单纯疱疹病毒Ⅰ型与消化性溃疡的关系
中山医科大学孙逸仙纪念医院消化内科 广东省广州市 510120
项目负责人 王连源中山医科大学孙逸仙纪念医院消化内科 广东省广州市 510120
收稿日期 1999-05-25
Subject headings duodenal ulcer; stomach ulcer; herpes simplex virus; polymerase chain reaction
主题词 十二指肠溃疡；胃溃疡；单纯疱疹病毒；聚合酶链反应
消化性溃疡(PU)的病因和发病机制尚未完全明了. 近年来，有人认为HSV-Ⅰ与PU可能有关[1-3]，我们合成了一对DNA聚合酶序列中的特异性引物，应用PCR技术检测PU患者及正常人的胃和十二指肠粘膜中HSV-Ⅰ DNA，试图了解HSV-Ⅰ 与PU的关系.
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1 材料和方法
1.1 材料 有复发性口唇疱疹病史及其他HSV-Ⅰ感染者不纳入本试验. 入选病例年龄为18岁～65岁. 复合性溃疡不入选. 对照组30例，均为健康成人，男15例，女15例，平均年龄32.5岁. 内镜检查胃和十二指肠粘膜正常，于胃窦小弯侧(GNor)和十二指肠球部前壁(DNor)各钳取粘膜组织1块. DU组30例，男20例，女10例，平均年龄36.6岁. 内镜检查证实溃疡长径≥0.5cm，为活动期，而胃粘膜大致正常或轻微浅表性胃炎，分别于溃疡边缘(DU1)，溃疡对侧球部正常粘膜(DU2)及胃窦小弯侧(GNor)各钳取粘膜组织1块. GU组11例，男7例，女4例，平均年龄42.3岁. 内镜检查证实溃疡长径≥0.25cm，为活动期，活检排除胃癌，而十二指肠粘膜大致正常者，分别于溃疡边缘(GU1)，溃疡对侧正常粘膜(GU2)及十二指肠球部(DNor)各钳取粘膜组织1块. 以上病例标本均为孙逸仙纪念医院消化疾病研究室内镜室提供.
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1.2 方法 为了防止污染，每次取标本前后，均用戊二醛严格消毒内镜及活检钳，并经紫外线照射30min. 标本置液氮保存. 单纯疱疹病毒Ⅰ型、Ⅱ型、巨细胞病毒、B95.8细胞(含EB病毒)标准株，由中山医科大学微生物研究室提供. 取活检粘膜组织1块加400μL裂解液〔0.2mol/LTris-HCl， pH 7.5；25mmol/L EDTA；0.3mol/L NaCl；20g/L (W/N) SDS；400mg/L蛋白酶K〕，病毒培养液则取200μL加200μL裂解液，混匀后置56℃水浴30min～60min，依次用400μL酚、酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)各抽提1次，15000r/min离心10min，取上层水相加2倍体积无水乙醇沉淀(-20℃过夜). 15000r/min离心10min，弃乙醇，抽干，将DNA沉淀溶于适量无菌双蒸水中，4℃保存待用.
PCR扩增试剂盒购自PE公司. HSV-Ⅰ特异性引物的序列为：
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引物Ⅰ：5＇CATCACCGACCCGGAGAGGGAC-3＇
引物Ⅱ：5＇GGGCCAGGCGCTTGTTGGTGTA-3＇
扩增的序列位于DNA聚合酶基因3160bp～3251bp，扩增片段为92bp. 引物由军事医学科学院基因工程室合成.
PCR总反应体积50μL. 在0.5mL Eppendorf管中依次加入：5×buffer 10μL，dNTP(各2mmol/L)5μL，模板DNA 10μL，上、下游引物各1μL(0.1mg/L)，ddHO 2μL，Taq DNA多聚酶0.5μL～1.0μL，混匀后覆盖石蜡油，用480 DNA热循环仪扩增. 扩增完毕，取10μL扩增产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果. 用计算机分析扩增片段的序列，用Rsa Ⅰ内切酶对扩增产物进行酶切鉴定. Ras Ⅰ酶可将HSV-Ⅰ特异扩增产物切成20bp，72bp的片段(图1，2).
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图1 HSV-Ⅰ型特异性引物PCR结果.1，6：PBR 322/Hinfol; 2～5分别为EBV，HCMV，HSV-Ⅱ,HSV-Ⅰ的PCR扩增片段；7～8：胃溃疡标本的PCR结果(阳性、阴性)；9～10：十二指肠溃疡标本的PCR结果(阴性、阳性).
图2 HSV-Ⅰ型特异性PCR扩增片段酶切分析1：RsaⅠ内切酶酶切HSV-Ⅰ的PCR扩增片段；3：PBR 322/HinfⅠ；2，4：HSV-Ⅰ的PCR扩增片段；5，6：Rsa Ⅰ内切酶酶切胃溃疡、十二指肠溃疡标本的PCR扩增片段.
PCR产物可直接用于酶切，或先用低溶点琼脂糖法回收后再行酶*$切. 取PCR产物10μL加5μL限制性内切酶，2μL 10×buffer，最后用无菌双蒸水补至20μL，置37℃水浴1h～2h. 酶切产物用100g/L聚丙烯酰胺凝胶(Acr∶bis=30∶1)电泳，溴乙锭(0.5mg/L)染色，紫外透射仪上观察.
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统计学处理 两个或两个以上样本率的显著性检验用χ2检验，显著性水准为P<0.05.
2 结果
PCR扩增HSV-Ⅰ标准株和各组阳性标本都获得约92bp单一DNA片段(图1). 扩增产物用RsaⅠ内切酶切割都获得约72bp和20bp的DNA片段(图2). 实验结果与设计预期相符，表明PCR扩增产物为HSV-Ⅰ的特异性DNA片段. PCR检测各组标本中HSV-Ⅰ DNA阳性情况和部位分布情况见表1.
表1 各组标本HSV-Ⅰ DNA阳性情况及部位分布(n，%)
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3 讨论
1990年Lorh et al[4]采用PCR检测22例PU患者和33例对照组的胃和十二指肠粘膜中HSV-Ⅰ DNA，仅发现4例PU患者的溃疡边缘粘膜中HSV-Ⅰ DNA阳性，而远离溃疡的粘膜和对照组中均没有检测到HSV-Ⅰ DNA. 他们认为HSV-Ⅰ感染可能与PU有关. 我们研究室既往采用ABC技术检测PU患者的胃和十二指肠粘膜中HSV-Ⅰ抗原，其结果支持HSV-Ⅰ感染与PU发病有关，尤其是与DU关系明显. 我们采用PCR检测的结果与Lorh的结果有差异. 我们的结果显示，DU患者的DU1和DU2粘膜中HSV-Ⅰ DNA阳性率明显高于对照组. HSV-Ⅰ感染与DU可能有关，但可能不是DU的直接因素. 是否HSV-Ⅰ感染会加速DU的形成是否HSV-Ⅰ感染可能使DU成为慢性过程或是否HSV-Ⅰ感染可能与DU的复发有关系这些关系仍需要更进一步探讨. 我们的结果还显示，GU患者的GU1和GU2粘膜中HSV-Ⅰ DNA阳性率稍高于对照组，但无统计学的显著性差异，这可能与GU的例数较少或与GU的病因和发病机制与DU不同有关.
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4 参考文献
1 邓联民，袁世珍，陈国桢. 消化性溃疡与单纯疱疹病毒Ⅰ型关系. 中华内科杂志，1992；31：371
2 Archimandritis A. Herpes simplex virus types 1 and 2 and cytomegalovirus in peptic ulcer disease and non-ulcer
dyspepsia. Hepato-Gastroenterol, 1992;19:540-541
3 Rand KH. Antibodies to hepes simplex types 1 in patients with active duodenal ulcer. Arch Intern Med, 1983;143
4 Lorh JM, Nelson JA, Oldstone MBA. Is herpe simplex virus associated with peptic ulcer disease J Virol, 1990;64:2168-2174, 百拇医药(王连源 张厚德 袁世珍 卓礼梅 陈火胜)
项目负责人 王连源中山医科大学孙逸仙纪念医院消化内科 广东省广州市 510120
收稿日期 1999-05-25
Subject headings duodenal ulcer; stomach ulcer; herpes simplex virus; polymerase chain reaction
主题词 十二指肠溃疡；胃溃疡；单纯疱疹病毒；聚合酶链反应
消化性溃疡(PU)的病因和发病机制尚未完全明了. 近年来，有人认为HSV-Ⅰ与PU可能有关[1-3]，我们合成了一对DNA聚合酶序列中的特异性引物，应用PCR技术检测PU患者及正常人的胃和十二指肠粘膜中HSV-Ⅰ DNA，试图了解HSV-Ⅰ 与PU的关系.
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1 材料和方法
1.1 材料 有复发性口唇疱疹病史及其他HSV-Ⅰ感染者不纳入本试验. 入选病例年龄为18岁～65岁. 复合性溃疡不入选. 对照组30例，均为健康成人，男15例，女15例，平均年龄32.5岁. 内镜检查胃和十二指肠粘膜正常，于胃窦小弯侧(GNor)和十二指肠球部前壁(DNor)各钳取粘膜组织1块. DU组30例，男20例，女10例，平均年龄36.6岁. 内镜检查证实溃疡长径≥0.5cm，为活动期，而胃粘膜大致正常或轻微浅表性胃炎，分别于溃疡边缘(DU1)，溃疡对侧球部正常粘膜(DU2)及胃窦小弯侧(GNor)各钳取粘膜组织1块. GU组11例，男7例，女4例，平均年龄42.3岁. 内镜检查证实溃疡长径≥0.25cm，为活动期，活检排除胃癌，而十二指肠粘膜大致正常者，分别于溃疡边缘(GU1)，溃疡对侧正常粘膜(GU2)及十二指肠球部(DNor)各钳取粘膜组织1块. 以上病例标本均为孙逸仙纪念医院消化疾病研究室内镜室提供.
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1.2 方法 为了防止污染，每次取标本前后，均用戊二醛严格消毒内镜及活检钳，并经紫外线照射30min. 标本置液氮保存. 单纯疱疹病毒Ⅰ型、Ⅱ型、巨细胞病毒、B95.8细胞(含EB病毒)标准株，由中山医科大学微生物研究室提供. 取活检粘膜组织1块加400μL裂解液〔0.2mol/LTris-HCl， pH 7.5；25mmol/L EDTA；0.3mol/L NaCl；20g/L (W/N) SDS；400mg/L蛋白酶K〕，病毒培养液则取200μL加200μL裂解液，混匀后置56℃水浴30min～60min，依次用400μL酚、酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)各抽提1次，15000r/min离心10min，取上层水相加2倍体积无水乙醇沉淀(-20℃过夜). 15000r/min离心10min，弃乙醇，抽干，将DNA沉淀溶于适量无菌双蒸水中，4℃保存待用.
PCR扩增试剂盒购自PE公司. HSV-Ⅰ特异性引物的序列为：
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引物Ⅰ：5＇CATCACCGACCCGGAGAGGGAC-3＇
引物Ⅱ：5＇GGGCCAGGCGCTTGTTGGTGTA-3＇
扩增的序列位于DNA聚合酶基因3160bp～3251bp，扩增片段为92bp. 引物由军事医学科学院基因工程室合成.
PCR总反应体积50μL. 在0.5mL Eppendorf管中依次加入：5×buffer 10μL，dNTP(各2mmol/L)5μL，模板DNA 10μL，上、下游引物各1μL(0.1mg/L)，ddHO 2μL，Taq DNA多聚酶0.5μL～1.0μL，混匀后覆盖石蜡油，用480 DNA热循环仪扩增. 扩增完毕，取10μL扩增产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果. 用计算机分析扩增片段的序列，用Rsa Ⅰ内切酶对扩增产物进行酶切鉴定. Ras Ⅰ酶可将HSV-Ⅰ特异扩增产物切成20bp，72bp的片段(图1，2).
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图1 HSV-Ⅰ型特异性引物PCR结果.1，6：PBR 322/Hinfol; 2～5分别为EBV，HCMV，HSV-Ⅱ,HSV-Ⅰ的PCR扩增片段；7～8：胃溃疡标本的PCR结果(阳性、阴性)；9～10：十二指肠溃疡标本的PCR结果(阴性、阳性).
图2 HSV-Ⅰ型特异性PCR扩增片段酶切分析1：RsaⅠ内切酶酶切HSV-Ⅰ的PCR扩增片段；3：PBR 322/HinfⅠ；2，4：HSV-Ⅰ的PCR扩增片段；5，6：Rsa Ⅰ内切酶酶切胃溃疡、十二指肠溃疡标本的PCR扩增片段.
PCR产物可直接用于酶切，或先用低溶点琼脂糖法回收后再行酶*$切. 取PCR产物10μL加5μL限制性内切酶，2μL 10×buffer，最后用无菌双蒸水补至20μL，置37℃水浴1h～2h. 酶切产物用100g/L聚丙烯酰胺凝胶(Acr∶bis=30∶1)电泳，溴乙锭(0.5mg/L)染色，紫外透射仪上观察.
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统计学处理 两个或两个以上样本率的显著性检验用χ2检验，显著性水准为P<0.05.
2 结果
PCR扩增HSV-Ⅰ标准株和各组阳性标本都获得约92bp单一DNA片段(图1). 扩增产物用RsaⅠ内切酶切割都获得约72bp和20bp的DNA片段(图2). 实验结果与设计预期相符，表明PCR扩增产物为HSV-Ⅰ的特异性DNA片段. PCR检测各组标本中HSV-Ⅰ DNA阳性情况和部位分布情况见表1.
表1 各组标本HSV-Ⅰ DNA阳性情况及部位分布(n，%)
| 部位 | 正常组(n=30) | DU组(n=30) | GU组(n=11)阳性 | |||
| 阳性 | 阳性率(%) | 阳性 | 阳性率(%) | 阳性 | 阳性率(%) | |
| GNor | 0 | 0.0 | 1 | 3.3 | 0 | 0.0 |
| DNor | 1 | 3.3 | ||||
| DU1 | 6 | 20.0 | ||||
| DU2 | 8 | 26.6 | ||||
| GU1 | 2 | 18.1 | ||||
| GU2 | 1 | 9.05 |
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3 讨论
1990年Lorh et al[4]采用PCR检测22例PU患者和33例对照组的胃和十二指肠粘膜中HSV-Ⅰ DNA，仅发现4例PU患者的溃疡边缘粘膜中HSV-Ⅰ DNA阳性，而远离溃疡的粘膜和对照组中均没有检测到HSV-Ⅰ DNA. 他们认为HSV-Ⅰ感染可能与PU有关. 我们研究室既往采用ABC技术检测PU患者的胃和十二指肠粘膜中HSV-Ⅰ抗原，其结果支持HSV-Ⅰ感染与PU发病有关，尤其是与DU关系明显. 我们采用PCR检测的结果与Lorh的结果有差异. 我们的结果显示，DU患者的DU1和DU2粘膜中HSV-Ⅰ DNA阳性率明显高于对照组. HSV-Ⅰ感染与DU可能有关，但可能不是DU的直接因素. 是否HSV-Ⅰ感染会加速DU的形成是否HSV-Ⅰ感染可能使DU成为慢性过程或是否HSV-Ⅰ感染可能与DU的复发有关系这些关系仍需要更进一步探讨. 我们的结果还显示，GU患者的GU1和GU2粘膜中HSV-Ⅰ DNA阳性率稍高于对照组，但无统计学的显著性差异，这可能与GU的例数较少或与GU的病因和发病机制与DU不同有关.
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4 参考文献
1 邓联民，袁世珍，陈国桢. 消化性溃疡与单纯疱疹病毒Ⅰ型关系. 中华内科杂志，1992；31：371
2 Archimandritis A. Herpes simplex virus types 1 and 2 and cytomegalovirus in peptic ulcer disease and non-ulcer
dyspepsia. Hepato-Gastroenterol, 1992;19:540-541
3 Rand KH. Antibodies to hepes simplex types 1 in patients with active duodenal ulcer. Arch Intern Med, 1983;143
4 Lorh JM, Nelson JA, Oldstone MBA. Is herpe simplex virus associated with peptic ulcer disease J Virol, 1990;64:2168-2174, 百拇医药(王连源 张厚德 袁世珍 卓礼梅 陈火胜)