实验性暴发性肝功衰竭大鼠肝再生与一氧化氮的关系
中国医科大学第二临床学院传染科 辽宁省沈阳市 110003
项目负责人 王玉梅中国医科大学第二临床学院传染科 辽宁省沈阳市 110003
收稿日期 1999-09-22 接收日期 1999-11-19
Subject headings liver failure; nitric oxide; liver regeneration
主题词 肝功能衰竭；一氧化氮；肝再生
暴发性肝衰竭(FHF)的发病机制至今仍不十分清楚[1，2]，目前关于FHF时NO与肝细胞损害及肝再生的关系亦尚无定论. 我们通过对实验性亚急性肝功衰竭模型进行PCNA及NOS表达分布状态的分析，明确FHF时NO与肝再生的关系，进一步探讨FHF时肝再生不良的原因.
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1 材料和方法
1.1 材料 亚急性肝功衰竭模型的制备：参照Ohnishi et al[3]改良方法. Wistar ♂大鼠(中国医科大学第二临床学院动物实验室提供)150只，体质量200g，先取50只，随机分成5组，每组10只，选用内毒素同型物FS-112(购自Ono Phamaceutial Co Japan)，以30mg/kg(溶于30mL/L乙二醇，50mL/L乙醇，50g/L葡萄糖)经尾静脉注入，2d后行70%部分肝切除术，分别在术后6，12，24，36，48h进行心脏采血、分离血清，-20℃保存待检，并立即开腹留取剩余肝组织标本，经100mL/L中性福尔马林固定保存. 再取50只，同样分为5组，经尾静脉注入等量生理盐水，采血及取肝组织标本的时间及方式同前作为对照. 此外，取40只随机分为4组，每组10只，以同样剂量FS-112注入尾静脉，分别于注入后第6，12，24，48h采血并留取肝脏标本，另取10只作正常对照，以等剂量生理盐水注入尾静脉，并以同样方式采血及留取肝脏标本.
, 百拇医药
1.2 方法 血清ALT及TB水平检测采用Enore Chemistry System (Barker Instrument). 采用PCNA单位水平(购自Sigma公司)及过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒(购自北京中山生物技术有限公司)，对进行部分肝切除术后的肝脏标本，进行免疫组化染色，PCNA单抗稀释浓度为1∶60. PCNA阳性细胞数计算方法：PCNA阳性细胞数/100个肝细胞数×100%，在不同分布区域反复记数3次取平均值. 采用iNOS(诱导型NOS)单抗和cNOS(结构型NOS)单抗及过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒(均购自北京中山生物技术有限公司)，对肝脏标本进行免疫组化染色，其中iNOS单抗和cNOS单抗的稀释浓度均为1∶75. iNOS和cNOS阳性细胞数计算方法：同PCNA阳性细胞数计算方法.
统计学处理 所有数据均以X±s表示，统计学差异采用两个同样样本均数比较的t检验.
, 百拇医药
2 结果
经FS-112预处理，2d后行70%部分肝脏切除术，病理检查可见到大块状出血坏死，术后不同时期ALT，TB水平进行性增高(表2). 以iNOS单抗和cNOS单抗进行免疫组化染色，在所有鼠的肝脏标本中均未发现cNOS分布，正常鼠肝脏内不表达iNOS，给予FS-112后6h即有iNOS表达，且iNOS的变化基本与ALT及TB的变化相平行，但有波动. 给予FS-112后12h，ALT，TB，iNOS水平达高峰，以后逐渐下降，至48h基本正常(表1). 以PCNA单抗经免疫组化染色，可见术后PCNA阳性细胞数随时间的延长呈进行性减少，从术后24h开始，与对照组相比有显著性差异(P<0.05，P<0.01，表2). 给药后不同时期iNOS与PCNA阳性细胞数呈负相关(表1)，iNOS于术后6h即出现，12h为低值，24h，36h又出现高峰，48h基本消失；无论是实验组还是对照组，术后36h内iNOS水平与PCNA间均呈现负相关的趋势(表2).
, 百拇医药
表1 FS-112后ALT，TB，iNOS及PCNA的变化(n=10，X±s)
, 百拇医药
aP<0.05，bP<0.01，vs 正常组.
表2 术后不同时期各指标检测结果(n=10，X±s)
, 百拇医药
aP<0.05，vs 6组，bP<0.01，vs 8组，cP<0.01，vs 10组.
3 讨论
NOS在肝脏中存在两种形式，一种是肝细胞和枯否细胞中的诱导型NOS(iNOS)，受内毒素及多种细胞因子诱导产生，主要参与炎症反应，在肝病中的作用更为重要. 另一种是血管肝窦等内皮细胞中的结构型NOS(cNOS)，不受内毒素及细胞因子影响，参与维持血管张力、神经传导等生理功能. 本文的各时期检测均未发现cNOS，提示cNOS不参与此种FHF动物模型的肝损伤及再生过程. NO在肝脏疾病中的作用已受到广泛关注由于所采取的实验，有关NO参与肝细胞损害的研究大多源于动物实验. Billiar et al[4]以痤动物实验疮杆菌/LPS诱导的小鼠急性肝坏死模型，王根生et al[5]的BCG/LPS诱导的免疫性肝损伤模型中均发现NO的变化与肝损伤的程度相平行，但他们进一步应用NO抑制剂后却发现无论生化学还是病理学检查均可见肝损害反而加重，提示NO又具有保肝作用. 此种双重作用的机制尚不十分清楚.本结果表明，在FS-112诱导的FHF模型中，肝组织iNOS的变化与血清ALT，TB水平的变化相平行，亦提示NO的变化与肝损伤的程度相一致. Laskin et al[6]利用原位杂交技术对大鼠内毒素(LPS)性急性肝损害下肝组织的iNOS的基因表达进行研究表明，肝细胞iNOS mRNA在用LPS后6h即有表达，24h后已基本恢复至正常. 本结果表明，给予FS-112后6h肝组织表达iNOS, 12h达高峰，以后逐渐下降，48h基本正常，正常鼠肝组织内未见iNOS表达，给予FS-112后，iNOS分布于整个肝小叶，肝实质和非实质细胞皆有表达，提示FHF时内毒素血症可诱导肝组织表达iNOS，从而引起NO的大量合成，但出现早，持续时间短.
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NO与肝再生的关系在以往已有研究，无论是体内还是体外实验，均是对正常鼠行肝部分切除术后对二者的关系进行分析[7，8]. 本研究对FHF模型大鼠行肝大部切除术前及术后观察肝再生情况及肝组织iNOS的变化，发现术前各不同时期，iNOS与PCNA阳性细胞数呈负相关，从术后24h开始，PCNA阳性细胞数呈进行性减少的趋势，iNOS于术后6h出现，12h为低值，24h，36h又出现高峰，48h基本消失；术后36h内，iNOS水平与PCNA间呈负相关趋势. 正常肝细胞在一定因素启动下从G0期至G1期，后者持续12h～14h进入S期，即DNA合成期，亦为PCNA表达的高峰期，可持续22h～24h，30h～37h为G2+M期，同时也是肝细胞进入第2个增殖周期及非肝实质细胞进入增殖状态. 本研究结果提示NO与肝细胞DNA合成呈负相关，且结合前述结果可知在FHF时，内毒素血症所致NO的合成出现早，持续时间短，故认为NO参与FHF时肝再生的早期反应的控制. 有研究表明，NO通过抑制DNA合成的酶类抑制其合成，亦可通过与DNA结合使之亚硝酰化，致DNA断裂或突变，影响其代谢. 但Hortelano et al[7]的研究结果提示NO抑制剂抑制肝细胞的再生，提示NO在肝再生中有双重作用. 由于肝再生的调控是一个众多因素相互作用、相互制约和协同调节的复杂过程，故需进一步研究，明确影响FHF时肝再生的确切机制，为临床FHF后肝再生的治疗提供行之有效的方法.
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4 参考文献
1 Simpson KJ, Lukacs NW, Colletti L, Strieter RM, Kunkel SL. Cytokines and the liver. J Hepatol, 1997;27:1120-1132
2 Wolf HK, Michalopoulos GK. Hepatocyte regeneration in acute fulminant and nonfulminant hepatitis: a study of proliferating
cell nuclear antigen expression. Hepatology, 1992;15:707-713
3 Ohnishi H, Muto Y. Immunological approach to impaired liver regeneration in fulminant hepatic failure.
, 百拇医药
Trop Gastroenterol, 1993;14:127
4 Billiar TR, Curran RD, Harbrecht BG, Stuehr DJ, Demetris AJ, Simmon S. Modulation of nitrogon oxide synthesis
in vivo: NG-monomethyl-L-arginine inhibits endotoxin-induced nitrite/nitrate biosynthesis while promoting hepatic
damage. J Leukocyte Biol, 1990;48:565-569
5 王根生，刘耕陶. 一氧化氮在小鼠肝损伤中的作用. 中华医学杂志，1996；76：203-206
, http://www.100md.com
6 Laskin DL, Valle MRD, Heck DE, Hwang SM, Ohnishi ST, Durham SK, Goller NL, Laskin JD. Hepatic nitric oxide production
following acute endotoxemia in rats is mediated by increased inducible nitric oxide synthase gene expression.
Hepatology, 1995;22:223-234
7 Hortelano S, Dewez B, Genaro AM, Diaz-Guerra MJM, Bosca L. Nitric oxide is released in regenerating liver after partial
hepatectomy. Hepatology, 1995;21:776-785
8 Obolenskaya MY, Vanin AF, Mordvintcev PI, Mülsch A, Decker K. Epr evidence of nitric oxide production by the regenerating rat
liver. Biochem and Biophys Res Commun, 1994;202:571-576, 百拇医药(王玉梅 冯国和)
项目负责人 王玉梅中国医科大学第二临床学院传染科 辽宁省沈阳市 110003
收稿日期 1999-09-22 接收日期 1999-11-19
Subject headings liver failure; nitric oxide; liver regeneration
主题词 肝功能衰竭；一氧化氮；肝再生
暴发性肝衰竭(FHF)的发病机制至今仍不十分清楚[1，2]，目前关于FHF时NO与肝细胞损害及肝再生的关系亦尚无定论. 我们通过对实验性亚急性肝功衰竭模型进行PCNA及NOS表达分布状态的分析，明确FHF时NO与肝再生的关系，进一步探讨FHF时肝再生不良的原因.
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1 材料和方法
1.1 材料 亚急性肝功衰竭模型的制备：参照Ohnishi et al[3]改良方法. Wistar ♂大鼠(中国医科大学第二临床学院动物实验室提供)150只，体质量200g，先取50只，随机分成5组，每组10只，选用内毒素同型物FS-112(购自Ono Phamaceutial Co Japan)，以30mg/kg(溶于30mL/L乙二醇，50mL/L乙醇，50g/L葡萄糖)经尾静脉注入，2d后行70%部分肝切除术，分别在术后6，12，24，36，48h进行心脏采血、分离血清，-20℃保存待检，并立即开腹留取剩余肝组织标本，经100mL/L中性福尔马林固定保存. 再取50只，同样分为5组，经尾静脉注入等量生理盐水，采血及取肝组织标本的时间及方式同前作为对照. 此外，取40只随机分为4组，每组10只，以同样剂量FS-112注入尾静脉，分别于注入后第6，12，24，48h采血并留取肝脏标本，另取10只作正常对照，以等剂量生理盐水注入尾静脉，并以同样方式采血及留取肝脏标本.
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1.2 方法 血清ALT及TB水平检测采用Enore Chemistry System (Barker Instrument). 采用PCNA单位水平(购自Sigma公司)及过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒(购自北京中山生物技术有限公司)，对进行部分肝切除术后的肝脏标本，进行免疫组化染色，PCNA单抗稀释浓度为1∶60. PCNA阳性细胞数计算方法：PCNA阳性细胞数/100个肝细胞数×100%，在不同分布区域反复记数3次取平均值. 采用iNOS(诱导型NOS)单抗和cNOS(结构型NOS)单抗及过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒(均购自北京中山生物技术有限公司)，对肝脏标本进行免疫组化染色，其中iNOS单抗和cNOS单抗的稀释浓度均为1∶75. iNOS和cNOS阳性细胞数计算方法：同PCNA阳性细胞数计算方法.
统计学处理 所有数据均以X±s表示，统计学差异采用两个同样样本均数比较的t检验.
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2 结果
经FS-112预处理，2d后行70%部分肝脏切除术，病理检查可见到大块状出血坏死，术后不同时期ALT，TB水平进行性增高(表2). 以iNOS单抗和cNOS单抗进行免疫组化染色，在所有鼠的肝脏标本中均未发现cNOS分布，正常鼠肝脏内不表达iNOS，给予FS-112后6h即有iNOS表达，且iNOS的变化基本与ALT及TB的变化相平行，但有波动. 给予FS-112后12h，ALT，TB，iNOS水平达高峰，以后逐渐下降，至48h基本正常(表1). 以PCNA单抗经免疫组化染色，可见术后PCNA阳性细胞数随时间的延长呈进行性减少，从术后24h开始，与对照组相比有显著性差异(P<0.05，P<0.01，表2). 给药后不同时期iNOS与PCNA阳性细胞数呈负相关(表1)，iNOS于术后6h即出现，12h为低值，24h，36h又出现高峰，48h基本消失；无论是实验组还是对照组，术后36h内iNOS水平与PCNA间均呈现负相关的趋势(表2).
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表1 FS-112后ALT，TB，iNOS及PCNA的变化(n=10，X±s)
| 组别 | t/h | ALT(u/L) | TB(μmol/L) | iNOS(%) | PCNA(%) |
| 正常 | 55±35 | 16.8±9.7 | 0 | 0 | |
| 1 | 6 | 152±85b | 17.2±2.4 | 5.3±2.1 | 32.1±11.4 |
| 2 | 12 | 453±89b | 37.7±15.6b | 48.5±23.2 | 10.8±6.6 |
| 3 | 24 | 109±38a | 42.1±20.5b | 22.0±5.4 | 18.6±9.5 |
| 4 | 48 | 66±33 | 20.7±0.3 | 1.6±0.3 | 39.3±19.2 |
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aP<0.05，bP<0.01，vs 正常组.
表2 术后不同时期各指标检测结果(n=10，X±s)
| 组别 | 处理因素 | 时 期 | ALT (u/L) | TB (μmol/L) | PCNA (%) | iNOS (%) | |
| FS-112 | NS | ||||||
| 正常 | 55±35 | 16.8±9.7 | 0 | ||||
| 1 | + | - | 6h | 95.6±30.5 | 17.5±5.7 | 20.4±15.7 | 23.2±11.5 |
| 2 | - | + | 6h | 82.4±38.2 | 19.2±8.7 | 21.5±12.1 | 11.2±8.3 |
| 3 | + | - | 12h | 142.3±31.6 | 19.3±8.2 | 38.6±20.3 | 26.5±15.2 |
| 4 | - | + | 12h | 157.8±74.3 | 21.3±12.6 | 41.7±21.7 | 5.9±3.2 |
| 5 | + | - | 24h | 138.2±43.8a | 26.7±9.4a | 18.8±11.2a | 47.6±25.9 |
| 6 | - | + | 24h | 78.2±33.3 | 16.2±8.9 | 30.7±16.8 | 36.4±17.7 |
| 7 | + | - | 36h | 582.9±311.6b | 38.5±12.6b | 7.7±5.7b | 56.1±28.3 |
| 8 | - | + | 36h | 72.9±29.4 | 16.7±8.2 | 28.5±12.3 | 42.5±22.6 |
| 9 | + | - | 48h | 632.4±302.7c | 78.7±13.8c | 5.7±8.9c | 2.7±0.8 |
| 10 | - | + | 48h | 63.5±31.7 | 17.1±7.3 | 15.6±7.2 | 0 |
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aP<0.05，vs 6组，bP<0.01，vs 8组，cP<0.01，vs 10组.
3 讨论
NOS在肝脏中存在两种形式，一种是肝细胞和枯否细胞中的诱导型NOS(iNOS)，受内毒素及多种细胞因子诱导产生，主要参与炎症反应，在肝病中的作用更为重要. 另一种是血管肝窦等内皮细胞中的结构型NOS(cNOS)，不受内毒素及细胞因子影响，参与维持血管张力、神经传导等生理功能. 本文的各时期检测均未发现cNOS，提示cNOS不参与此种FHF动物模型的肝损伤及再生过程. NO在肝脏疾病中的作用已受到广泛关注由于所采取的实验，有关NO参与肝细胞损害的研究大多源于动物实验. Billiar et al[4]以痤动物实验疮杆菌/LPS诱导的小鼠急性肝坏死模型，王根生et al[5]的BCG/LPS诱导的免疫性肝损伤模型中均发现NO的变化与肝损伤的程度相平行，但他们进一步应用NO抑制剂后却发现无论生化学还是病理学检查均可见肝损害反而加重，提示NO又具有保肝作用. 此种双重作用的机制尚不十分清楚.本结果表明，在FS-112诱导的FHF模型中，肝组织iNOS的变化与血清ALT，TB水平的变化相平行，亦提示NO的变化与肝损伤的程度相一致. Laskin et al[6]利用原位杂交技术对大鼠内毒素(LPS)性急性肝损害下肝组织的iNOS的基因表达进行研究表明，肝细胞iNOS mRNA在用LPS后6h即有表达，24h后已基本恢复至正常. 本结果表明，给予FS-112后6h肝组织表达iNOS, 12h达高峰，以后逐渐下降，48h基本正常，正常鼠肝组织内未见iNOS表达，给予FS-112后，iNOS分布于整个肝小叶，肝实质和非实质细胞皆有表达，提示FHF时内毒素血症可诱导肝组织表达iNOS，从而引起NO的大量合成，但出现早，持续时间短.
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NO与肝再生的关系在以往已有研究，无论是体内还是体外实验，均是对正常鼠行肝部分切除术后对二者的关系进行分析[7，8]. 本研究对FHF模型大鼠行肝大部切除术前及术后观察肝再生情况及肝组织iNOS的变化，发现术前各不同时期，iNOS与PCNA阳性细胞数呈负相关，从术后24h开始，PCNA阳性细胞数呈进行性减少的趋势，iNOS于术后6h出现，12h为低值，24h，36h又出现高峰，48h基本消失；术后36h内，iNOS水平与PCNA间呈负相关趋势. 正常肝细胞在一定因素启动下从G0期至G1期，后者持续12h～14h进入S期，即DNA合成期，亦为PCNA表达的高峰期，可持续22h～24h，30h～37h为G2+M期，同时也是肝细胞进入第2个增殖周期及非肝实质细胞进入增殖状态. 本研究结果提示NO与肝细胞DNA合成呈负相关，且结合前述结果可知在FHF时，内毒素血症所致NO的合成出现早，持续时间短，故认为NO参与FHF时肝再生的早期反应的控制. 有研究表明，NO通过抑制DNA合成的酶类抑制其合成，亦可通过与DNA结合使之亚硝酰化，致DNA断裂或突变，影响其代谢. 但Hortelano et al[7]的研究结果提示NO抑制剂抑制肝细胞的再生，提示NO在肝再生中有双重作用. 由于肝再生的调控是一个众多因素相互作用、相互制约和协同调节的复杂过程，故需进一步研究，明确影响FHF时肝再生的确切机制，为临床FHF后肝再生的治疗提供行之有效的方法.
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4 参考文献
1 Simpson KJ, Lukacs NW, Colletti L, Strieter RM, Kunkel SL. Cytokines and the liver. J Hepatol, 1997;27:1120-1132
2 Wolf HK, Michalopoulos GK. Hepatocyte regeneration in acute fulminant and nonfulminant hepatitis: a study of proliferating
cell nuclear antigen expression. Hepatology, 1992;15:707-713
3 Ohnishi H, Muto Y. Immunological approach to impaired liver regeneration in fulminant hepatic failure.
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Trop Gastroenterol, 1993;14:127
4 Billiar TR, Curran RD, Harbrecht BG, Stuehr DJ, Demetris AJ, Simmon S. Modulation of nitrogon oxide synthesis
in vivo: NG-monomethyl-L-arginine inhibits endotoxin-induced nitrite/nitrate biosynthesis while promoting hepatic
damage. J Leukocyte Biol, 1990;48:565-569
5 王根生，刘耕陶. 一氧化氮在小鼠肝损伤中的作用. 中华医学杂志，1996；76：203-206
, http://www.100md.com
6 Laskin DL, Valle MRD, Heck DE, Hwang SM, Ohnishi ST, Durham SK, Goller NL, Laskin JD. Hepatic nitric oxide production
following acute endotoxemia in rats is mediated by increased inducible nitric oxide synthase gene expression.
Hepatology, 1995;22:223-234
7 Hortelano S, Dewez B, Genaro AM, Diaz-Guerra MJM, Bosca L. Nitric oxide is released in regenerating liver after partial
hepatectomy. Hepatology, 1995;21:776-785
8 Obolenskaya MY, Vanin AF, Mordvintcev PI, Mülsch A, Decker K. Epr evidence of nitric oxide production by the regenerating rat
liver. Biochem and Biophys Res Commun, 1994;202:571-576, 百拇医药(王玉梅 冯国和)