山东地区庚肝病毒的流行病学及部分核酸序列测定
中国人民解放军88医院传染科 山东省泰安市 271000
项目负责人 于建国中国人民解放军88医院传染科 山东省泰安市 271000
收稿日期 1998-09-11
Subject headings Hepatitis G virus; Nucleotide sequence; hepatitis C/epidemiology
主题词 庚肝病毒；核苷酸序列；肝炎，丙型/流行病学
庚型病毒性肝炎是1995年才确认的一种新型肝炎[1]. 为探讨庚型肝炎病毒(HGV)感染的检测方法及HGV山东株感染及变异的情况，我们对部分慢性肝病(CLD)患者的血清进行RT-PCR检测，并对PCR扩增产物作HGVCE1区部分核苷酸序列分析.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 本组96例CLD患者血清来自山东地区系1994/1997在本院住院和门诊长期随访患者. 全部病例均经临床和病理确诊证实.
1.2 方法 ①引物设计与PCR扩增采用半巢式PCR技术扩增中国山东株HGVCE1区部分基因片段. 根据中国株HGV5’端非编码区序列设计引物. 外引物P1/P2序列为：P1∶5’-TGGTGATGGACTGAACAGCTGG-3’；P2∶5’-GGAGTTGTCCTGTTGACGAAG-3’. 内引物序列为P1/P3，P3∶5’-AAAGGGGCCACTGATT-3’. ②PCR产物纯化及克隆测序是从琼脂糖凝胶电泳中回收PCR产物，纯化后直接与T载体进行连接转化至XL1-Blue菌中，鉴定后提取质粒DNA. 采用ABI 373自动测序仪进行cDNA双链测定. ③DNA序列比较采用军科院编制的Goldkey软件进行计算机分析.
, 百拇医药
2 结果
对96例CLD患者进行HGVRNA检测，检出HGV-RNA阳性标本29例(30.2%). HGV山东株PCR产物约为400bp，部分序列分析结果见图1. 该序列与中国第1株U75356及另1株U94695相对应位置的核苷酸序列同源性均为87%，与美国株U44402，U45966，U36380和日本株d87255同源性分别为84%，84%，86%和81%，与上述6株国内外已发表的HGV株氨基酸同源性均在90%以上.
3 讨论
我国是多种肝炎病毒感染的高发区，HGV是继甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒后发现的一种新型肝炎病毒. 近2a来，国内外对该病毒感染进行了广泛而深入的研究，其研究之速度超过过去任何一种嗜肝病毒，但至今尚无可靠的免疫方法检测到完整病毒. 目前认为较准确的免疫方法仍是RT-PCR方法检测HGV-RNA，国内外对HGV研究的大多数仍限于HGV的发现和核苷酸序列分析，如Leary et al[2]克隆并测定了病毒全基因，该病毒被称为GBV-C. Linnen et al[3]克隆测定了两株病毒序列分别为U44402和U45966. 国内周育森et al[4]首次报道了中国人的HGV全序列，并在GenBank注册登记(注册号U75356). 本组检出1例5a前有明确输血史的慢性丙肝患者，HCVRNA定量为108～1010拷贝/L，HGVRNA PCR法复检两次阳性，肝活检病理证实为慢性丙肝(G2，G3). 该例患者HGV测序核苷酸水平与中国株U75356和U94695两株相比同源性均为87%，与美国三株U44402和U45966、U36380及日本株d87255同源性相近似.
, http://www.100md.com
U75356 TCACGACCATTTGAGCCGGGATTGACATGGCAGTCGTGCTCGTGCAGGGCGAATGGGTCG
U94695-----C--T--GC-------------G--------------A------T-------T---
shan01---A----C--C--------TC-------------C--T--------------------T
U36380-----G--T--C---G-C--G-----T--------T--T--T------T----C-----C
U44402-----C--C-----CTAC--G-----T------A-C-----T--------C--C--T---
, 百拇医药
U45966--T--C--C-----CTAC--G--------------T--T--C--------T---------
U87255--T--C--C-----C-GT--G-----T--------T-----T--T-----T--C--T---
图1 HGV山东株部分cDNA序列(400bp)与已发表HGV株序列比较(U75356，U94695中国株)；(U44402,U45966,U36380美国株)；(d87225日本株).
目前，仅对少数病例进行部分核酸序列测定，我们测定的首例山东株是否与国内外已发表的多株序列属同一个基因亚型还需进一步研究.
4 参考文献
, http://www.100md.com
1 Simons JN，Leary TP, Dawson GJ，Pilot-Matias TJ，Muerhoff AS，Schlauder GG，Desai SM，Mushahwar IK. Isolation of novel
virus-like sequences associated with human hepatitis. Nature Med, 1995;1:564-569
2 Leary TP, Muerhoff AS, Simons JN, Pilot-Matias TJ, Erker JC, Chalmers ML，Schlauder GG，Dawson GJ，Desai SM, Mushahwar
IK. Sequence and genomic organization of GBV-C:a novel member of the Flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis.
, http://www.100md.com
J Med, Virol, 1996;48:60-67
3 Linnen J, Wages J, Zhang-adziyannis S, Karayiannis P, Fung K, Nakatsuji Y, Shih JWK, Young L, Piatak M, Hoover C, Fernandez J,Chens Zou JC, Morris T, Hyams KC, Lsmay S, Lifson JD, Hess G, Foung SKH, Thomas H, Bradley D, Margolis H, Kim JP.
Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a transfusion-transmissible agent. Science, 1996;271:505-508
4 周育森，王海涛，唐时幸，王竞，陈薇，赵秋敏，张习坦. 中国人庚型肝炎病毒(HGV)部分基因克隆和cDNA序列测定.
军事医学科学院院刊，1996；20：160, http://www.100md.com(于建国 商庆华 韩纪举 周秀梅 张玉琦)
项目负责人 于建国中国人民解放军88医院传染科 山东省泰安市 271000
收稿日期 1998-09-11
Subject headings Hepatitis G virus; Nucleotide sequence; hepatitis C/epidemiology
主题词 庚肝病毒；核苷酸序列；肝炎，丙型/流行病学
庚型病毒性肝炎是1995年才确认的一种新型肝炎[1]. 为探讨庚型肝炎病毒(HGV)感染的检测方法及HGV山东株感染及变异的情况，我们对部分慢性肝病(CLD)患者的血清进行RT-PCR检测，并对PCR扩增产物作HGVCE1区部分核苷酸序列分析.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 本组96例CLD患者血清来自山东地区系1994/1997在本院住院和门诊长期随访患者. 全部病例均经临床和病理确诊证实.
1.2 方法 ①引物设计与PCR扩增采用半巢式PCR技术扩增中国山东株HGVCE1区部分基因片段. 根据中国株HGV5’端非编码区序列设计引物. 外引物P1/P2序列为：P1∶5’-TGGTGATGGACTGAACAGCTGG-3’；P2∶5’-GGAGTTGTCCTGTTGACGAAG-3’. 内引物序列为P1/P3，P3∶5’-AAAGGGGCCACTGATT-3’. ②PCR产物纯化及克隆测序是从琼脂糖凝胶电泳中回收PCR产物，纯化后直接与T载体进行连接转化至XL1-Blue菌中，鉴定后提取质粒DNA. 采用ABI 373自动测序仪进行cDNA双链测定. ③DNA序列比较采用军科院编制的Goldkey软件进行计算机分析.
, 百拇医药
2 结果
对96例CLD患者进行HGVRNA检测，检出HGV-RNA阳性标本29例(30.2%). HGV山东株PCR产物约为400bp，部分序列分析结果见图1. 该序列与中国第1株U75356及另1株U94695相对应位置的核苷酸序列同源性均为87%，与美国株U44402，U45966，U36380和日本株d87255同源性分别为84%，84%，86%和81%，与上述6株国内外已发表的HGV株氨基酸同源性均在90%以上.
3 讨论
我国是多种肝炎病毒感染的高发区，HGV是继甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒后发现的一种新型肝炎病毒. 近2a来，国内外对该病毒感染进行了广泛而深入的研究，其研究之速度超过过去任何一种嗜肝病毒，但至今尚无可靠的免疫方法检测到完整病毒. 目前认为较准确的免疫方法仍是RT-PCR方法检测HGV-RNA，国内外对HGV研究的大多数仍限于HGV的发现和核苷酸序列分析，如Leary et al[2]克隆并测定了病毒全基因，该病毒被称为GBV-C. Linnen et al[3]克隆测定了两株病毒序列分别为U44402和U45966. 国内周育森et al[4]首次报道了中国人的HGV全序列，并在GenBank注册登记(注册号U75356). 本组检出1例5a前有明确输血史的慢性丙肝患者，HCVRNA定量为108～1010拷贝/L，HGVRNA PCR法复检两次阳性，肝活检病理证实为慢性丙肝(G2，G3). 该例患者HGV测序核苷酸水平与中国株U75356和U94695两株相比同源性均为87%，与美国三株U44402和U45966、U36380及日本株d87255同源性相近似.
, http://www.100md.com
U75356 TCACGACCATTTGAGCCGGGATTGACATGGCAGTCGTGCTCGTGCAGGGCGAATGGGTCG
U94695-----C--T--GC-------------G--------------A------T-------T---
shan01---A----C--C--------TC-------------C--T--------------------T
U36380-----G--T--C---G-C--G-----T--------T--T--T------T----C-----C
U44402-----C--C-----CTAC--G-----T------A-C-----T--------C--C--T---
, 百拇医药
U45966--T--C--C-----CTAC--G--------------T--T--C--------T---------
U87255--T--C--C-----C-GT--G-----T--------T-----T--T-----T--C--T---
图1 HGV山东株部分cDNA序列(400bp)与已发表HGV株序列比较(U75356，U94695中国株)；(U44402,U45966,U36380美国株)；(d87225日本株).
目前，仅对少数病例进行部分核酸序列测定，我们测定的首例山东株是否与国内外已发表的多株序列属同一个基因亚型还需进一步研究.
4 参考文献
, http://www.100md.com
1 Simons JN，Leary TP, Dawson GJ，Pilot-Matias TJ，Muerhoff AS，Schlauder GG，Desai SM，Mushahwar IK. Isolation of novel
virus-like sequences associated with human hepatitis. Nature Med, 1995;1:564-569
2 Leary TP, Muerhoff AS, Simons JN, Pilot-Matias TJ, Erker JC, Chalmers ML，Schlauder GG，Dawson GJ，Desai SM, Mushahwar
IK. Sequence and genomic organization of GBV-C:a novel member of the Flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis.
, http://www.100md.com
J Med, Virol, 1996;48:60-67
3 Linnen J, Wages J, Zhang-adziyannis S, Karayiannis P, Fung K, Nakatsuji Y, Shih JWK, Young L, Piatak M, Hoover C, Fernandez J,Chens Zou JC, Morris T, Hyams KC, Lsmay S, Lifson JD, Hess G, Foung SKH, Thomas H, Bradley D, Margolis H, Kim JP.
Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a transfusion-transmissible agent. Science, 1996;271:505-508
4 周育森，王海涛，唐时幸，王竞，陈薇，赵秋敏，张习坦. 中国人庚型肝炎病毒(HGV)部分基因克隆和cDNA序列测定.
军事医学科学院院刊，1996；20：160, http://www.100md.com(于建国 商庆华 韩纪举 周秀梅 张玉琦)