根除Hp对增殖细胞核抗原P53蛋白表达的影响
中国医科大学肿瘤研究所 辽宁省沈阳市 110001
项目负责人 高华中国医科大学肿瘤研究所 辽宁省沈阳市 110001
收稿日期 1999-07-01
Subject headings stomach neoplasms; Helicobacter infections; proliferating cell nuclear antigen; P53 protein
主题词 胃肿瘤；螺杆菌感染；增殖细胞核抗原；P53蛋白
目前认为，幽门螺杆菌(Hp)并非胃癌直接致癌物，而是通过对胃粘膜的损伤，促进病变发展的条件因素使胃癌危险性增高[1]. 我们通过对Hp感染的胃疾病进行根除治疗，采用PCR技术及免疫组化技术观测治疗前后对胃粘膜上皮增殖细胞核抗原(PCNA)及P53蛋白表达的影响. 探讨Hp可能的致癌机制.
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1 材料和方法
1.1 材料 胃粘膜活检标本207例，取自辽宁省庄河市胃癌高发现场，每例取新鲜胃粘膜4块(胃窦及病灶部)，其中1块行Hp-PCR检测，另外3块胃粘膜用中性福尔马林固定，石蜡包埋，制成5μm切片，行HE及免疫组织化学染色. 经Hp染色正常胃粘膜24例；浅表性胃炎58例；萎缩性胃炎Hp阳性18例；Hp阴性34例，不典型增生Hp阳性12例，Hp阴性29例；胃癌Hp阳性4例，Hp阴性28例.
1.2 方法 Hp基因PCR检测采用上海复华公司生产的Hp基因检测试剂盒，按照说明常规操作. Hp组织化学检测用HE染色及亚甲蓝(MB)染色，上述两种方法为阳性者视为Hp阳性，否则为阴性. Hp阳性胃疾病患者按三联疗法常规治疗(铋制剂+氨苄青霉素+甲硝唑)治疗3mo后在原部位取材复查. 治疗前后标本均进行PCNA，P53蛋白免疫组化染色，全部采用SP法，染色步骤按说明书进行，PBS代替一抗作阴性对照. 光镜下观察PCNA免疫组化染色切片的显色反映，数5个以上高倍视野不少于1000个细胞，计算阳性细胞数(细胞核呈清晰棕黄色)计算PCNA指数(增殖细胞指数). 光镜下P53蛋白阳性细胞胞核染色为棕色颗粒.
, 百拇医药
统计学处理 PCNA指数两样本均数的比较采用t检验. P53蛋白免疫组化检测结果采用χ2检验.
2 结果
本研究检测207例Hp相关性胃疾病不同胃粘膜PCNA指数及P53蛋白的表达情况结果见表1，2.
表1 Hp阳性胃粘膜PCNA指数及P53蛋白的表达
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bP<0.01，vs Hp-组.
表2 Hp根除后PCNA指数及P53蛋白的表达
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aP<0.05，vs 治疗前；bP<0.01，vs Hp阳性组.
3 讨论
大量研究表明，Hp是胃癌的危险因素[2]，与胃癌前病变及胃癌有密切关系[3]. 但Hp的致癌机制至今尚未阐明. PCNA是近年来公认的反映细胞增殖特征的良好指标. 是DNA合成时聚合酶δ的辅酶，是细胞增殖周期中DNA合成的必要蛋白，在细胞进入增殖时期出现[4]. 有资料表明，Hp可以加速胃粘膜细胞的复制，引起胃粘膜细胞增殖的可能机制是：Hp尿素酶分解尿素产生氨，氨可加速有丝分裂[5].
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本研究显示，PCNA指数在Hp阳性组较阴性组明显增加(P<0.01)，经除菌治疗后，Hp转阴者PCNA指数同Hp仍为阳性者比较，两者之间的差异有非常显著的意义(P<0.01).
P53是一个抑癌基因，在几乎所有种类的恶性肿瘤中皆有高水平的表达[6]. 因为野生型P53蛋白质的T1/2仅30min左右，所以免疫组化方法一般难以检测到. 而突变型P53蛋白质的T1/2可延长达数小时，因此可用免疫组化方法测出. 野生型P53基因是细胞周期中G1期的监控基因，阻止DNA有突变的细胞克隆进入G1期，以使其有更多时间进行DNA修复. p53基因突变或缺失与恶性肿瘤的发生密切相关[7]. 本研究显示，Hp阳性胃良性病变与Hp阴性胃良性病变相比有非常显著差异(P<0.01). 除菌后Hp阴性组与除菌前及除菌后Hp仍阳性组相比，差异非常显著(P<0.01). 研究表明，Hp感染可促进突变型p53基因表达增强，Hp根除治疗后，其表达降低. Hp感染促进p53基因突变和表达增强的机制可能是，Hp感染后可导致胃粘膜一氧化氮合成酶增多，氧自由基释放[8]，进而引起DNA损伤，导致p53基因突变[9]. 正常情况下野生型p53起转录因子作用，能启动WAF/cipⅠ基因的表达[10]，WAF/cipⅠ基因编码P21蛋白能抑制PCNA，激活DNA聚合酶，从而抑制细胞增殖[11]，突变型p53则失去这一功能，细胞增殖活性增加. 我们还发现，P53蛋白染色阳性组PCNA显著高于染色阴性组，提示P53蛋白的表达与细胞增殖密切相关，表明Hp感染可促进胃粘膜上皮细胞增殖，使突变型p53基因不断增强，可能是胃癌发生的一个重要原因. 因此，预廓獺p感染及根除Hp治疗，是防止发生胃癌的一个重要措施.
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4 参考文献
1 张天泽，徐光炜. 肿瘤学. 天津：天津科学技术出版社，1996：1428-1429
2 Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, Chang Y, Vogelman JH, Orentreich N, Sibley RK. Helicobacter pylori infection
and the risk of gastric carcinoma. N Engl J Med, 1991;325:1127-1131
3 Correa P. Human gastric carcinogenesis: a multistep and multifactorial Process-first American cancer society award lecture on
, 百拇医药
cancer epidmiology and prevention. Cancer Res, 1992;52:6735-6740
4 Fairman NP. DNA polymerase d/PCNA actions and interactions. J Pathol, 1990;137:313-330
5 Brenes F, Ruiz B, Correa P, Hunter F, Rhamakrishnan T, Fontham E, Shi TY. Helicobacter pylori causes hyper-proliferating of
the gastric epithelium; pre and post eradication indices of proliferating cell nuclear antigen. Am J Gastroenterol,1993;88:1870-1872
, http://www.100md.com
6 Hoston M. p53 mutation in human cancer. Science, 1991;253:49-53
7 Lane L. p53 guardian of the genome. Nature, 1992;358:15-21
8 Moss SF, Calam J, Agarwal B, Wang S, Rholt P. Induction of gastric epithelial apoptosis by Helicobacter pylori.
Gut, 1996;38:498-501
9 Nguyen T, Brunson D, Crespi CL, Penman BW, Wishnok JS, Tannenbaum SR. DNA damage and mutation in human calls exposed
, 百拇医药
to nitric in vitro. Proc Natl Acad Sci USA, 1992;89:3030-3034
10 Culotta E, Jr DK. p53 sweeps through cancer research. Science, 1993;262:1958-1962
11 Wage S, Hannon GJ, Beach D. The p21 inhibitor of cyclin-dependent kinases controls DNA replication by interaction with
PCNA. Nature, 1994;369:574-57
9, http://www.100md.com(高 华 袁 媛 吴烨秋 王 兰 董 明 张 忠)
项目负责人 高华中国医科大学肿瘤研究所 辽宁省沈阳市 110001
收稿日期 1999-07-01
Subject headings stomach neoplasms; Helicobacter infections; proliferating cell nuclear antigen; P53 protein
主题词 胃肿瘤；螺杆菌感染；增殖细胞核抗原；P53蛋白
目前认为，幽门螺杆菌(Hp)并非胃癌直接致癌物，而是通过对胃粘膜的损伤，促进病变发展的条件因素使胃癌危险性增高[1]. 我们通过对Hp感染的胃疾病进行根除治疗，采用PCR技术及免疫组化技术观测治疗前后对胃粘膜上皮增殖细胞核抗原(PCNA)及P53蛋白表达的影响. 探讨Hp可能的致癌机制.
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1 材料和方法
1.1 材料 胃粘膜活检标本207例，取自辽宁省庄河市胃癌高发现场，每例取新鲜胃粘膜4块(胃窦及病灶部)，其中1块行Hp-PCR检测，另外3块胃粘膜用中性福尔马林固定，石蜡包埋，制成5μm切片，行HE及免疫组织化学染色. 经Hp染色正常胃粘膜24例；浅表性胃炎58例；萎缩性胃炎Hp阳性18例；Hp阴性34例，不典型增生Hp阳性12例，Hp阴性29例；胃癌Hp阳性4例，Hp阴性28例.
1.2 方法 Hp基因PCR检测采用上海复华公司生产的Hp基因检测试剂盒，按照说明常规操作. Hp组织化学检测用HE染色及亚甲蓝(MB)染色，上述两种方法为阳性者视为Hp阳性，否则为阴性. Hp阳性胃疾病患者按三联疗法常规治疗(铋制剂+氨苄青霉素+甲硝唑)治疗3mo后在原部位取材复查. 治疗前后标本均进行PCNA，P53蛋白免疫组化染色，全部采用SP法，染色步骤按说明书进行，PBS代替一抗作阴性对照. 光镜下观察PCNA免疫组化染色切片的显色反映，数5个以上高倍视野不少于1000个细胞，计算阳性细胞数(细胞核呈清晰棕黄色)计算PCNA指数(增殖细胞指数). 光镜下P53蛋白阳性细胞胞核染色为棕色颗粒.
, 百拇医药
统计学处理 PCNA指数两样本均数的比较采用t检验. P53蛋白免疫组化检测结果采用χ2检验.
2 结果
本研究检测207例Hp相关性胃疾病不同胃粘膜PCNA指数及P53蛋白的表达情况结果见表1，2.
表1 Hp阳性胃粘膜PCNA指数及P53蛋白的表达
| 组别 | n | Hp | n | PCNA指数(%,x±s) | P53蛋白阳性 | |
| n | % | |||||
| 正常胃粘膜 | 24 | - | 24 | 9.8±3.7 | 0 | 0.0 |
| 浅表性胃炎 | 58 | + | 25 | 14.9±5.3 | 0 | 0.0 |
| - | 33 | 10.6±4.8 | 0 | 0.0 | ||
| 萎缩性胃炎 | 52 | + | 18 | 20.1±8.4b | 8 | 44.4b |
| - | 34 | 11.1±7.6 | 3 | 8.9 | ||
| 不典型增生 | 41 | + | 12 | 29.1±5.2b | 6 | 50.0b |
| - | 29 | 15.4±8.2 | 9 | 31.0 | ||
| 胃癌 | 32 | + | 4 | 46.4±11.7b | 3 | 75.0 |
| - | 28 | 35.7±9.3 | 18 | 64.3 |
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bP<0.01，vs Hp-组.
表2 Hp根除后PCNA指数及P53蛋白的表达
| 治疗 | Hp | n | PCNA指数(%,x±s) | P53蛋白阳性 | |
| n | % | ||||
| 前 | + | 55 | 23.5±3.7 | 14 | 25.4 |
| - | |||||
| 后 | 13 | 19.3±6.6a | 3 | 23.1a | |
| - | 42 | 11.5±5.2b | 5 | 11.9b |
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aP<0.05，vs 治疗前；bP<0.01，vs Hp阳性组.
3 讨论
大量研究表明，Hp是胃癌的危险因素[2]，与胃癌前病变及胃癌有密切关系[3]. 但Hp的致癌机制至今尚未阐明. PCNA是近年来公认的反映细胞增殖特征的良好指标. 是DNA合成时聚合酶δ的辅酶，是细胞增殖周期中DNA合成的必要蛋白，在细胞进入增殖时期出现[4]. 有资料表明，Hp可以加速胃粘膜细胞的复制，引起胃粘膜细胞增殖的可能机制是：Hp尿素酶分解尿素产生氨，氨可加速有丝分裂[5].
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本研究显示，PCNA指数在Hp阳性组较阴性组明显增加(P<0.01)，经除菌治疗后，Hp转阴者PCNA指数同Hp仍为阳性者比较，两者之间的差异有非常显著的意义(P<0.01).
P53是一个抑癌基因，在几乎所有种类的恶性肿瘤中皆有高水平的表达[6]. 因为野生型P53蛋白质的T1/2仅30min左右，所以免疫组化方法一般难以检测到. 而突变型P53蛋白质的T1/2可延长达数小时，因此可用免疫组化方法测出. 野生型P53基因是细胞周期中G1期的监控基因，阻止DNA有突变的细胞克隆进入G1期，以使其有更多时间进行DNA修复. p53基因突变或缺失与恶性肿瘤的发生密切相关[7]. 本研究显示，Hp阳性胃良性病变与Hp阴性胃良性病变相比有非常显著差异(P<0.01). 除菌后Hp阴性组与除菌前及除菌后Hp仍阳性组相比，差异非常显著(P<0.01). 研究表明，Hp感染可促进突变型p53基因表达增强，Hp根除治疗后，其表达降低. Hp感染促进p53基因突变和表达增强的机制可能是，Hp感染后可导致胃粘膜一氧化氮合成酶增多，氧自由基释放[8]，进而引起DNA损伤，导致p53基因突变[9]. 正常情况下野生型p53起转录因子作用，能启动WAF/cipⅠ基因的表达[10]，WAF/cipⅠ基因编码P21蛋白能抑制PCNA，激活DNA聚合酶，从而抑制细胞增殖[11]，突变型p53则失去这一功能，细胞增殖活性增加. 我们还发现，P53蛋白染色阳性组PCNA显著高于染色阴性组，提示P53蛋白的表达与细胞增殖密切相关，表明Hp感染可促进胃粘膜上皮细胞增殖，使突变型p53基因不断增强，可能是胃癌发生的一个重要原因. 因此，预廓獺p感染及根除Hp治疗，是防止发生胃癌的一个重要措施.
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4 参考文献
1 张天泽，徐光炜. 肿瘤学. 天津：天津科学技术出版社，1996：1428-1429
2 Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, Chang Y, Vogelman JH, Orentreich N, Sibley RK. Helicobacter pylori infection
and the risk of gastric carcinoma. N Engl J Med, 1991;325:1127-1131
3 Correa P. Human gastric carcinogenesis: a multistep and multifactorial Process-first American cancer society award lecture on
, 百拇医药
cancer epidmiology and prevention. Cancer Res, 1992;52:6735-6740
4 Fairman NP. DNA polymerase d/PCNA actions and interactions. J Pathol, 1990;137:313-330
5 Brenes F, Ruiz B, Correa P, Hunter F, Rhamakrishnan T, Fontham E, Shi TY. Helicobacter pylori causes hyper-proliferating of
the gastric epithelium; pre and post eradication indices of proliferating cell nuclear antigen. Am J Gastroenterol,1993;88:1870-1872
, http://www.100md.com
6 Hoston M. p53 mutation in human cancer. Science, 1991;253:49-53
7 Lane L. p53 guardian of the genome. Nature, 1992;358:15-21
8 Moss SF, Calam J, Agarwal B, Wang S, Rholt P. Induction of gastric epithelial apoptosis by Helicobacter pylori.
Gut, 1996;38:498-501
9 Nguyen T, Brunson D, Crespi CL, Penman BW, Wishnok JS, Tannenbaum SR. DNA damage and mutation in human calls exposed
, 百拇医药
to nitric in vitro. Proc Natl Acad Sci USA, 1992;89:3030-3034
10 Culotta E, Jr DK. p53 sweeps through cancer research. Science, 1993;262:1958-1962
11 Wage S, Hannon GJ, Beach D. The p21 inhibitor of cyclin-dependent kinases controls DNA replication by interaction with
PCNA. Nature, 1994;369:574-57
9, http://www.100md.com(高 华 袁 媛 吴烨秋 王 兰 董 明 张 忠)