鼠前胃的影响.世界华人消化杂志,1999;7(9):763-765
0 引言
应用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱发大鼠腺胃肿瘤的报道较多[1，2]. 应用MNNG+表面活性剂诱发大鼠前胃鳞状上皮肿瘤，同时应用维生素D3(VitD3)对肿瘤进行预防. 在实验过程中经主动脉活体灌注墨汁，动态观察上皮组织间血管密度增高和血管内皮细胞增生(EC)，与肿瘤的关系进行观察.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 MNNG为Sigma公司产品，纯度99.0%，贮放在4℃冰箱内，将MNNG黄色晶体溶解于蒸馏水中使其成为300mg/L母液，用时加等量4g/L吐温20水溶液，配成150mg/L溶液，供大鼠自由吸饮. 饲料中添加VitD3，将VitD3与饲料均匀混合. 使其浓度达2.5和5.0mg/1kg.
1.2 实验用Wistar♂大鼠150只(由白求恩医科大学实验动物中心提供)，随机分为4组，实验组每组40只，对照组30只，Ⅰ组为对照组，Ⅱ组自由吸饮MNNG+吐温20水溶液，进常规饲料，Ⅲ，Ⅳ除自由吸饮MNNG+吐温20水溶液外，在饲料中分别添加VitD3(2.5和5.0mg). 8，16，24wk分别处死7只，余下大鼠全部处死. 每批取3只大鼠在乙醚麻醉下经主动脉灌注墨汁. 胃沿大弯侧剪开，同其他脏器固定于100mL/L. 中性福尔马林溶液中，血管密度按Bsam方法计数3个血管最高区，取平均值.
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2 结果
实验组大鼠分期分批处死，动态观察实验过程中诱癌剂对实验大鼠前胃、腺胃及其他组织在形态学上改变，进一步了解肿瘤发生前后组织学和形态特征的变化. 实验wk83个实验组大鼠前胃鳞状上皮没有异常改变，wk16各实验组大鼠的前胃鳞状上皮组织形态主要以血管密度增多、血管EC增生为主的形态变化(图1)，有的区域鳞状上皮增厚；由3～5层细胞增至8层. 形成内生或外生性改变，有的区域形成轻度乳头样改变(图2). wk24前胃沿上皮基底血管窦样扩张，血管EC增生就更为明显，有的血管腔被增生的EC阻塞. MNNG+吐温20和VitD3(5.0mg)组可见前胃、腺胃均有原位癌发生(图3).
实验组大鼠前胃、腺胃肿瘤发生率在32wk时各实验组均有增加，尤以MNNG+吐温20和VitD3(5.0mg)组的肿瘤发生率为最高，从该组20只大鼠的前胃、腺胃同时发生原位癌至浸润癌[3]. 前胃肿瘤以内生和外生性乳头状瘤恶性变为主，鳞状细胞癌发生率占该组的65.0%(13/20)，除一只大鼠发生肝发肝癌外，12只大鼠有大小不一的肝囊肿发生，详见表1.
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每组取12只大鼠在乙醚麻醉下，经主动脉灌注墨汁，观察血管EC增生对鳞状上皮细胞的影响(图4)，结果表明增生的血管EC阻断或不全阻断对局部鳞状上皮组织的血液供给，导致组织呈区域性上皮变性. 坏死、脱落. 在肿瘤形成的间质血管数量明显减少，而在肿瘤外周血管密度增加，与肿瘤中心形成鲜明的对比. 免疫组化检测40只大鼠的血管内皮细胞增生因子(VEGF)和增生细胞核抗原(PCNA)；实验组PCNA阳性率为63.3%；增生的血管EC被VEGF染成阳性，为71.2%；对照组血管EC染阴性.
图1 第16wk实验组大鼠前胃血管密度增加，血管内灌注墨汁末经组织染色×100
图2 增生的鳞状上皮形成乳头，鳞状上皮细胞增生活跃，HE染色，×100
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图3 第24wk实验组大鼠前胃形成原位癌，HE染色，×100
图4 墨汁灌注标本，HE染色. 血管与周围组织形成鲜明对比，×400
图5 前胃鳞癌间质血管EC被VEGF染棕黄色，VEGF组化染色，×100
图6 增生的鳞状上皮细胞染阳性. PCNA组化染色，×400
表1 32wk实验组大鼠前胃鳞癌统计表
| 组别 | n | 正常 | 乳头状瘤 | 鳞癌 |
| 对照组 | 16 | 16 | 0 | 0 |
| MNNG+吐温20+ | 20 | 10 | 8 | 2 |
| MNNG+吐温20+VitD3(2.5mg) | 20 | 4 | 10 | 6 |
| MNNG+吐温20+VitD3(5.0mg) | 20 | 0 | 7 | 13 |
, 百拇医药
3 讨论
本组实验动物从所获结果可以看出，实验组大鼠前胃鳞状上皮癌及乳头状瘤的恶变率最高组为65.0%，最低组只有10.0%. 而且均可以见到前胃、腺胃同时发生肿瘤. 对照组前胃、腺胃均末见肿瘤发生，两组间肿瘤发生率有非常显著差异(P>0.01). 由张宗显观察MNNG加吐温20实验表明可以促进前胃上皮恶变，18mo(77wk)前胃癌发生率为37.0%. 根据报道饲料中添加VitD3，对化学致癌剂诱发动物肿瘤有预防作用[4]，也有人指出无论体内还是体外实验均可抑制多种肿瘤细胞的发生[5]. VitD3对大鼠胃癌的发生是否也有预防作用，尚未见报道：该实验添加VitD3旨在降低实验组大鼠胃癌发病率，但是最终结果表明，VitD3不但没有起到预防大鼠胃癌的发生，反而加速实验组大鼠胃癌的形成[5，6]，特别对前胃鳞状上皮的作用更明显. VitD3在诱发大鼠胃癌过程中，有剂量相关和时间相关的作用，这是因为胃粘膜组织中的VitD3受体比较少，另一方面，VitD3，即可以靶向肿瘤细胞也可以靶向血管内皮细胞，因此MNNG、吐温20和饲料中添加VitD3可以加速血管内皮细胞增生，促进肿瘤形成.
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虽然有的报道吐温20对前胃鳞状上皮有促进恶变的作用，需要较长时间，约18mo(77wk). 本组动物实验仅用8mo(32wk)，MNNG+吐温20组前胃主要以内生和外生性乳头状瘤为主的病变，32wk仅有2只大鼠发生鳞状细胞癌(原位癌). 而MNNG+吐温20和饲料中添加VitD3(5.0mg)组前胃鳞状细胞癌发生率为65.0%，两组间有非常显著差异(P>0.01). 实验组大鼠增生的血管内皮细胞被VEGF标记为阳性，阳性率高于对照组，这一结果说明，MNNG+吐温20和VitD3，对促进肿瘤形成有作用.
该组大鼠诱癌实验表明，肿瘤形成之前，主要以血管新生、血管内皮细胞增生为主的病变. 一旦肿瘤形成，从肿瘤中心部位开始血管的密度逐渐减少乃至消失，在肿瘤外周仍然可见大量新生血管和增生的血管EC，增生的EC生长活跃，异形性变和阻塞血管腔. 显微镜下观察结果证明，肿瘤外周血管密度越高，血管内皮细胞增生的越明显，血管腔阻塞的越重，肿瘤细胞生长的越活跃. 通过本组动物实验观察，我们认为这些增生的血管内皮细胞不但阻断局部组织有效血液循环，同时也直接形成肿瘤组织. 因此，抑制肿瘤间质血管EC增生可能有助于肿瘤的预防. 这一结果应进一步深入探讨.
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4 参考文献
1 Zhang ZX, Li YQ, Sun ZX. Zlnfluenc of surfactupon induction of digstve tract tumors by MNNG.
Zhonghua Binglixue Zazhi, 1986;15:6-7
2 Zhang RZ, Liu YP, Zu SX. The infuluence of castation ontheinduction on gastric adenocarcinoma by N methyl N-1 nitro
N nitrosoguanidine(MNNG) in xistar rats. Zhonghua Binglixue Zazhi, 1989;18:128-130
, 百拇医药
3 Gao GL, Yang UAN, Yang SF, He J. Gastric carcinogenesis and yea ctivity of microvessel induced by N-methyl-N'-nitro-Nnitroso
-guanidine(MNNG) in rats. Huaren Xiaohua Zazhi, 1998;6:109-111
4 Bogari S, Lee KC, Delellis RA. Mcrovessel quantiication and prognosis in invasive breast carcinoma. Hum pathol, 1992;23:755-761
5 Majewskisi S, Szmuylo A, Marczak M. Inhibition of tumor cell induced angiogensis by retinoids; 1,25-dihydroxyvitamin D3 and
their combination. Cancer Lett, 1993;75:35-41
6 Toshio K, Kiyoshi S, Kazuhiro C.1, 25-dihydroxyvitamin D3 markedlly enhances chemically-induced tranfomation in BALB 3T3 cells.
Gann, 1983;74:611-614, 百拇医药(高国林 杨原 任彩文 杨思凤)