人胃粘膜细胞的分离与羟自由基损伤模型的建立
中国人民解放军总医院南楼消化科 北京市 100853
项目负责人 王刚石中国人民解放军总医院南楼消化科 北京市 100853
收稿日期 1999-06-03
Subject headings gastric mucosa; model, biological; free radicals; lipid peroxidation
主题词 胃粘膜；模型，生物性；自由基类；脂质过氧化
胃肠道长期处于内源性和外源性损伤因素的刺激下，由于不同机体的胃粘膜抗损伤能力的差异，相同的损伤因素在不同个体产生的效应截然不同，动物实验已在整体和细胞水平对胃粘膜的损伤-抗损伤进行探讨. 本研究旨在摸索分离人正常胃粘膜细胞的方法，并在此基础上建立羟自由基(Hydroxyl radicals, OH·)损伤人胃粘膜细胞模型，为进一步从细胞水平研究人胃粘膜抗损伤的机制打下基础.
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1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器 TEP，pronase E, BSA, HEPES等均为美国Sigma公司产品；Fe2SO4北京化学试剂厂；30% H2O2，天津市东方化工厂. 日本产MPF-4型荧光分光光度计，日本ESPC，BNA-311型二氧化碳培养箱，国产TSHZ-A型台式水浴恒温振荡器.
孵育液A：NaH2PO4 0.5mM, Na2HPO4 1mM， NaHCO3 20mM, NaCl 80mM, KCl 5mM, HEPES 50mM, Glucose 11mM, EDTA 2mM, BSA 0.2%.
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孵育液B：基本与A液相同，但无EDTA，含CaCl2 1mM, MgCl2 1.5mM, BSA 1%孵育液C：基本与B液相同，仅BSA浓度为0.1%.
1.2 试验方法
1.2.1 人胃粘膜细胞的分离和孵育[1] 通过内镜活检钳夹取4块正常胃粘膜组织，重约15mg，置入含0.02% EDTA D-Hank＇s BSS中37℃孵育15min～30min，剧烈振荡. 放入Pronase E液1.5mL中(1.5mg/mL)，37℃恒温振荡30min，500g离心，沉淀以含0.2% BSA Hank＇s BSS洗涤两次. 加入0.2% BSA Hank＇s BSS Pronase E(1.5mg/mL)3mL，37℃温和磁力搅拌30min，取出未消化组织块，消化液800g离心5min，沉淀以0.2% BSA Hank＇s悬浮[2]. 参照Lewin et al[1]分离大鼠胃粘膜细胞方法并加以改进. 标本来源：选择因胃癌或胃溃疡而胃大部或全部切除患者，取其手术切除下新鲜标本之正常全层胃体或胃底组织约4cm×5cm大小，病理证实所用组织之边缘无癌细胞浸润.
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操作过程：标本迅速以冷D-Hank＇s液冲洗干净，剥除浆膜层，荷包缝合，制成粘膜面外翻的胃囊. 向囊腔内注入含Pronase E的消化液2.0mL (2000U/mL，溶于孵育液A)，将胃囊置于通入O2的孵育液A中，37℃水浴恒温振荡90min，45min更换一次A液. 消化后的胃囊移入通有O2的B液中，37℃下用磁力搅拌器温和搅拌30min，每15min收集一次B液. 将收集的B液100g离心5min使细胞沉淀，并用PBS洗涤3次. 将细胞悬浮于C液，调细胞数2.0×105个/mL，接种于24孔培养板中，置CO2培养箱孵育. 上述操作均在无菌条件下进行.
取细胞混悬液涂片，无水乙醇固定，HE染色分类计数细胞. 每份标本计数3个视野，每视野计数100个细胞.上述标本采集均征得患者同意.
1.2.2 细胞损伤模型的制备及损伤指标 根据Fe2+与H2O2反应生成OH·(Fenton型Haber-Weiss反应)，将分离的细胞按1×105个/孔接种于24孔培养板中，加入不同浓度Fe2+及H2O2各20μL(先加Fe2+，后加H2O2)，对照组加入PBS 40μL，总反应体系0.5mL，反应时间3h，以细胞存活率(胎盼兰排除试验)和乳酸脱氢酶(LDH)漏出量为指标，观察细胞受损情况.
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1.2.3 细胞丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量的测定 取5×105细胞，冷PBS洗涤二次，荧光法测定细胞的MDA含量，激发光波长515nm，发射光波长553nm.
统计学处理 实验数据均以均数±标准差(x±s)表示，均数差异的显著性判定采用双侧t检验法.
2 试验结果
2.1 人正常胃粘膜细胞的分离 将两种不同来源的标本分别采用不同的方法进行细胞分离，结果见表1.
表1 两种胃粘膜细胞分离方法的比较
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bP<0.01, vs Pronase E 2000U/次组.
取方法二中Pronase E 4000U组细胞进一步进行试验.将细胞涂片经HE染色，对各类细胞计数，结果示壁细胞占19.01%±2.82%，主细胞占32.77%±5.68%，粘液上皮细胞占37.17%±4.54% (n=5，x±s).
2.2 活性氧对离体孵育的人胃粘膜细胞的损伤作用 加入不同浓度的OH· 3h后，随OH·浓度的增加各组LDH漏出量增多，细胞存活率降低，表2.
表2 羟自由基对人胃粘膜细胞的损伤作用
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aP<0.05，bP<0.01，vs 对照组.
16mmol/L损伤浓度组预先加入5mmol/L二甲基亚砜(DMSO)，3h后上清液的LDH为0.706±0.219 u/106 cell，与损伤对照组比较，差异显著(P<0.001). 同时设定16mmol/L浓度的H2O2损伤组，发现H2O2对细胞的损伤程度约为OH·的40%，图1.
将各次试验中所同时测定的细胞存活率和LDH漏出量的实验数据作相关性检验，两者存在着明显的负相关(Y=2.0379-0.0152X，r=-0.8867，P<0.05)，表明LDH漏出量可反映细胞受损情况.细胞的脂质过氧化程度随OH·浓度的增加而加重，以脂质过氧化代谢产物MDA为指标，图2.
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图1 OH·和H2O2对细胞损伤程度的比较.
图2 羟自由基对人胃粘膜细胞丙二醛含量的影响.
3 讨论
在多种病理状态下，如缺血-再灌注过程、药物性胃肠炎[2]、炎症性肠病等，反应性氧代谢物对胃肠粘膜上皮细胞造成的损伤是导致胃粘膜屏障减弱的原因之一. 动物试验已在整体和细胞水平证实了氧自由基(O*)、超氧化物阴离子自由基(O2-)、H2O2等活性氧对胃肠粘膜的直接损伤作用，活性氧对培养的人胃肠粘膜细胞的损伤作用及其机制的研究亦见报道[3，4]，在细胞水平研究自由基损伤和机体抗损伤的机制，是预防机体损伤的有效途径.
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由于动物和人之间种属的差异，以及传代培养细胞在转化等处理过程中发生了性能丢失等因素的影响，上述模型在解释人类病变的病理生理机制时受到一定的限制. 原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，在用于药物检测、受体和受体后信号转导的研究等方面是一个很好的实验对象. 然而，至今为止尚未有理想的人胃粘膜细胞原代培养模型.
与消化系统其他组织如肝、胰腺不同，胃粘膜组织结构紧密，不易分离. 通常的细胞分离方法如机械法、蛋白水解酶(胶原酶)等效果均不理想. Pronase是从灰色链菌酶中提取的多种酶混合物，含有羧肽酶、酰胺酶、酯酶等，在螯合物(如EDTA)的存在下，酯酶的活性将大大增加. 动物试验已证明Pronase为最合适的分离胃粘膜细胞的消化酶，本实验以Pronase E为主要的消化酶，辅以EDTA，尝试分离人正常胃粘膜细胞. 通过内镜活检取标本量少，所获得细胞数低，通常不能满足试验的需要，而手术标本没有该限制. 将标本制作成一个粘膜面向外的胃囊，Pronase E注入其中，不仅保证了酶的作用浓度，并且分离下来的细胞能保证为胃粘膜细胞，避免了纤维细胞的干扰. 由于人胃壁较厚，剥离浆膜层可增强Pronase E的作用效果. 用该方法分离的细胞在孵育条件下存活率高，为进行原代培养提供了基础. 本研究发现每4cm×5cm大小胃粘膜以Pronase E 4000U进行消化，可分离细胞数为2.4×106个，细胞存活率高，散在分布，无细胞团，建议该浓度为推荐使用的浓度.
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OH·是化学性质最为活泼的活性氧，既往无实验性OH·损伤胃粘膜细胞的报道，本研究不仅观察到Fe2+-H2O2体系可直接损伤细胞，且其作用较H2O2明显增强，预先加入OH·特异性清除剂DMSO可预防细胞死亡和LDH漏出，说明损伤确由OH·引起. 活性氧可使糖类、蛋白质、核酸、脂质等生物大分子发生氧化反应，其中以对质膜上多不饱和脂肪酸的损伤最受重视[5]，本试验观察到，Fe2+-H2O2体系损伤细胞时，脂质过氧化的最终产物丙二醛的含量明显增高，且随OH·浓度的上升而加重，表明活性氧损伤离体人胃粘膜细胞的重要机制之一是质膜的脂质过氧化. 随着OH·浓度的增加，细胞损伤程度逐渐加重，反映细胞损伤程度的LDH漏出量和细胞存活率之间存在明显的负相关关系，故LDH漏出量可较准确地反映细胞受损情况. 此为一方便可行的模型，用于在细胞水平探讨自由基损伤人胃粘膜细胞及细胞抗损伤的机制.
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4 参考文献
1 Lewin MJM, Cheret AM, Sachs G. Seperation of individual cells from the fundic gastric mucosa. In: Pretlow TG, Pretlow TP, eds.
Cell Seperation METHODS and Selected Applications (Volume 1). New York: Academic Press, 1982:224
2 Vaananen PM, Meddings JB, Wallace JL. Role of oxygen-derived free radicals in indomethecin-induced gastric injury.
, 百拇医药
Am J Physiol, 1991;261:G470-475
3 Yasuo H, Takao K, Hideyuki H, Shinichi O, Akira T, Kevin JI. Hydrogenperoxide-mediated cytotoxicity to cultured colonic epithelial
cells. Life Sci, 1997;60:2221-2230
4 Teshima S, Rokutan K, Nikawa T, Kishi K. Guinea pig gastric mucosal cells produce abundant superoxide anion through an
NADPH oxidase-like system. Gastroenterology, 1998;115:1186-1196
5 Nicotera P, Kass GEN, Duddy SK. Calcium and signal transduction in oxidative cell damage. In: Duncan CJ, eds. Calcium, oxygen
radicals and cellular damage. New York: Cambridge University Press, 1991:22, 百拇医药(王刚石 王孟薇 吴本俨)
项目负责人 王刚石中国人民解放军总医院南楼消化科 北京市 100853
收稿日期 1999-06-03
Subject headings gastric mucosa; model, biological; free radicals; lipid peroxidation
主题词 胃粘膜；模型，生物性；自由基类；脂质过氧化
胃肠道长期处于内源性和外源性损伤因素的刺激下，由于不同机体的胃粘膜抗损伤能力的差异，相同的损伤因素在不同个体产生的效应截然不同，动物实验已在整体和细胞水平对胃粘膜的损伤-抗损伤进行探讨. 本研究旨在摸索分离人正常胃粘膜细胞的方法，并在此基础上建立羟自由基(Hydroxyl radicals, OH·)损伤人胃粘膜细胞模型，为进一步从细胞水平研究人胃粘膜抗损伤的机制打下基础.
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1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器 TEP，pronase E, BSA, HEPES等均为美国Sigma公司产品；Fe2SO4北京化学试剂厂；30% H2O2，天津市东方化工厂. 日本产MPF-4型荧光分光光度计，日本ESPC，BNA-311型二氧化碳培养箱，国产TSHZ-A型台式水浴恒温振荡器.
孵育液A：NaH2PO4 0.5mM, Na2HPO4 1mM， NaHCO3 20mM, NaCl 80mM, KCl 5mM, HEPES 50mM, Glucose 11mM, EDTA 2mM, BSA 0.2%.
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孵育液B：基本与A液相同，但无EDTA，含CaCl2 1mM, MgCl2 1.5mM, BSA 1%孵育液C：基本与B液相同，仅BSA浓度为0.1%.
1.2 试验方法
1.2.1 人胃粘膜细胞的分离和孵育[1] 通过内镜活检钳夹取4块正常胃粘膜组织，重约15mg，置入含0.02% EDTA D-Hank＇s BSS中37℃孵育15min～30min，剧烈振荡. 放入Pronase E液1.5mL中(1.5mg/mL)，37℃恒温振荡30min，500g离心，沉淀以含0.2% BSA Hank＇s BSS洗涤两次. 加入0.2% BSA Hank＇s BSS Pronase E(1.5mg/mL)3mL，37℃温和磁力搅拌30min，取出未消化组织块，消化液800g离心5min，沉淀以0.2% BSA Hank＇s悬浮[2]. 参照Lewin et al[1]分离大鼠胃粘膜细胞方法并加以改进. 标本来源：选择因胃癌或胃溃疡而胃大部或全部切除患者，取其手术切除下新鲜标本之正常全层胃体或胃底组织约4cm×5cm大小，病理证实所用组织之边缘无癌细胞浸润.
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操作过程：标本迅速以冷D-Hank＇s液冲洗干净，剥除浆膜层，荷包缝合，制成粘膜面外翻的胃囊. 向囊腔内注入含Pronase E的消化液2.0mL (2000U/mL，溶于孵育液A)，将胃囊置于通入O2的孵育液A中，37℃水浴恒温振荡90min，45min更换一次A液. 消化后的胃囊移入通有O2的B液中，37℃下用磁力搅拌器温和搅拌30min，每15min收集一次B液. 将收集的B液100g离心5min使细胞沉淀，并用PBS洗涤3次. 将细胞悬浮于C液，调细胞数2.0×105个/mL，接种于24孔培养板中，置CO2培养箱孵育. 上述操作均在无菌条件下进行.
取细胞混悬液涂片，无水乙醇固定，HE染色分类计数细胞. 每份标本计数3个视野，每视野计数100个细胞.上述标本采集均征得患者同意.
1.2.2 细胞损伤模型的制备及损伤指标 根据Fe2+与H2O2反应生成OH·(Fenton型Haber-Weiss反应)，将分离的细胞按1×105个/孔接种于24孔培养板中，加入不同浓度Fe2+及H2O2各20μL(先加Fe2+，后加H2O2)，对照组加入PBS 40μL，总反应体系0.5mL，反应时间3h，以细胞存活率(胎盼兰排除试验)和乳酸脱氢酶(LDH)漏出量为指标，观察细胞受损情况.
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1.2.3 细胞丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量的测定 取5×105细胞，冷PBS洗涤二次，荧光法测定细胞的MDA含量，激发光波长515nm，发射光波长553nm.
统计学处理 实验数据均以均数±标准差(x±s)表示，均数差异的显著性判定采用双侧t检验法.
2 试验结果
2.1 人正常胃粘膜细胞的分离 将两种不同来源的标本分别采用不同的方法进行细胞分离，结果见表1.
表1 两种胃粘膜细胞分离方法的比较
| 方法 | 标本来源 | n | Pronase E(U/次) | 细胞数(106)(x±s) | 细胞团(%)(x±s) | 细胞存活率(%)(x±s) |
| 一 | 内镜 | 4 | 500 | 0.008±0.034 | 0 | 77.25±3.59 |
| 活检 | ||||||
| 二 | 手术 | 3 | 2000 | 0.72±0.08 | 10.33±2.08 | 96.87±2.56 |
| 标本 | 5 | 4000 | 2.43±0.18b | 0 | 92.28±3.05 | |
| 3 | 7000 | 2.42±0.03 | 0 | 89.50±0.76 |
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bP<0.01, vs Pronase E 2000U/次组.
取方法二中Pronase E 4000U组细胞进一步进行试验.将细胞涂片经HE染色，对各类细胞计数，结果示壁细胞占19.01%±2.82%，主细胞占32.77%±5.68%，粘液上皮细胞占37.17%±4.54% (n=5，x±s).
2.2 活性氧对离体孵育的人胃粘膜细胞的损伤作用 加入不同浓度的OH· 3h后，随OH·浓度的增加各组LDH漏出量增多，细胞存活率降低，表2.
表2 羟自由基对人胃粘膜细胞的损伤作用
| 组别 | LDH(u/106 cell) | viability (%) |
| 对照组 | 0.621±0.134 | 92.28±3.05 |
| OH·(2mmol/L) | 0.698±0.154 | 85.03±2.15 |
| OH·(8mmol/L) | 0.736±0.148a | 78.48±4.07b |
| OH·(12mmol/L) | 0.883±0.268a | 68.87±3.20b |
| OH·(16mmol/L) | 1.453±0.126b | 58.25±5.21b |
| OH·(20mmol/L) | 1.671±0.495b | 20.21±3.64b |
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aP<0.05，bP<0.01，vs 对照组.
16mmol/L损伤浓度组预先加入5mmol/L二甲基亚砜(DMSO)，3h后上清液的LDH为0.706±0.219 u/106 cell，与损伤对照组比较，差异显著(P<0.001). 同时设定16mmol/L浓度的H2O2损伤组，发现H2O2对细胞的损伤程度约为OH·的40%，图1.
将各次试验中所同时测定的细胞存活率和LDH漏出量的实验数据作相关性检验，两者存在着明显的负相关(Y=2.0379-0.0152X，r=-0.8867，P<0.05)，表明LDH漏出量可反映细胞受损情况.细胞的脂质过氧化程度随OH·浓度的增加而加重，以脂质过氧化代谢产物MDA为指标，图2.
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图1 OH·和H2O2对细胞损伤程度的比较.
图2 羟自由基对人胃粘膜细胞丙二醛含量的影响.
3 讨论
在多种病理状态下，如缺血-再灌注过程、药物性胃肠炎[2]、炎症性肠病等，反应性氧代谢物对胃肠粘膜上皮细胞造成的损伤是导致胃粘膜屏障减弱的原因之一. 动物试验已在整体和细胞水平证实了氧自由基(O*)、超氧化物阴离子自由基(O2-)、H2O2等活性氧对胃肠粘膜的直接损伤作用，活性氧对培养的人胃肠粘膜细胞的损伤作用及其机制的研究亦见报道[3，4]，在细胞水平研究自由基损伤和机体抗损伤的机制，是预防机体损伤的有效途径.
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由于动物和人之间种属的差异，以及传代培养细胞在转化等处理过程中发生了性能丢失等因素的影响，上述模型在解释人类病变的病理生理机制时受到一定的限制. 原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，在用于药物检测、受体和受体后信号转导的研究等方面是一个很好的实验对象. 然而，至今为止尚未有理想的人胃粘膜细胞原代培养模型.
与消化系统其他组织如肝、胰腺不同，胃粘膜组织结构紧密，不易分离. 通常的细胞分离方法如机械法、蛋白水解酶(胶原酶)等效果均不理想. Pronase是从灰色链菌酶中提取的多种酶混合物，含有羧肽酶、酰胺酶、酯酶等，在螯合物(如EDTA)的存在下，酯酶的活性将大大增加. 动物试验已证明Pronase为最合适的分离胃粘膜细胞的消化酶，本实验以Pronase E为主要的消化酶，辅以EDTA，尝试分离人正常胃粘膜细胞. 通过内镜活检取标本量少，所获得细胞数低，通常不能满足试验的需要，而手术标本没有该限制. 将标本制作成一个粘膜面向外的胃囊，Pronase E注入其中，不仅保证了酶的作用浓度，并且分离下来的细胞能保证为胃粘膜细胞，避免了纤维细胞的干扰. 由于人胃壁较厚，剥离浆膜层可增强Pronase E的作用效果. 用该方法分离的细胞在孵育条件下存活率高，为进行原代培养提供了基础. 本研究发现每4cm×5cm大小胃粘膜以Pronase E 4000U进行消化，可分离细胞数为2.4×106个，细胞存活率高，散在分布，无细胞团，建议该浓度为推荐使用的浓度.
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OH·是化学性质最为活泼的活性氧，既往无实验性OH·损伤胃粘膜细胞的报道，本研究不仅观察到Fe2+-H2O2体系可直接损伤细胞，且其作用较H2O2明显增强，预先加入OH·特异性清除剂DMSO可预防细胞死亡和LDH漏出，说明损伤确由OH·引起. 活性氧可使糖类、蛋白质、核酸、脂质等生物大分子发生氧化反应，其中以对质膜上多不饱和脂肪酸的损伤最受重视[5]，本试验观察到，Fe2+-H2O2体系损伤细胞时，脂质过氧化的最终产物丙二醛的含量明显增高，且随OH·浓度的上升而加重，表明活性氧损伤离体人胃粘膜细胞的重要机制之一是质膜的脂质过氧化. 随着OH·浓度的增加，细胞损伤程度逐渐加重，反映细胞损伤程度的LDH漏出量和细胞存活率之间存在明显的负相关关系，故LDH漏出量可较准确地反映细胞受损情况. 此为一方便可行的模型，用于在细胞水平探讨自由基损伤人胃粘膜细胞及细胞抗损伤的机制.
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4 参考文献
1 Lewin MJM, Cheret AM, Sachs G. Seperation of individual cells from the fundic gastric mucosa. In: Pretlow TG, Pretlow TP, eds.
Cell Seperation METHODS and Selected Applications (Volume 1). New York: Academic Press, 1982:224
2 Vaananen PM, Meddings JB, Wallace JL. Role of oxygen-derived free radicals in indomethecin-induced gastric injury.
, 百拇医药
Am J Physiol, 1991;261:G470-475
3 Yasuo H, Takao K, Hideyuki H, Shinichi O, Akira T, Kevin JI. Hydrogenperoxide-mediated cytotoxicity to cultured colonic epithelial
cells. Life Sci, 1997;60:2221-2230
4 Teshima S, Rokutan K, Nikawa T, Kishi K. Guinea pig gastric mucosal cells produce abundant superoxide anion through an
NADPH oxidase-like system. Gastroenterology, 1998;115:1186-1196
5 Nicotera P, Kass GEN, Duddy SK. Calcium and signal transduction in oxidative cell damage. In: Duncan CJ, eds. Calcium, oxygen
radicals and cellular damage. New York: Cambridge University Press, 1991:22, 百拇医药(王刚石 王孟薇 吴本俨)