不同长度丁型肝炎病毒核酶的体外自剪切活性及其意义
中国人民解放军第三军医大学西南医院全军传染病专科中心 重庆市 400038
于乐成，男，1970-04-28生，江苏省姜堰人，汉族. 1994年江苏镇江医学院毕业，学士，1997年第三军医大学硕士生，主要从事肝炎发病机制及有关丁型肝炎病毒核酶的研究.
国家自然科学基金资助课题，No.39600031
项目负责人 于乐成，400038，重庆市，中国人民解放军第三军医大学西南医院全军传染病专科中心.
Supported by the National Natural Science Foundation of China, No.39600031
, http://www.100md.com
Correspondence to Yue-Cheng Yu, Research Center of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
收稿日期 1999-11-16 接收日期 1999-12-23
In vitro self-cleavage activity of hepatitis delta virus ribozymes with different length and its significance
Yue-Cheng Yu, Chang-Hai Gu, Qing-Mao, Qi-Fen Li and Yu-Ming Wang
, 百拇医药
Research Center of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Abstract
AIM To analyze in vitro self-cleavage activity of hepatitis delta virus ribozymes (HDV·Rz) with different length.
METHODS Two plasmids pRz277A and pRz277B which contain the HDV.Rz cDNA were linearized with restriction endoncleases XbaⅠ, EcoRⅠ or BamHⅠ. Various genomic ribozymes (g·Rz) and antigenomic ribozymes (ag·Rz)were transcribed from their templates with T7 phage RNA polymerase and labeled with α-32P-UTP. After reaction under certain conditions, these ribozymes were identified by 12% denatured polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and autoradiography.
, 百拇医药
RESULTS g·Rz24/100 which contain 24 nucleotides (nt) and 100nt at the 5＇ and 3＇ end of the cleavage site respectively and ag·Rz38/119 can almost be completely self-cleaved under proper conditions in vitro; g·Rz24/253 and ag·Rz38/239 also had self-cleavage activity but significantly lower than the former two ones, even when the temperature was up to 55℃ or different densities of deionized formamide were added.
CONCLUSION HDV. Rz with appropriate sizes have high self-cleavage activity in vitro and these findings will contribute to the research of trans-cleavage activity of HDV Rz.
, 百拇医药
Subject headings hepatitis D virus; virus ribozymes; self cleavage activity
Yu YC, Gu CH, Mao Q, Li QF, Wang YM. In vitro self cleavage activity of hepatitis delta virus ribozymes with different length and its significance. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,2000;8(1):39-41
摘要
目的 分析不同长度丁型肝炎病毒核酶的体外自剪切活性.
, 百拇医药
方法 用XbaⅠ,EcoRⅠ或BamHⅠ将含有HDV.Rz序列的pRz277正向质粒(pRz277A)和pRz277反向质粒(pRz277B)线性化,以α-32p-UTP标志和T7噬菌体RNA聚合酶转录出不同长度的基因组核酶(g.Rz)和抗基因组(即复制中间体)核酶(ag.Rz),在一定条件下进行自剪切反应,然后作聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和放射自显影.
结果 g.Rz24/100(自剪切位点5＇和3＇端分别含24nt和100nt,下同)、ag.Rz38/119在适当条件下绝大部分发生自剪切.g.Rz24/253和ag.Rz38/239也具有一定自剪切活性,但显著低于前两者,即使温度升至55℃或加入去离子甲酰胺也是如此.
结论 适宜长度的HDV.Rz在体外具有较高的自剪切活性.这些发现有助于我们下一步研究HDV.Rz的反式剪切作用.
, 百拇医药
主题词 丁型肝炎病毒;病毒核酶;自剪切活性
于乐成,顾长海,毛青,李奇芬,王宇明.不同长度丁型肝炎病毒核酶的体外自剪切活性及其意义.世界华人消化杂志，2000;8(1):39-41
0 引言
丁型肝炎病毒是长约1.7kb的单负股环状RNA病毒，其基因组能于U688-G689之间，抗基因组能于C904-G903之间(根据Makino et al 1987年报道的序列)发生分子内自我催化剪切，具有酶性RNA即核酶活性[1]. 我们首次于国内在克隆重庆地区HDV RNA核酶活性区cDNA序列的基础上，进行了不同长度g·Rz和ag·Rz自剪切活性的比较，以进一步了解HDV·Rz的特性，并为研究其反式剪切作用打下一定基础.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 质粒pRz277A和pRz277B由我室与军事医学科学院放射医学研究所共同构建，宿主菌为JM109. 质粒纯化提取试剂盒、T7转录盒分别购自Boehringer Mannheim公司和Promega公司，BamHⅠ, EcoRⅠ, XbaⅠ购自MBI公司，α-32P-UTP、X光片分别为北京亚辉公司和Kodak公司产品，电泳试剂、去离子甲酰胺等购自上海Sangon公司. 凝胶成象分析仪为Bia-Rad(Gel Doc 2000).
1.2 方法
1.2.1 不同长度HDV·Rz转录模板的制备 摇菌及提取质粒按试剂盒说明书进行，分别用XbaⅠ, EcoRⅠ将pRz277A线性化，获取ag·Rz38/119，ag·Rz38/239模板. 用XbaⅠ， BamHⅠ将pRz277B线性化以制备g·Rz24/100，g·Rz24/253模板. 经0.8%琼脂糖凝胶电泳证实完全消化后，常规酚(pH 8.0)/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提，乙醇沉淀，无RNA酶水重溶模板.
, 百拇医药
1.2.2 体外转录和自剪切反应 转录及RNA纯化均按试剂盒说明书进行. 各转录体系均为10μL，含模板1μg，α-32P-UTP 0.1μmol(5Ci/μmol)，T7RNA聚合酶1U，MgCl2 24mmol/L，HEPES-KOH(pH 7.5)，亚腈胺2mmol/L，DTT 40mmol/L，37℃转录2h，对g·Rz24/253，ag·Rz38/239，于纯化后进一步在Tris.Cl(pH 7.5) 50mM，MgCl2 20mmol/L条件下，于55℃或加入去离子甲酰胺至终浓度2.5mol/L，5mol/L，8mol/L，孵育2h后加入等体积反应终止液.
1.2.3电泳及放射显影 反应结束后，加18μL甲酰胺，5μL上样缓冲液，于含7mol/L尿素的12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳. 于-70℃放射自显影16h，X光片经0.5ms预曝光处理.
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2 结果
2.1 g·Rz的自剪切活性 g·Rz24/100 5＇端另含53nt载体序列，自剪切后5＇和3＇端产物分别应长77nt和100nt；g·Rz24/253的5＇和3＇端分别另含53nt和14nt载体序列，自剪切后5＇和3＇产物应分别长77nt和267nt，实际结果与此一致. 在37℃转录2h后，g·Rz24/100几乎完全自剪切，g·Rz24/253的自剪切活性则很弱(图1).
图1 g·Rz的自剪切活性.A：g·Rz24/253 B：g·Rz24/100 C：长93nt的参照RNA分子(图象经凝胶成象分析仪适当处理以减弱背景嗓音，下同)
2.2 ag·Rz的自剪切活性 ag·Rz38/119的5＇端另含28nt载体序列，自剪切后应产生66nt和119nt两个片段；ag·Rz38/239的5＇和3＇端分别另含28nt和5nt载体序列，自剪切后应可产生66nt和244nt两个片段；实际结果与此相符. 37℃转录2h后，ag·Rz38/119自剪切已接近完全，ag·Rz38/239的自剪切程度显著低于前者.(图2).
, http://www.100md.com
2.3 温度和变性剂对Rz活性的影响 在55℃或不同浓度甲酰胺存在的条件下，ag·Rz38/239(图3)和g·Rz24/253的自剪切活性未见明显增加.
图2 ag·Rz的自剪切活性. A：ag·Rz38/239 B：ag·Rz38/119
图3 不同温度下ag·Rz38/239的自剪切活性. A：37℃ B：55℃
3 讨论
在体外无细胞体系中研究提示，HDV·Rz自剪切位点两侧的序列越长，核酶活性越低. 国外先后报道. g·Rz36/100，g·Rz30/74，ag·Rz19/69等在适宜的Mg2+浓度等条件下均具有不同程度的自剪切活性，最短但又能保持较高自剪切活性的是g·Rz1/84和ag·Rz1/84. 我们首次在国内于克隆HDV RNA核酶活性区序列的基础上，证实ag·Rz38/119和g·Rz24/100也具有很高的自剪切活性，ag·Rz38/239和g·Rz24/253自剪切活性较弱，可能由于过长的序列形成的二级结构较复杂，妨碍其有效折叠成活性结构，升高温度或加入变性剂并不能充分消除这种影响. 另一方面，自然状态的HDV RNA长约1.7kb，但在病毒复制时仍可有效自我剪切，说明这种情况下有许多尚不清楚的因素可影响HDV. Rz活性.
, 百拇医药
HDV·Rz的自剪切活性是发生于HDV RNA分子内的定点切割反应(intramolecular cleavage)，又称为顺式剪切(cis-cleavage)，据报道它也可进行分子间剪切(intermolecular cleavage)，又称反式剪切(trans-cleavage)；自剪切活性较高的HDV·Rz，其反式剪切活性可能也较高. 反式HDV·Rz的底物结合区序列可以作一定程度的变动，以与不同的底物序列结合，从而在不同的位点切割RNA分子[2，3]；另一方面，HDV·Rz是目前发现的唯一可于自然状态下存在于哺乳动物细胞内的核酶，其在哺乳动物细胞内的定位、活性发挥等可能优于锤头状或发夹状核酶，因此HDV·Rz有可能发展为一种新型有效的核酸工具酶，以用来在不同位点切割HDV RNA，或切割异源性RNA分子，如其他肝炎病毒RNA分子. 我们正在进行这一方面的尝试.
4 参考文献
, 百拇医药
1 Been MD, Wickham GS. Self-cleavaging ribozynes of hepatitis delta virus RNA.Eur J Biochem, 1997;247:741-753
2 Fauzi H, Kawakami J, Nishkawa F, Nishikawa S.Analysis of the cleavage reaction of a trans-acting human hepatitis delta virus
ribozyme. Nucleic Acids Res,1997;25:3124-3130
3 Roy G, Anavoranich S, Pereault JP. Delta ribozyme has the ability to cleave in trans an mRNA. Nuclei Acids Res, 1999;27:924-948, 百拇医药(于乐成 顾长海 毛青 李奇芬 王宇明)
于乐成，男，1970-04-28生，江苏省姜堰人，汉族. 1994年江苏镇江医学院毕业，学士，1997年第三军医大学硕士生，主要从事肝炎发病机制及有关丁型肝炎病毒核酶的研究.
国家自然科学基金资助课题，No.39600031
项目负责人 于乐成，400038，重庆市，中国人民解放军第三军医大学西南医院全军传染病专科中心.
Supported by the National Natural Science Foundation of China, No.39600031
, http://www.100md.com
Correspondence to Yue-Cheng Yu, Research Center of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
收稿日期 1999-11-16 接收日期 1999-12-23
In vitro self-cleavage activity of hepatitis delta virus ribozymes with different length and its significance
Yue-Cheng Yu, Chang-Hai Gu, Qing-Mao, Qi-Fen Li and Yu-Ming Wang
, 百拇医药
Research Center of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Abstract
AIM To analyze in vitro self-cleavage activity of hepatitis delta virus ribozymes (HDV·Rz) with different length.
METHODS Two plasmids pRz277A and pRz277B which contain the HDV.Rz cDNA were linearized with restriction endoncleases XbaⅠ, EcoRⅠ or BamHⅠ. Various genomic ribozymes (g·Rz) and antigenomic ribozymes (ag·Rz)were transcribed from their templates with T7 phage RNA polymerase and labeled with α-32P-UTP. After reaction under certain conditions, these ribozymes were identified by 12% denatured polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and autoradiography.
, 百拇医药
RESULTS g·Rz24/100 which contain 24 nucleotides (nt) and 100nt at the 5＇ and 3＇ end of the cleavage site respectively and ag·Rz38/119 can almost be completely self-cleaved under proper conditions in vitro; g·Rz24/253 and ag·Rz38/239 also had self-cleavage activity but significantly lower than the former two ones, even when the temperature was up to 55℃ or different densities of deionized formamide were added.
CONCLUSION HDV. Rz with appropriate sizes have high self-cleavage activity in vitro and these findings will contribute to the research of trans-cleavage activity of HDV Rz.
, 百拇医药
Subject headings hepatitis D virus; virus ribozymes; self cleavage activity
Yu YC, Gu CH, Mao Q, Li QF, Wang YM. In vitro self cleavage activity of hepatitis delta virus ribozymes with different length and its significance. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,2000;8(1):39-41
摘要
目的 分析不同长度丁型肝炎病毒核酶的体外自剪切活性.
, 百拇医药
方法 用XbaⅠ,EcoRⅠ或BamHⅠ将含有HDV.Rz序列的pRz277正向质粒(pRz277A)和pRz277反向质粒(pRz277B)线性化,以α-32p-UTP标志和T7噬菌体RNA聚合酶转录出不同长度的基因组核酶(g.Rz)和抗基因组(即复制中间体)核酶(ag.Rz),在一定条件下进行自剪切反应,然后作聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和放射自显影.
结果 g.Rz24/100(自剪切位点5＇和3＇端分别含24nt和100nt,下同)、ag.Rz38/119在适当条件下绝大部分发生自剪切.g.Rz24/253和ag.Rz38/239也具有一定自剪切活性,但显著低于前两者,即使温度升至55℃或加入去离子甲酰胺也是如此.
结论 适宜长度的HDV.Rz在体外具有较高的自剪切活性.这些发现有助于我们下一步研究HDV.Rz的反式剪切作用.
, 百拇医药
主题词 丁型肝炎病毒;病毒核酶;自剪切活性
于乐成,顾长海,毛青,李奇芬,王宇明.不同长度丁型肝炎病毒核酶的体外自剪切活性及其意义.世界华人消化杂志，2000;8(1):39-41
0 引言
丁型肝炎病毒是长约1.7kb的单负股环状RNA病毒，其基因组能于U688-G689之间，抗基因组能于C904-G903之间(根据Makino et al 1987年报道的序列)发生分子内自我催化剪切，具有酶性RNA即核酶活性[1]. 我们首次于国内在克隆重庆地区HDV RNA核酶活性区cDNA序列的基础上，进行了不同长度g·Rz和ag·Rz自剪切活性的比较，以进一步了解HDV·Rz的特性，并为研究其反式剪切作用打下一定基础.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 质粒pRz277A和pRz277B由我室与军事医学科学院放射医学研究所共同构建，宿主菌为JM109. 质粒纯化提取试剂盒、T7转录盒分别购自Boehringer Mannheim公司和Promega公司，BamHⅠ, EcoRⅠ, XbaⅠ购自MBI公司，α-32P-UTP、X光片分别为北京亚辉公司和Kodak公司产品，电泳试剂、去离子甲酰胺等购自上海Sangon公司. 凝胶成象分析仪为Bia-Rad(Gel Doc 2000).
1.2 方法
1.2.1 不同长度HDV·Rz转录模板的制备 摇菌及提取质粒按试剂盒说明书进行，分别用XbaⅠ, EcoRⅠ将pRz277A线性化，获取ag·Rz38/119，ag·Rz38/239模板. 用XbaⅠ， BamHⅠ将pRz277B线性化以制备g·Rz24/100，g·Rz24/253模板. 经0.8%琼脂糖凝胶电泳证实完全消化后，常规酚(pH 8.0)/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提，乙醇沉淀，无RNA酶水重溶模板.
, 百拇医药
1.2.2 体外转录和自剪切反应 转录及RNA纯化均按试剂盒说明书进行. 各转录体系均为10μL，含模板1μg，α-32P-UTP 0.1μmol(5Ci/μmol)，T7RNA聚合酶1U，MgCl2 24mmol/L，HEPES-KOH(pH 7.5)，亚腈胺2mmol/L，DTT 40mmol/L，37℃转录2h，对g·Rz24/253，ag·Rz38/239，于纯化后进一步在Tris.Cl(pH 7.5) 50mM，MgCl2 20mmol/L条件下，于55℃或加入去离子甲酰胺至终浓度2.5mol/L，5mol/L，8mol/L，孵育2h后加入等体积反应终止液.
1.2.3电泳及放射显影 反应结束后，加18μL甲酰胺，5μL上样缓冲液，于含7mol/L尿素的12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳. 于-70℃放射自显影16h，X光片经0.5ms预曝光处理.
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2 结果
2.1 g·Rz的自剪切活性 g·Rz24/100 5＇端另含53nt载体序列，自剪切后5＇和3＇端产物分别应长77nt和100nt；g·Rz24/253的5＇和3＇端分别另含53nt和14nt载体序列，自剪切后5＇和3＇产物应分别长77nt和267nt，实际结果与此一致. 在37℃转录2h后，g·Rz24/100几乎完全自剪切，g·Rz24/253的自剪切活性则很弱(图1).
图1 g·Rz的自剪切活性.A：g·Rz24/253 B：g·Rz24/100 C：长93nt的参照RNA分子(图象经凝胶成象分析仪适当处理以减弱背景嗓音，下同)
2.2 ag·Rz的自剪切活性 ag·Rz38/119的5＇端另含28nt载体序列，自剪切后应产生66nt和119nt两个片段；ag·Rz38/239的5＇和3＇端分别另含28nt和5nt载体序列，自剪切后应可产生66nt和244nt两个片段；实际结果与此相符. 37℃转录2h后，ag·Rz38/119自剪切已接近完全，ag·Rz38/239的自剪切程度显著低于前者.(图2).
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2.3 温度和变性剂对Rz活性的影响 在55℃或不同浓度甲酰胺存在的条件下，ag·Rz38/239(图3)和g·Rz24/253的自剪切活性未见明显增加.
图2 ag·Rz的自剪切活性. A：ag·Rz38/239 B：ag·Rz38/119
图3 不同温度下ag·Rz38/239的自剪切活性. A：37℃ B：55℃
3 讨论
在体外无细胞体系中研究提示，HDV·Rz自剪切位点两侧的序列越长，核酶活性越低. 国外先后报道. g·Rz36/100，g·Rz30/74，ag·Rz19/69等在适宜的Mg2+浓度等条件下均具有不同程度的自剪切活性，最短但又能保持较高自剪切活性的是g·Rz1/84和ag·Rz1/84. 我们首次在国内于克隆HDV RNA核酶活性区序列的基础上，证实ag·Rz38/119和g·Rz24/100也具有很高的自剪切活性，ag·Rz38/239和g·Rz24/253自剪切活性较弱，可能由于过长的序列形成的二级结构较复杂，妨碍其有效折叠成活性结构，升高温度或加入变性剂并不能充分消除这种影响. 另一方面，自然状态的HDV RNA长约1.7kb，但在病毒复制时仍可有效自我剪切，说明这种情况下有许多尚不清楚的因素可影响HDV. Rz活性.
, 百拇医药
HDV·Rz的自剪切活性是发生于HDV RNA分子内的定点切割反应(intramolecular cleavage)，又称为顺式剪切(cis-cleavage)，据报道它也可进行分子间剪切(intermolecular cleavage)，又称反式剪切(trans-cleavage)；自剪切活性较高的HDV·Rz，其反式剪切活性可能也较高. 反式HDV·Rz的底物结合区序列可以作一定程度的变动，以与不同的底物序列结合，从而在不同的位点切割RNA分子[2，3]；另一方面，HDV·Rz是目前发现的唯一可于自然状态下存在于哺乳动物细胞内的核酶，其在哺乳动物细胞内的定位、活性发挥等可能优于锤头状或发夹状核酶，因此HDV·Rz有可能发展为一种新型有效的核酸工具酶，以用来在不同位点切割HDV RNA，或切割异源性RNA分子，如其他肝炎病毒RNA分子. 我们正在进行这一方面的尝试.
4 参考文献
, 百拇医药
1 Been MD, Wickham GS. Self-cleavaging ribozynes of hepatitis delta virus RNA.Eur J Biochem, 1997;247:741-753
2 Fauzi H, Kawakami J, Nishkawa F, Nishikawa S.Analysis of the cleavage reaction of a trans-acting human hepatitis delta virus
ribozyme. Nucleic Acids Res,1997;25:3124-3130
3 Roy G, Anavoranich S, Pereault JP. Delta ribozyme has the ability to cleave in trans an mRNA. Nuclei Acids Res, 1999;27:924-948, 百拇医药(于乐成 顾长海 毛青 李奇芬 王宇明)