胃癌及癌前病变组织中细胞凋亡和增殖的原位观察
中国医科大学肿瘤研究所 辽宁省沈阳市 110001
项目负责人 张忠，现在沈阳医学院病理教研室，110031，辽宁省沈阳市.
收稿日期 1999-01-20 接收日期 1999-06-08
Subject headings stomach neoplasms; precancerous condition; apoptosis
主题词 胃肿瘤；癌前状态；细胞凋亡
肿瘤的发生发展是一个较长的、多步骤的过程，细胞凋亡和细胞增殖在其中起到重要作用. 目前，对胃癌前各阶段病变及胃癌中细胞凋亡和增殖状态的比较研究未见报道. 我们应用DNA缺口末端标记(DNEL)技术[1]和增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色技术对正常胃粘膜、胃癌前病变及胃癌细胞凋亡和增殖状态进行动态观察和比较研究，以期揭示二者在胃癌发生发展过程中的变化规律和作用.
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1 材料和方法
1.1 材料 辽宁庄河胃癌高发区高危人群接受内镜筛检者130例，其中包括基本正常胃粘膜20例，慢性浅表性胃炎30例，慢性萎缩性胃炎30例，异型增生30例和胃癌20例. 每例于内镜下取新鲜胃粘膜，经950mL/L酒精固定，石蜡包埋，制成5μm厚的连续切片，分别用于HE染色、DNEL染色和PCNA免疫组化染色.
1.2 方法
1.2.1 DNEL染色 即DNA缺口末端标记技术，试剂盒为美国Oncor公司产品. 染色步骤：①切片常规脱蜡入水；②20mg/L蛋白酶K消化液作用15min；③30mL/L H2O2封闭20min；④滴加平衡缓冲液，室温下作用30s；⑤滴加脱氧核糖核酸末端转移酶(TdT)，于37℃湿盒中，孵育60min；⑥在STOP/WASH缓冲液中孵育10min，37℃；⑦滴加过氧化物酶，于室温湿盒中孵育30min；⑧DAB显色，甲基绿复染，脱水透明，封片. 以PBS替代TdT酶作为阴性对照.
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1.2.2 PCNA免疫组化染色 采用SP法. SP试剂盒为美国Zymed公司产品；第一抗体为美国Zymed公司生产的PCNA单克隆抗体(PC10)，1∶50稀释. 染色程序按SP法操作常规. 以PBS代替一抗作为阴性对照. 经DNEL染色和PCNA免疫组化染色后，于高倍镜下数5个以上有代表性视野，共计不少于1000个细胞，计数阳性细胞，计算DNEL染色阳性细胞指数(凋亡指数)和PCNA染色阳性细胞指数(增殖指数). 以凋亡指数/增殖指数作为凋亡/增殖比率. 两样本上述观察指标的均数比较采用t检验.
2 结果
2.1 DNEL和PCNA阳性细胞的分布 DNEL染色阳性细胞(凋亡细胞)，其胞核呈棕黄色细颗粒状或弥漫性，个别细胞核膜增厚呈棕黄色. 在基本正常胃粘膜，该细胞较少，零星散布于表层上皮；在慢性浅表性胃炎，由表层上皮至腺体颈部均可见较多簇状或散在分布的凋亡细胞；在慢性萎缩性胃炎，呈散在或簇状分布的凋亡细胞，可分布至表层上皮与腺颈部间的中间区；在异型增生，散在或簇状分布的凋亡细胞限于表层上皮附近；在胃癌，凋亡细胞极少，偶见于癌组织浅层. PCNA染色阳性细胞(增殖细胞)，其胞核呈棕黄色颗粒状. 在基本正常胃粘膜，较少的增殖细胞散布于粘膜腺体颈部；在慢性浅表性胃炎，限于腺颈部的增殖细胞可呈簇状或散在分布；在慢性萎缩性胃炎，限于腺体颈部的增殖细胞多呈簇状分布；在异型增生，簇状分布的增殖细胞较多，甚至于表层上皮附近亦可见较多散在的增殖细胞；在胃癌，增殖细胞极多，呈集簇状分布，遍布于癌组织.
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2.2 不同胃粘膜上皮细胞凋亡和细胞增殖的比较 慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎和异型增生，其凋亡指数均高于基本正常胃粘膜，其中前二者差异具有显著性(P<0.01)；而在胃癌，凋亡指数则低于基本正常胃粘膜. 各组胃癌前病变的增殖指数均显著高于基本正常胃粘膜(P<0.01). 在慢性浅表性胃炎和慢性萎缩性胃炎，其凋亡/增殖比率高于基本正常胃粘膜，前者差异具有显著性(P<0.01)；而异型增生和胃癌的凋亡/增殖比率显著低于基本正常胃粘膜(P<0.01). 从慢性浅表性胃炎到胃癌，凋亡指数和凋亡/增殖比率均明显递减(P<0.01)；而增殖指数则递增(后三者间，P<0.01)，见表1.
表1 不同胃粘膜上皮细胞凋亡指数、增殖指数和凋亡/增殖比率(x±s)
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bP<0.01，vs 基本正常胃粘膜；dP<0.01，vs 相邻组.
3 讨论
关于胃癌的发生，Correa et al[2]指出，其是一个多阶段、多时相的致癌过程. 在这一过程中，胃粘膜上皮细胞凋亡和增殖状态可以发生改变. 本研究结果显示，在正常胃粘膜，凋亡细胞位于粘膜表层上皮，形成凋亡细胞带；增殖细胞位于粘膜腺体颈部，形成增殖细胞带. 这种分布特点体现出胃粘膜上皮由增殖带向表层逐渐成熟、衰老和死亡的生长规律. 在慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎和异型增生，凋亡细胞由表层上皮向腺颈部的分布和簇状分布逐渐减少；增殖细胞由腺颈部向表层上皮的分布和簇状分布逐渐增多. 在胃癌，凋亡细胞极少，零星散在，增殖细胞极多，遍布于癌组织. 上述改变表明，胃癌前病变和胃癌明显失去了凋亡带和增殖带的分布特点，胃癌中细胞凋亡和增殖的调节已远离正常胃粘膜而明显紊乱.
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肿瘤不仅是一种细胞增殖异常的疾病，也是一种细胞凋亡异常的疾病[3]；细胞凋亡和增殖的调控异常在肿瘤发生过程中亦起到至关重要的作用. 本研究显示，从慢性浅表性胃炎到胃癌，呈现出凋亡指数和凋亡/增殖比率明显递减，增殖指数明显递增这一变化规律；各组病变的增殖指数均高于正常胃粘膜；在慢性浅表性胃炎和慢性萎缩性胃炎，其凋亡指数和凋亡/增殖比率明显高于正常胃粘膜，而在异型增生和胃癌，凋亡指数降低，凋亡/增殖比率明显低于正常胃粘膜. 上述结果表明，在胃癌的发生过程中，胃癌前病变的细胞凋亡和增殖状态逐渐近似于胃癌的特征. 在慢性浅表性胃炎和慢性萎缩性胃炎，胃粘膜上皮细胞更新明显加快，细胞群的不稳定性明显增加，使细胞DNA对外界之致突变物和致癌物的敏感性增强；DNA在复制过程中发生内源性错误的机率增高；同时，这些细胞群亦获得了明显的生长优势. 随着病变的进一步发展，在异型增生，细胞凋亡受到抑制，具有生长优势的细胞大量增殖，导致细胞增殖和凋亡失衡而分离. 这使机体经细胞凋亡途径清除突变细胞和衰老细胞的能力降低，细胞积累速度加快，DNA受损细胞的数量和程度不断增加，进而导致胃癌的发生.
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4 参考文献
1 Gavrieli Y, Sherman Y, Shmuel AB. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear
DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992;119:493-501
2 Correa P. A human model of gastric carcinogenesis. Cancer Res, 1988;48:3554-3560
3 Sachs L, Lotem J. Control of programmed cell death in normal and leukemic cells: new implications for therapy.
Blood, 1993;82:15-21, 百拇医药(张忠 袁媛 高华 董明 吴烨秋 王兰 王梅先)
项目负责人 张忠，现在沈阳医学院病理教研室，110031，辽宁省沈阳市.
收稿日期 1999-01-20 接收日期 1999-06-08
Subject headings stomach neoplasms; precancerous condition; apoptosis
主题词 胃肿瘤；癌前状态；细胞凋亡
肿瘤的发生发展是一个较长的、多步骤的过程，细胞凋亡和细胞增殖在其中起到重要作用. 目前，对胃癌前各阶段病变及胃癌中细胞凋亡和增殖状态的比较研究未见报道. 我们应用DNA缺口末端标记(DNEL)技术[1]和增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色技术对正常胃粘膜、胃癌前病变及胃癌细胞凋亡和增殖状态进行动态观察和比较研究，以期揭示二者在胃癌发生发展过程中的变化规律和作用.
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1 材料和方法
1.1 材料 辽宁庄河胃癌高发区高危人群接受内镜筛检者130例，其中包括基本正常胃粘膜20例，慢性浅表性胃炎30例，慢性萎缩性胃炎30例，异型增生30例和胃癌20例. 每例于内镜下取新鲜胃粘膜，经950mL/L酒精固定，石蜡包埋，制成5μm厚的连续切片，分别用于HE染色、DNEL染色和PCNA免疫组化染色.
1.2 方法
1.2.1 DNEL染色 即DNA缺口末端标记技术，试剂盒为美国Oncor公司产品. 染色步骤：①切片常规脱蜡入水；②20mg/L蛋白酶K消化液作用15min；③30mL/L H2O2封闭20min；④滴加平衡缓冲液，室温下作用30s；⑤滴加脱氧核糖核酸末端转移酶(TdT)，于37℃湿盒中，孵育60min；⑥在STOP/WASH缓冲液中孵育10min，37℃；⑦滴加过氧化物酶，于室温湿盒中孵育30min；⑧DAB显色，甲基绿复染，脱水透明，封片. 以PBS替代TdT酶作为阴性对照.
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1.2.2 PCNA免疫组化染色 采用SP法. SP试剂盒为美国Zymed公司产品；第一抗体为美国Zymed公司生产的PCNA单克隆抗体(PC10)，1∶50稀释. 染色程序按SP法操作常规. 以PBS代替一抗作为阴性对照. 经DNEL染色和PCNA免疫组化染色后，于高倍镜下数5个以上有代表性视野，共计不少于1000个细胞，计数阳性细胞，计算DNEL染色阳性细胞指数(凋亡指数)和PCNA染色阳性细胞指数(增殖指数). 以凋亡指数/增殖指数作为凋亡/增殖比率. 两样本上述观察指标的均数比较采用t检验.
2 结果
2.1 DNEL和PCNA阳性细胞的分布 DNEL染色阳性细胞(凋亡细胞)，其胞核呈棕黄色细颗粒状或弥漫性，个别细胞核膜增厚呈棕黄色. 在基本正常胃粘膜，该细胞较少，零星散布于表层上皮；在慢性浅表性胃炎，由表层上皮至腺体颈部均可见较多簇状或散在分布的凋亡细胞；在慢性萎缩性胃炎，呈散在或簇状分布的凋亡细胞，可分布至表层上皮与腺颈部间的中间区；在异型增生，散在或簇状分布的凋亡细胞限于表层上皮附近；在胃癌，凋亡细胞极少，偶见于癌组织浅层. PCNA染色阳性细胞(增殖细胞)，其胞核呈棕黄色颗粒状. 在基本正常胃粘膜，较少的增殖细胞散布于粘膜腺体颈部；在慢性浅表性胃炎，限于腺颈部的增殖细胞可呈簇状或散在分布；在慢性萎缩性胃炎，限于腺体颈部的增殖细胞多呈簇状分布；在异型增生，簇状分布的增殖细胞较多，甚至于表层上皮附近亦可见较多散在的增殖细胞；在胃癌，增殖细胞极多，呈集簇状分布，遍布于癌组织.
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2.2 不同胃粘膜上皮细胞凋亡和细胞增殖的比较 慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎和异型增生，其凋亡指数均高于基本正常胃粘膜，其中前二者差异具有显著性(P<0.01)；而在胃癌，凋亡指数则低于基本正常胃粘膜. 各组胃癌前病变的增殖指数均显著高于基本正常胃粘膜(P<0.01). 在慢性浅表性胃炎和慢性萎缩性胃炎，其凋亡/增殖比率高于基本正常胃粘膜，前者差异具有显著性(P<0.01)；而异型增生和胃癌的凋亡/增殖比率显著低于基本正常胃粘膜(P<0.01). 从慢性浅表性胃炎到胃癌，凋亡指数和凋亡/增殖比率均明显递减(P<0.01)；而增殖指数则递增(后三者间，P<0.01)，见表1.
表1 不同胃粘膜上皮细胞凋亡指数、增殖指数和凋亡/增殖比率(x±s)
| 组别 | n | 凋亡指数(%) | 增殖指数(%) | 凋亡/增殖比率 |
| 基本正常胃粘膜 | 20 | 2.1±1.1 | 9.8±3.7 | 0.24±0.17 |
| 慢性浅表性胃炎 | 30 | 7.0±3.5b | 13.5±5.1b | 0.58±0.34b |
| 慢性萎缩性胃炎 | 30 | 4.1±1.8bd | 14.7±6.6b | 0.30±0.14d |
| 异 型 增 生 | 30 | 2.7±1.2d | 28.5±11.8bd | 0.11±0.07bd |
| 胃 癌 | 20 | 1.6±0.9d | 42.0±15.6bd | 0.04±0.02bd |
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bP<0.01，vs 基本正常胃粘膜；dP<0.01，vs 相邻组.
3 讨论
关于胃癌的发生，Correa et al[2]指出，其是一个多阶段、多时相的致癌过程. 在这一过程中，胃粘膜上皮细胞凋亡和增殖状态可以发生改变. 本研究结果显示，在正常胃粘膜，凋亡细胞位于粘膜表层上皮，形成凋亡细胞带；增殖细胞位于粘膜腺体颈部，形成增殖细胞带. 这种分布特点体现出胃粘膜上皮由增殖带向表层逐渐成熟、衰老和死亡的生长规律. 在慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎和异型增生，凋亡细胞由表层上皮向腺颈部的分布和簇状分布逐渐减少；增殖细胞由腺颈部向表层上皮的分布和簇状分布逐渐增多. 在胃癌，凋亡细胞极少，零星散在，增殖细胞极多，遍布于癌组织. 上述改变表明，胃癌前病变和胃癌明显失去了凋亡带和增殖带的分布特点，胃癌中细胞凋亡和增殖的调节已远离正常胃粘膜而明显紊乱.
, http://www.100md.com
肿瘤不仅是一种细胞增殖异常的疾病，也是一种细胞凋亡异常的疾病[3]；细胞凋亡和增殖的调控异常在肿瘤发生过程中亦起到至关重要的作用. 本研究显示，从慢性浅表性胃炎到胃癌，呈现出凋亡指数和凋亡/增殖比率明显递减，增殖指数明显递增这一变化规律；各组病变的增殖指数均高于正常胃粘膜；在慢性浅表性胃炎和慢性萎缩性胃炎，其凋亡指数和凋亡/增殖比率明显高于正常胃粘膜，而在异型增生和胃癌，凋亡指数降低，凋亡/增殖比率明显低于正常胃粘膜. 上述结果表明，在胃癌的发生过程中，胃癌前病变的细胞凋亡和增殖状态逐渐近似于胃癌的特征. 在慢性浅表性胃炎和慢性萎缩性胃炎，胃粘膜上皮细胞更新明显加快，细胞群的不稳定性明显增加，使细胞DNA对外界之致突变物和致癌物的敏感性增强；DNA在复制过程中发生内源性错误的机率增高；同时，这些细胞群亦获得了明显的生长优势. 随着病变的进一步发展，在异型增生，细胞凋亡受到抑制，具有生长优势的细胞大量增殖，导致细胞增殖和凋亡失衡而分离. 这使机体经细胞凋亡途径清除突变细胞和衰老细胞的能力降低，细胞积累速度加快，DNA受损细胞的数量和程度不断增加，进而导致胃癌的发生.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Gavrieli Y, Sherman Y, Shmuel AB. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear
DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992;119:493-501
2 Correa P. A human model of gastric carcinogenesis. Cancer Res, 1988;48:3554-3560
3 Sachs L, Lotem J. Control of programmed cell death in normal and leukemic cells: new implications for therapy.
Blood, 1993;82:15-21, 百拇医药(张忠 袁媛 高华 董明 吴烨秋 王兰 王梅先)