亚洲乙型肝炎病毒前C区突变检测的临床意义
中国人民解放军第四军医大学全军基因诊断技术研究所 陕西省西安市 710033
项目负责人 郭晏海中国人民解放军第四军医大学全军基因诊断技术研究所 陕西省西安市 710033
收稿日期 1999-05-21 接收日期 1999-07-25
Subject headings hepatitis B/diagnosis; hepatitis B virus; mutation; polymerase chain reaction
主题词 乙型肝炎病毒；肝炎，乙型/诊断；突变；聚合酶链反应
, http://www.100md.com
1989年Brunetto et al[1]和Carman et al[2]先后报道抗-Hbe阳性的慢性肝炎患者中，发现了HBV前C区突变株，即在前C区1896点TGG转变为TAG，产生终止码，阻止HBeAg合成. 后来在许多国家和地区都相继发现了相同的突变株. 在我国也有许多关于前C区突变与慢性肝炎肝硬变有关的报道[6]. 这些报道总体上说明1896点突变株在毒力上不但比野型株强，而且与野型株有相同的复制和感染能力. 我们用双重PCR方法对HBV感染者血清中HBV DNA前C区1896点的突变率进行检测，研究其在不同类型乙型肝炎中的发生率及其临床意义.
1 材料和方法
1.1 材料 Thermolyne PCR扩增仪(美国)：Taq DNA聚合酶和dNTP(Promega公司)；含HBV DNA的pUC19质粒，其中pUC19HBV1为adr型野型序列，pUC19HBV2为adr型前C区1896点(G→A)突变型序列. HBV DNA序列来自文献[5，8]，引物序列位于前C/C区保守序列，用oligo引物设计软件辅助设计引物，各条引物序列分别为：检测HBV DNA的通用引物B1(上游2050～2069)5’-TCACCATACAGCACTCAGGC；检测1896点突变引物B2(上游1877—1876)5’-CTGTGCCT-TGGGTGGCTTTA；下游共用引物B3(2458—2493)5’-CTAACATTGAGATTCCCGAG. 血清标本来自第四军医大学西京医院检验科，西安医科大学第一、第二附属医院检验科，西安市第一医院检验科. 其中50例急性乙型肝炎患者，HBeAg阳性，男34例，女16例，年龄19岁～49岁；50例慢性乙型肝炎患者，抗-HBe阳性，男32例，女18例，年龄31岁～54岁；另有20例健康携带者血清HBV DNA阳性，HBsAg阳性，而ALT正常. HBV各项指标检测结果见表1.
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表1 HBsAg阳性急慢性乙型肝炎检测结果
两对半次序：①HBsAg，②抗-HBs，③HBeAg，④抗-HBe，⑤抗-HBc.升高：指明显高于正常值.
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1.2 方法 血清标本有酚/氯仿抽提乙酚沉淀法，主要过程见文献[4]. 取血清标本处理液5μL加于25μL PCR反应液中，使PCR反应化系为30μL(其中10×PCR反应缓冲液3μL，dNTP各200μmol/L，Taq DNA聚合酶U，循环反应94℃ 30s，58℃，30s，72℃ 40s，循环35次，最后72℃再延伸3min，PCR扩增完毕，取10μL PCR产物进行20g/L的琼脂糖凝胶电泳. 凡是1896点无突变的HBV DNA只能扩出一条带，片段长度为409bp，而有1896点有突变(G→A)的能扩增出2条带，分别是409bp和580bp.
2 结果
2.1 双重PCR方法的特异性 用双重PCR方法对野型pUCHBV DNA序列和有1896点突变的pUCHBV DNA序列进行扩增，野型HBV DNA只扩增出一条带(409bp)而突变型HBV DNA能扩增出2条(409bp和580bp)；对HBV DNA阴性血清扩增不出带. 同时用该方法对HCMV DNA，HPV6，11，16 DNA，pUC19质粒DNA，HAV RNA，HCV RNA分别进行扩增，都扩增不出特定大小的片段，说明3条引物对扩增HBV DNA是特异的.
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2.2 双重PCR方法的灵敏性 分别对含有野型和1896点突变型HBV DNA序列的pUC19质粒进行纯化并定量，再分别10倍梯度稀释为每5μL含靶序列为1×106，1×105，1×104，1×103，1×102，1×101. 该PCR方法对两组稀释梯度都能扩增到1×101/5μL. 这一灵敏度能达到检测的需要.
2.3 血清中HBV DNA的检出结果 HBV正常携带者20例，检出突变株3例，突变为15%；而50例急性乙型肝炎突变株为6例，突变率为12%，50例慢性乙型肝炎该点突变率为56%(28例突变株).
3 讨论
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在本实验中，我们采用了双重PCR方法，一次PCR检测不仅可以检测血清中有无HBV DNA而且可以检测出血清中的HBV DNA有无前C区1896点突变(G→A)，这样大大地简化了实验操作，同时我们对该PCR方法进行了灵敏性和特异性研究，发现其只能扩增HBV DNA前C区/C区特定片段，并且对野型和突变型检测都能达到1×101靶模板拷贝数的水平. 由于我们是从200μL血清中抽提HBV DNA并乙醇沉淀，最后溶于20μL TE缓冲液中，取5μL进行PCR扩增，那么该PCR检测血清中HBV DNA浓度为2×105cop/L，而一般HBV DNA感染者血清HBV DNA浓度远高于此限，因此，该双重PCR方法能达到检测需要.
本实验将研究对象分成3组，即：正常携带者，急性，慢性乙型肝炎. 对HBsAg阳性，ALT正常的正常携带者进行检测，发现其中有HBV DNA阳性者，突变株发生率为15%(3/20). 急性乙型肝炎突变率为12%，(6/50)，慢性乙型肝炎突变率为56%(28/50)，前两者之间突变发生率无显著差别(P>0.05)，而后两者之间有显著性差异(P<0.05). HBV DNA前C区1896点突变产生的主要由以下原因造成，首先是由于HBV DNA的复制方法，即通过mRNA中间体进行逆转录合成cDNA，该过程由于缺乏校正酶来校正复制中出现的错误，故容易引起突变；每个核苷酸每年突变率约为1×10-5～3×10-5[3]. 同时由于1896点突变与该区其他几处突变相比，对HBV DNA复制能力无明显影响，甚至突变株比野型株在某些方面更有优势，加上机体免疫压力作用，促成该突变类型最常发生[7]. 实验结果显示：正常携带者比急性患者1896点(G-A)发生率明显低，分别为15%和56%. 这与上面的推论相符. 因为前者机体免疫压力小，而后者的免疫压力大；同时发现突变发生与感染时间的长短有关，因为同样是在免疫压力较大的情况下，急性和慢性乙型肝炎的突变发生率相差明显，感染时间短的急性患者突变率为12%，而感染时间长的慢性患者突变率为56%，说明机体免疫压力和感染时间是该突变发生的主要因素，缺少其一将会使突变发生率降低.
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目前多数人认为，前C区1896点突变(G-A)产生终止密码，不能合成分泌HBeAg，则能逃避机体的免疫清除作用，同时，其复制能力无明显影响可作为一种新型稳定的病毒株取代野型株在体内长期生存，而且有研究表明突变株还能作为一稳定株在人群间传播，那么势必会造成最终突变型HBV DNA取代野型HBV DNA[6]. 而我们检测的抗-HBe阳性慢性乙型肝炎的1896点突变率和3a前报道的并无明显升高，这与上面的推论不符，如果3年时间不足以显示突变型取代野型的发展趋势的话. 那么至少新感染的乙型肝炎患者中的突变发生率应与抗-HBe慢性乙型肝炎的突变率相接近，但检测结果却显示两者相差悬殊. 因此我们认为该突变型HBV的复制和传染性上，总体上要比野型HBV DNA要弱，这一点与以往多数报道的结果不一致.
总之，1896点突变应是由HBV DNA自身的易突变性以及机体免疫压力长期作用选择的结果. 突变的结果可以暂时减弱机体对该突变株的免疫清除能力. 突变株的复制能力和传染性要比野型要弱，而且我们认为单1896点突变与肝炎的严重程度关系不大，促成肝炎恶化的病因可能是与HBV多位点突变有关. 肝炎加重的主要原因还在机体免疫和肝细胞功能变化等方面. 这些推理需要更为细致的研究加以证实.
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4 参考文献
1 Brunetto MR, Sternler M, Schodel F. Identification of HBV variants which cannot produce precore derived HBeAg and may
be responsible for severe hepatitis. Ital J Gastroenterol, 1982;21:151-155
2 Carman WF, Jacyna MR, Hadziyannis S, Karayiannis PM, Cgarvey MJ, Makris A, Thomas HC. Mutation preventing formation of
hepatitis Be antigen in patients with chronic hepatitis B infection. Lancet, 1989;2:588-591
, 百拇医药
3 Akarca US, Lok AS. Naturally occurring hepatitis B virus core gene mutations. Hepatology, 1995;22:50-60
4 Akarca US, Greene S, Lok AS. Detection of precore hepatitis B virus mutants in asymptomatic HBcAg-positive family
member. Hepatology, 1994;19:1366-1370
5 Aye TT, Uchida T, Becker SO, Hirashima Shikata T, Komine F, Moriyama M, Arakawa Y, Mima S, Mizokami M. Variations of hepatitis
, 百拇医药
B precore/core gene sequence in acute and fulminant hepatitis B. Dig Dis Sci, 1994;39:1281-1287
6 Wen YM. International Symposium Molecular Virology, Xi'an, China, 1996-10-06/10:5
7 Vento S, Di-perri G, Concia E, Bassetti D. Prognosis of vertically transmitted pre-core mutant HBV infection [letter].
Lancet, 1994;343:859-860
8 Ono Y, Onda H, Sasada R, Igarashi K, Sugino Y, Nishioka K. The complete nuclectide sequences of the cloned hepatitis B virus
DNA; subtype adr and adw. Nucleic Acids Res, 1983;11:1747-1757, 百拇医药(郭晏海 闫小君 任峰玲 崔大祥 侯 瑜 赵锦荣 韩锋产 苏成芝)
项目负责人 郭晏海中国人民解放军第四军医大学全军基因诊断技术研究所 陕西省西安市 710033
收稿日期 1999-05-21 接收日期 1999-07-25
Subject headings hepatitis B/diagnosis; hepatitis B virus; mutation; polymerase chain reaction
主题词 乙型肝炎病毒；肝炎，乙型/诊断；突变；聚合酶链反应
, http://www.100md.com
1989年Brunetto et al[1]和Carman et al[2]先后报道抗-Hbe阳性的慢性肝炎患者中，发现了HBV前C区突变株，即在前C区1896点TGG转变为TAG，产生终止码，阻止HBeAg合成. 后来在许多国家和地区都相继发现了相同的突变株. 在我国也有许多关于前C区突变与慢性肝炎肝硬变有关的报道[6]. 这些报道总体上说明1896点突变株在毒力上不但比野型株强，而且与野型株有相同的复制和感染能力. 我们用双重PCR方法对HBV感染者血清中HBV DNA前C区1896点的突变率进行检测，研究其在不同类型乙型肝炎中的发生率及其临床意义.
1 材料和方法
1.1 材料 Thermolyne PCR扩增仪(美国)：Taq DNA聚合酶和dNTP(Promega公司)；含HBV DNA的pUC19质粒，其中pUC19HBV1为adr型野型序列，pUC19HBV2为adr型前C区1896点(G→A)突变型序列. HBV DNA序列来自文献[5，8]，引物序列位于前C/C区保守序列，用oligo引物设计软件辅助设计引物，各条引物序列分别为：检测HBV DNA的通用引物B1(上游2050～2069)5’-TCACCATACAGCACTCAGGC；检测1896点突变引物B2(上游1877—1876)5’-CTGTGCCT-TGGGTGGCTTTA；下游共用引物B3(2458—2493)5’-CTAACATTGAGATTCCCGAG. 血清标本来自第四军医大学西京医院检验科，西安医科大学第一、第二附属医院检验科，西安市第一医院检验科. 其中50例急性乙型肝炎患者，HBeAg阳性，男34例，女16例，年龄19岁～49岁；50例慢性乙型肝炎患者，抗-HBe阳性，男32例，女18例，年龄31岁～54岁；另有20例健康携带者血清HBV DNA阳性，HBsAg阳性，而ALT正常. HBV各项指标检测结果见表1.
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表1 HBsAg阳性急慢性乙型肝炎检测结果
| 分类 | n | ALT | 两对半 | HBV野型 | HBV突变型 | 突变率 |
| HBsAg阳性 | 20 | 正常 | 1 | 17 | 3 | 15% |
| 急性 | 50 | 升高 | 1.3.5 | 44 | 6 | 12% |
| 慢性 | 50 | 升高 | 1.4.5 | 22 | 28 | 56% |
两对半次序：①HBsAg，②抗-HBs，③HBeAg，④抗-HBe，⑤抗-HBc.升高：指明显高于正常值.
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1.2 方法 血清标本有酚/氯仿抽提乙酚沉淀法，主要过程见文献[4]. 取血清标本处理液5μL加于25μL PCR反应液中，使PCR反应化系为30μL(其中10×PCR反应缓冲液3μL，dNTP各200μmol/L，Taq DNA聚合酶U，循环反应94℃ 30s，58℃，30s，72℃ 40s，循环35次，最后72℃再延伸3min，PCR扩增完毕，取10μL PCR产物进行20g/L的琼脂糖凝胶电泳. 凡是1896点无突变的HBV DNA只能扩出一条带，片段长度为409bp，而有1896点有突变(G→A)的能扩增出2条带，分别是409bp和580bp.
2 结果
2.1 双重PCR方法的特异性 用双重PCR方法对野型pUCHBV DNA序列和有1896点突变的pUCHBV DNA序列进行扩增，野型HBV DNA只扩增出一条带(409bp)而突变型HBV DNA能扩增出2条(409bp和580bp)；对HBV DNA阴性血清扩增不出带. 同时用该方法对HCMV DNA，HPV6，11，16 DNA，pUC19质粒DNA，HAV RNA，HCV RNA分别进行扩增，都扩增不出特定大小的片段，说明3条引物对扩增HBV DNA是特异的.
, 百拇医药
2.2 双重PCR方法的灵敏性 分别对含有野型和1896点突变型HBV DNA序列的pUC19质粒进行纯化并定量，再分别10倍梯度稀释为每5μL含靶序列为1×106，1×105，1×104，1×103，1×102，1×101. 该PCR方法对两组稀释梯度都能扩增到1×101/5μL. 这一灵敏度能达到检测的需要.
2.3 血清中HBV DNA的检出结果 HBV正常携带者20例，检出突变株3例，突变为15%；而50例急性乙型肝炎突变株为6例，突变率为12%，50例慢性乙型肝炎该点突变率为56%(28例突变株).
3 讨论
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在本实验中，我们采用了双重PCR方法，一次PCR检测不仅可以检测血清中有无HBV DNA而且可以检测出血清中的HBV DNA有无前C区1896点突变(G→A)，这样大大地简化了实验操作，同时我们对该PCR方法进行了灵敏性和特异性研究，发现其只能扩增HBV DNA前C区/C区特定片段，并且对野型和突变型检测都能达到1×101靶模板拷贝数的水平. 由于我们是从200μL血清中抽提HBV DNA并乙醇沉淀，最后溶于20μL TE缓冲液中，取5μL进行PCR扩增，那么该PCR检测血清中HBV DNA浓度为2×105cop/L，而一般HBV DNA感染者血清HBV DNA浓度远高于此限，因此，该双重PCR方法能达到检测需要.
本实验将研究对象分成3组，即：正常携带者，急性，慢性乙型肝炎. 对HBsAg阳性，ALT正常的正常携带者进行检测，发现其中有HBV DNA阳性者，突变株发生率为15%(3/20). 急性乙型肝炎突变率为12%，(6/50)，慢性乙型肝炎突变率为56%(28/50)，前两者之间突变发生率无显著差别(P>0.05)，而后两者之间有显著性差异(P<0.05). HBV DNA前C区1896点突变产生的主要由以下原因造成，首先是由于HBV DNA的复制方法，即通过mRNA中间体进行逆转录合成cDNA，该过程由于缺乏校正酶来校正复制中出现的错误，故容易引起突变；每个核苷酸每年突变率约为1×10-5～3×10-5[3]. 同时由于1896点突变与该区其他几处突变相比，对HBV DNA复制能力无明显影响，甚至突变株比野型株在某些方面更有优势，加上机体免疫压力作用，促成该突变类型最常发生[7]. 实验结果显示：正常携带者比急性患者1896点(G-A)发生率明显低，分别为15%和56%. 这与上面的推论相符. 因为前者机体免疫压力小，而后者的免疫压力大；同时发现突变发生与感染时间的长短有关，因为同样是在免疫压力较大的情况下，急性和慢性乙型肝炎的突变发生率相差明显，感染时间短的急性患者突变率为12%，而感染时间长的慢性患者突变率为56%，说明机体免疫压力和感染时间是该突变发生的主要因素，缺少其一将会使突变发生率降低.
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目前多数人认为，前C区1896点突变(G-A)产生终止密码，不能合成分泌HBeAg，则能逃避机体的免疫清除作用，同时，其复制能力无明显影响可作为一种新型稳定的病毒株取代野型株在体内长期生存，而且有研究表明突变株还能作为一稳定株在人群间传播，那么势必会造成最终突变型HBV DNA取代野型HBV DNA[6]. 而我们检测的抗-HBe阳性慢性乙型肝炎的1896点突变率和3a前报道的并无明显升高，这与上面的推论不符，如果3年时间不足以显示突变型取代野型的发展趋势的话. 那么至少新感染的乙型肝炎患者中的突变发生率应与抗-HBe慢性乙型肝炎的突变率相接近，但检测结果却显示两者相差悬殊. 因此我们认为该突变型HBV的复制和传染性上，总体上要比野型HBV DNA要弱，这一点与以往多数报道的结果不一致.
总之，1896点突变应是由HBV DNA自身的易突变性以及机体免疫压力长期作用选择的结果. 突变的结果可以暂时减弱机体对该突变株的免疫清除能力. 突变株的复制能力和传染性要比野型要弱，而且我们认为单1896点突变与肝炎的严重程度关系不大，促成肝炎恶化的病因可能是与HBV多位点突变有关. 肝炎加重的主要原因还在机体免疫和肝细胞功能变化等方面. 这些推理需要更为细致的研究加以证实.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Brunetto MR, Sternler M, Schodel F. Identification of HBV variants which cannot produce precore derived HBeAg and may
be responsible for severe hepatitis. Ital J Gastroenterol, 1982;21:151-155
2 Carman WF, Jacyna MR, Hadziyannis S, Karayiannis PM, Cgarvey MJ, Makris A, Thomas HC. Mutation preventing formation of
hepatitis Be antigen in patients with chronic hepatitis B infection. Lancet, 1989;2:588-591
, 百拇医药
3 Akarca US, Lok AS. Naturally occurring hepatitis B virus core gene mutations. Hepatology, 1995;22:50-60
4 Akarca US, Greene S, Lok AS. Detection of precore hepatitis B virus mutants in asymptomatic HBcAg-positive family
member. Hepatology, 1994;19:1366-1370
5 Aye TT, Uchida T, Becker SO, Hirashima Shikata T, Komine F, Moriyama M, Arakawa Y, Mima S, Mizokami M. Variations of hepatitis
, 百拇医药
B precore/core gene sequence in acute and fulminant hepatitis B. Dig Dis Sci, 1994;39:1281-1287
6 Wen YM. International Symposium Molecular Virology, Xi'an, China, 1996-10-06/10:5
7 Vento S, Di-perri G, Concia E, Bassetti D. Prognosis of vertically transmitted pre-core mutant HBV infection [letter].
Lancet, 1994;343:859-860
8 Ono Y, Onda H, Sasada R, Igarashi K, Sugino Y, Nishioka K. The complete nuclectide sequences of the cloned hepatitis B virus
DNA; subtype adr and adw. Nucleic Acids Res, 1983;11:1747-1757, 百拇医药(郭晏海 闫小君 任峰玲 崔大祥 侯 瑜 赵锦荣 韩锋产 苏成芝)