端粒酶诊断癌性腹水的临床价值
山东省立医院消化内科 山东省济南市 250021
项目负责人 刘吉勇山东省立医院消化内科 山东省济南市 250021
Tel. +86·531·7938911 Ext. 2355, Fax. +86·531·7927117
Email. www.sd/medline.com.cn
收稿日期 1999-05-19
Subject headings ascites/diagnosis; telomerase; diagnosis, differential
, http://www.100md.com
主题词 腹水/诊断；端粒酶；诊断，鉴别
晚近研究表明，端粒酶通过维持端粒长度可使永生化细胞获得无限增殖的能力. 我们采用端粒重复序列扩增法(telomere repeat amplification protocol, TRAP)[1]对腹水标本进行端粒酶活性检测，旨在探讨其在癌性腹水中的表达情况及对良恶性腹水的鉴别诊断价值.
1 材料和方法
1.1 材料 癌性腹水标本31例，均取自我院消化内科住院的恶性肿瘤患者，其中原发性肝癌12例，胃癌8例，胰腺癌5例，恶性腹膜间皮瘤3例，卵巢癌3例. 以肝硬变腹水20例作对照组. 以上病例据腹水细胞学检查、病理活检、B超及CT等确诊. 对每例患者在无菌下行腹腔穿剌，抽取腹水液20mL，立即离心收集细胞，于-80℃冻存，以备作端粒酶检测.
, 百拇医药
1.2 方法 取腹水细胞加冷PBS悬浮2次～3次，血性腹水用曲拉通约0.5g/L浓度，以破坏红细胞，重复离心后弃上清，立即加裂解液20μL，冰浴30min后于4℃. 15000r/min离心10min，取上清-20℃保存. 采用TRAP法检测端粒酶活性，端粒酶试剂盒购自山东医科大学遗传教研室，并严格按照试剂盒说明操作，简述如下：向装有反应液(25μL)的Ep管中加入1μL待测上清，于30℃保温30min以完成端粒酶介导的端粒延伸过程，然后向以匣旌弦褐屑右铼μL，Taq酶1μL，石蜡油20μL，混匀后置PCR循环仪进行扩增反应，循环参数为94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s，并设阳性及阴性对照，于PCR反应产物中加入3μL上样缓冲液，在120g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染，以出现间隔6bp的梯形条带为端粒酶阳性.
统计学处理 用χ2检验进行统计学分析.
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2 结果
2.1 端粒酶在癌性腹水中的表达 端粒酶在癌性腹水中表达的阳性率为93.5%，明显高于肝硬变腹水组(5%)，差异有非常显著性(P<0.01；表1，图1). 本实验端粒酶活性测定对癌性腹水的诊断特异性和准确性分别为95.2%和96.7%，提示端粒酶在癌性腹水中大部分处于活化状态.
2.2 端粒酶与组织类型及细胞学检查的关系 不同原发病引起的癌性腹水中端粒酶与细胞学的检测结果表明，端粒酶在癌性腹水中的表达阳性率93.5%，而细胞学检测到癌细胞的阳性率为45.2%，两者差异有非常显著性(P<0.01，表2)，不同癌肿引起的腹水端粒酶阳性率差别无明显性.
表1 端粒酶在癌性腹水中的表达
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灵敏度=a a+c=93.5%，特异度=d / d+b=95.2%，准确度=a / a+b=96.7%.
表2 端粒酶与肿瘤类型及细胞学检查的关系
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图1 端粒酶在癌性腹水中的表达.
注：1，2分别为阴性及阳性对照，3，4，5，6为肝癌腹水，7，8，9为胃癌腹水，10，11为卵巢癌腹水.
3 讨论
腹水是一常见临床症状，目前对于良恶性腹水的鉴别除了临床常用的细胞学检查，CEA，LDH等项指标外，新开展的检测方法也不少，如血清腹水清蛋白梯度(SAAG),CA-50，SA，CA125，hCG-β等，终因上述指标不能单独对腹水的鉴别作出理想的判断.
端粒酶是一种核糖核蛋白，主要成分是RNA和蛋白质，具有逆转录酶活性，能以自身RNA组分为模板，从头合成端粒并加到染色体末端，以补偿细胞分裂时染色体端粒的缩短，从而使细胞获得无限增殖的能力. 因此，端粒酶的活化和端粒长度的维持对细胞永生化及恶变是至关重要的[2]. 由于端粒酶是通过维持端粒长度使细胞变成癌细胞，所以比其他肿瘤标志物更直接，特异性更强，因TRAP法是以PCR为基础而建立起来的，故敏感性高. 本法只要反应体系中有5个以上肿瘤细胞，即可检测到端粒酶活性. 本组31例癌性腹水端粒酶阳性率93.5%，特异性和准确性分别为95.2%和96.7%，提示癌性腹水中端粒酶的检测敏感性高，特异性强，是鉴别良恶性腹水的理想标志物. 一般认为细胞学检查癌细胞的检出率40%～60%[3]，而且须反复送检才能得到可靠的结果. 本组腹水细胞学检查的阳性率为45.2%，因此将端粒酶与腹水细胞学检查联合应用，敏感性将更加提高，因细胞内除端粒酶外，还存在其他调节端粒长度的因素，如端粒结合蛋白，端粒结构等，而端粒酶本身的激活也受一些因子的调控，因此并不是所有的肿瘤细胞中都能检测到端粒酶活性. 至于肝硬变腹水中有1例测到端粒酶活性，可能与脱落入腹水中的非肿瘤性的间皮细胞或其他炎性细胞等有关[4].
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4 参考文献
1 Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PLC, Coviello GM, Wright WE, Weinrich SL, Shay JW. Specific
association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994;266:2011-2014
2 de Lange T. Activation of telomerase in a human tumor. Proc Natl Acad Sci USA, 1994;91:2882-2885
3 苌新明，李红霞. 腹水鉴别诊断进展. 医学综述，1996；2：187-189
4 Gorham H, Yoshida K, Sugino T, Marsh G, Manek S, Charnock M, Tarin D, Goodison S. Telomerase activity in human
gynaecological malignancies. J Clin Pathol, 1997;50:501-504, 百拇医药(刘吉勇 亓玉琴)
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主题词 腹水/诊断；端粒酶；诊断，鉴别
晚近研究表明，端粒酶通过维持端粒长度可使永生化细胞获得无限增殖的能力. 我们采用端粒重复序列扩增法(telomere repeat amplification protocol, TRAP)[1]对腹水标本进行端粒酶活性检测，旨在探讨其在癌性腹水中的表达情况及对良恶性腹水的鉴别诊断价值.
1 材料和方法
1.1 材料 癌性腹水标本31例，均取自我院消化内科住院的恶性肿瘤患者，其中原发性肝癌12例，胃癌8例，胰腺癌5例，恶性腹膜间皮瘤3例，卵巢癌3例. 以肝硬变腹水20例作对照组. 以上病例据腹水细胞学检查、病理活检、B超及CT等确诊. 对每例患者在无菌下行腹腔穿剌，抽取腹水液20mL，立即离心收集细胞，于-80℃冻存，以备作端粒酶检测.
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1.2 方法 取腹水细胞加冷PBS悬浮2次～3次，血性腹水用曲拉通约0.5g/L浓度，以破坏红细胞，重复离心后弃上清，立即加裂解液20μL，冰浴30min后于4℃. 15000r/min离心10min，取上清-20℃保存. 采用TRAP法检测端粒酶活性，端粒酶试剂盒购自山东医科大学遗传教研室，并严格按照试剂盒说明操作，简述如下：向装有反应液(25μL)的Ep管中加入1μL待测上清，于30℃保温30min以完成端粒酶介导的端粒延伸过程，然后向以匣旌弦褐屑右铼μL，Taq酶1μL，石蜡油20μL，混匀后置PCR循环仪进行扩增反应，循环参数为94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s，并设阳性及阴性对照，于PCR反应产物中加入3μL上样缓冲液，在120g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染，以出现间隔6bp的梯形条带为端粒酶阳性.
统计学处理 用χ2检验进行统计学分析.
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2 结果
2.1 端粒酶在癌性腹水中的表达 端粒酶在癌性腹水中表达的阳性率为93.5%，明显高于肝硬变腹水组(5%)，差异有非常显著性(P<0.01；表1，图1). 本实验端粒酶活性测定对癌性腹水的诊断特异性和准确性分别为95.2%和96.7%，提示端粒酶在癌性腹水中大部分处于活化状态.
2.2 端粒酶与组织类型及细胞学检查的关系 不同原发病引起的癌性腹水中端粒酶与细胞学的检测结果表明，端粒酶在癌性腹水中的表达阳性率93.5%，而细胞学检测到癌细胞的阳性率为45.2%，两者差异有非常显著性(P<0.01，表2)，不同癌肿引起的腹水端粒酶阳性率差别无明显性.
表1 端粒酶在癌性腹水中的表达
| 结果 | 癌性腹水(n) | 肝硬变腹水(n) | 样本数(n) |
| 阳性 | 29(a) | 1(b) | 30(a+b) |
| 阴性 | 2(c) | 20(d) | 22(c+d) |
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灵敏度=a a+c=93.5%，特异度=d / d+b=95.2%，准确度=a / a+b=96.7%.
表2 端粒酶与肿瘤类型及细胞学检查的关系
| 组别 | n | 细胞学检查阳性 | 端粒酶阳性 | ||
| n | (%) | n | (%) | ||
| 癌性腹水 | 31 | 14 | (45.0) | 29 | (93.5) |
| 肝癌 | 12 | 6 | (50.0) | 10 | (90.9) |
| 胃癌 | 8 | 3 | (37.5) | 8 | (100.0) |
| 胰腺癌 | 5 | 2 | (40.0) | 4 | (80.0) |
| 恶性腹膜间皮瘤 | 3 | 2 | (66.7) | 2 | (100.0) |
| 卵巢癌 | 3 | 1 | (33.3) | 3 | (100.0) |
| 肝硬变腹水 | 20 | 0 | (0 ) | 1 | ( 5.0) |
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图1 端粒酶在癌性腹水中的表达.
注：1，2分别为阴性及阳性对照，3，4，5，6为肝癌腹水，7，8，9为胃癌腹水，10，11为卵巢癌腹水.
3 讨论
腹水是一常见临床症状，目前对于良恶性腹水的鉴别除了临床常用的细胞学检查，CEA，LDH等项指标外，新开展的检测方法也不少，如血清腹水清蛋白梯度(SAAG),CA-50，SA，CA125，hCG-β等，终因上述指标不能单独对腹水的鉴别作出理想的判断.
端粒酶是一种核糖核蛋白，主要成分是RNA和蛋白质，具有逆转录酶活性，能以自身RNA组分为模板，从头合成端粒并加到染色体末端，以补偿细胞分裂时染色体端粒的缩短，从而使细胞获得无限增殖的能力. 因此，端粒酶的活化和端粒长度的维持对细胞永生化及恶变是至关重要的[2]. 由于端粒酶是通过维持端粒长度使细胞变成癌细胞，所以比其他肿瘤标志物更直接，特异性更强，因TRAP法是以PCR为基础而建立起来的，故敏感性高. 本法只要反应体系中有5个以上肿瘤细胞，即可检测到端粒酶活性. 本组31例癌性腹水端粒酶阳性率93.5%，特异性和准确性分别为95.2%和96.7%，提示癌性腹水中端粒酶的检测敏感性高，特异性强，是鉴别良恶性腹水的理想标志物. 一般认为细胞学检查癌细胞的检出率40%～60%[3]，而且须反复送检才能得到可靠的结果. 本组腹水细胞学检查的阳性率为45.2%，因此将端粒酶与腹水细胞学检查联合应用，敏感性将更加提高，因细胞内除端粒酶外，还存在其他调节端粒长度的因素，如端粒结合蛋白，端粒结构等，而端粒酶本身的激活也受一些因子的调控，因此并不是所有的肿瘤细胞中都能检测到端粒酶活性. 至于肝硬变腹水中有1例测到端粒酶活性，可能与脱落入腹水中的非肿瘤性的间皮细胞或其他炎性细胞等有关[4].
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PLC, Coviello GM, Wright WE, Weinrich SL, Shay JW. Specific
association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994;266:2011-2014
2 de Lange T. Activation of telomerase in a human tumor. Proc Natl Acad Sci USA, 1994;91:2882-2885
3 苌新明，李红霞. 腹水鉴别诊断进展. 医学综述，1996；2：187-189
4 Gorham H, Yoshida K, Sugino T, Marsh G, Manek S, Charnock M, Tarin D, Goodison S. Telomerase activity in human
gynaecological malignancies. J Clin Pathol, 1997;50:501-504, 百拇医药(刘吉勇 亓玉琴)