胃幽门螺杆菌亚硝酸盐还原酶及亚硝胺合成酶活性的测定意义
1浙江省德清县人民医院 313200
2浙江大学医学院附属邵逸夫医院
本课题受浙江省德清县科委基金资助(99-78).
项目负责人 施有奎浙江省德清县人民医院 313200
收稿日期 1999-10-19 接收日期 1999-12-01
Subject headings Helicobacter pylori; nitrite oxidoreductase; nitrosamine ligase; stomach neoplasms
, http://www.100md.com
主题词 螺杆菌，幽门；亚硝酸盐还原酶；亚硝胺合成酶；胃肿瘤
幽门螺杆菌(Hp)与胃癌的关系日益受到广泛关注. 大量的流行病学研究发现Hp感染高发区的胃癌发病率显著高于Hp感染低发区；血清Hp特异性抗体阳性率胃癌患者显著高于非胃癌患者. 因而WHO已将Hp列为Ⅰ类致癌物. 然其致癌机制迄今尚未阐明[1，2]. 亚硝酸盐，N-亚硝胺(简称亚硝胺)均属强烈致癌物，特别是后者已广泛用于实验动物胃癌模型的建立. Hp是否能通过亚硝酸盐、亚硝胺途径致癌呢至今国内未见类同报道. 我们采用化学法分析了Hp培养上清液中的亚硝酸盐、亚硝胺含量，以探讨Hp亚硝酸盐还原酶、亚硝胺合成酶活性. 现报道如下.
1 材料和方法
1.1 材料 Pylori培养基(BioMerieux公司，法国)亚硝酸钠(分析纯AR，上海化学试剂供应站)亚硝胺(Sigma公司，美国)布氏肉汤粉(上海腹泻疾病控制中心))Hp鉴定血清(Dako公司，丹麦). Hp菌株共59株. 其中来自胃癌患者21株，来自非胃癌患者(慢性浅表性胃炎患者21例，慢性萎缩性胃炎10例，消化性溃疡7例)38株. 以上菌株均从患者的新鲜胃粘膜分离. 菌株采用革兰染色. 生化反应和抗血清玻片凝集法鉴定.
, 百拇医药
1.2 方法 挑选生长于Pylori培养基的典型Hp菌落，用经无菌生理盐水湿润的棉签涂布转种于另一Pylori培养基，微需氧37℃培养48h后，用生理盐水洗下生长于培养基表面的Hp菌苔，离心洗涤3次，弃上清液，加入含50mL/L胎牛血清，10mmol/L底物液的布氏肉汤，轻轻吹打混匀，37℃微需氧开放培养72h(摇床振摇频率80次/min)，3000r/min×30min离心，收集上清液供亚硝酸盐、亚硝胺测定用. 阴性对照为含50mL/L胎牛血清、10mmol/L底物液的布氏肉汤37℃微需氧放置72h后，3000r/min×30min离心，收集上清液即可. 亚硝酸盐测定采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法[3]. 亚硝胺测定采用薄层层析萘胺显色定量法[3].
统计学处理 采用t检验和卡方检验.
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2 结果
2.1 亚硝酸盐/亚硝胺含量 胃癌组、非癌组Hp培养上清液亚硝酸盐、亚硝胺含量均显著高于阴性对照，提示Hp对亚硝酸盐、亚硝胺合成有影响，Hp菌体有亚硝酸盐还原酶、亚硝胺合成酶系的存在. 然胃癌组与非癌组Hp培养上清液中的亚硝酸盐、亚硝胺含量无显著性差别(P>0.05，表1)，提示Hp对亚硝酸盐，亚硝胺合成的影响与不同菌株有关.
2.2 亚硝酸盐还原酶/亚硝胺合成酶 若以亚硝酸盐还原酶、亚硝胺合成酶均阴性的金葡菌标准株为标准，凡含量大于或等于标准株的+1.96S以上者为阳性，则胃癌组亚硝酸盐还原酶阳性率14.3%，与非癌组比较P>0.05，表2；胃癌组亚硝胺合成酶阳性率10.0%，与非癌组比较P亦>0.05，提示Hp的亚硝酸盐还原酶、亚硝胺合成酶活性与菌株来源无关.
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表1 胃癌组Hp培养上清液亚硝酸盐/亚硝胺含量(X±s, mg/L)
aP<0.05，vs 阴性对照.
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表2 胃癌组Hp培养上清液亚硝酸盐还原酶、亚硝胺合成酶(%)
3 讨论
胃癌的发生是一个多病因，多阶段的过程. 在慢性胃炎-萎缩性胃炎-肠上皮化生-异型增生-胃癌这样一个漫长的过程中，各种致病因子可能单独或协同作用于不同的阶段. Hp是重要的致病因子之一. 目前大多数学者认为Hp感染主要作用于癌变的起始阶段，但其作用机制未明. Parsonnet提出Hp致癌机制；①细菌代谢产物直接作用于胃粘膜细胞；②类似病毒致癌机制，Hp DNA整合入胃粘膜细胞的DNA中；③Hp感染引起的炎性反应使胃粘膜细胞DNA受损[4]. 尽管目前对Parsonnet的3种假设已取得一些证据，但仍不足以阐明Hp与胃癌之间的关系. 亚硝酸盐是氮循环的中间产物，不稳定，在pH值较低时可与仲胺类化合物反应生成具致癌性的亚硝胺类物质. 亚硝胺在体内经一系列代谢生成不稳定的α-羟化衍生物，并自发裂解成醛和相应亚硝基单烷基胺，后者具有亲核性，可与DNA，RNA的碱基发生结合而致碱基对突变，引起DNA，RNA链大面积损伤等而致癌. 亚硝胺目前已广泛应用于实验动物胃癌模型的研究，约100μg/d的亚硝胺使动物诱癌发生率达90%[5]. 目前的研究已表明多种细菌在体外实验中均表达有亚硝酸盐还原酶、亚硝胺合成酶酶系活性，Hp是否亦具有该酶系活性呢迄今国内未见报道.
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本结果表明，胃癌、非胃癌组Hp培养上清液亚硝酸盐、亚硝胺浓度显著高于阴性对照，提示Hp亦具有亚硝酸盐还原酶、亚硝胺合成酶系. 然胃癌与非胃癌组二者无显著性差异，提示Hp的酶活性与Hp菌株来源无关，进一步佐证了Hp致癌作用时间的长期性. 若以亚硝酸盐还原酶亚硝胺合成酶均阴性的金葡菌标准株为标准，胃癌组、非胃癌组Hp亚硝酸盐还原酶阳性率14.3%，15.8%，亚硝胺合成酶9.5%，10.5%，二组间均P>0.05，亦提示Hp菌株来源对酶系活性影响无关. 然Hp亚硝酸盐还原酶、亚硝胺合成酶阳性菌株感染患者胃液亚硝酸盐、亚硝胺含量和机体对亚硝酸盐、亚硝胺合成的影响因素等需进一步探讨总结.
4 参考文献
1 胡伏莲，周殿元，贾博琦. 幽门螺杆菌感染的基础与临床. 北京：中国科学技术出版社，1997：210-212
, 百拇医药
2 Granner ME. Intestinal metaplasia and Helicobacter pylori: an endoscopic bioptic study of the gastric antrum.
Gut, 1992;33:16
3 国家环保局主编. 水和废水监测分析方法. 北京：中国环境科学出版社，1989：260-263
4 Parsonnet J. Helicobacter pylori and gastric cancer. Clin Gastroenterol North Am, 1993;22:99
5 江希明，郑树，丁仁瑞. 肿瘤生物学. 杭州：浙江科学技术出版社，1990：105-106, 百拇医药(施有奎1 谢鑫友2 林 洁2 钱可大2 劳征虹1 何世华1 陈一平1)
2浙江大学医学院附属邵逸夫医院
本课题受浙江省德清县科委基金资助(99-78).
项目负责人 施有奎浙江省德清县人民医院 313200
收稿日期 1999-10-19 接收日期 1999-12-01
Subject headings Helicobacter pylori; nitrite oxidoreductase; nitrosamine ligase; stomach neoplasms
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主题词 螺杆菌，幽门；亚硝酸盐还原酶；亚硝胺合成酶；胃肿瘤
幽门螺杆菌(Hp)与胃癌的关系日益受到广泛关注. 大量的流行病学研究发现Hp感染高发区的胃癌发病率显著高于Hp感染低发区；血清Hp特异性抗体阳性率胃癌患者显著高于非胃癌患者. 因而WHO已将Hp列为Ⅰ类致癌物. 然其致癌机制迄今尚未阐明[1，2]. 亚硝酸盐，N-亚硝胺(简称亚硝胺)均属强烈致癌物，特别是后者已广泛用于实验动物胃癌模型的建立. Hp是否能通过亚硝酸盐、亚硝胺途径致癌呢至今国内未见类同报道. 我们采用化学法分析了Hp培养上清液中的亚硝酸盐、亚硝胺含量，以探讨Hp亚硝酸盐还原酶、亚硝胺合成酶活性. 现报道如下.
1 材料和方法
1.1 材料 Pylori培养基(BioMerieux公司，法国)亚硝酸钠(分析纯AR，上海化学试剂供应站)亚硝胺(Sigma公司，美国)布氏肉汤粉(上海腹泻疾病控制中心))Hp鉴定血清(Dako公司，丹麦). Hp菌株共59株. 其中来自胃癌患者21株，来自非胃癌患者(慢性浅表性胃炎患者21例，慢性萎缩性胃炎10例，消化性溃疡7例)38株. 以上菌株均从患者的新鲜胃粘膜分离. 菌株采用革兰染色. 生化反应和抗血清玻片凝集法鉴定.
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1.2 方法 挑选生长于Pylori培养基的典型Hp菌落，用经无菌生理盐水湿润的棉签涂布转种于另一Pylori培养基，微需氧37℃培养48h后，用生理盐水洗下生长于培养基表面的Hp菌苔，离心洗涤3次，弃上清液，加入含50mL/L胎牛血清，10mmol/L底物液的布氏肉汤，轻轻吹打混匀，37℃微需氧开放培养72h(摇床振摇频率80次/min)，3000r/min×30min离心，收集上清液供亚硝酸盐、亚硝胺测定用. 阴性对照为含50mL/L胎牛血清、10mmol/L底物液的布氏肉汤37℃微需氧放置72h后，3000r/min×30min离心，收集上清液即可. 亚硝酸盐测定采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法[3]. 亚硝胺测定采用薄层层析萘胺显色定量法[3].
统计学处理 采用t检验和卡方检验.
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 亚硝酸盐/亚硝胺含量 胃癌组、非癌组Hp培养上清液亚硝酸盐、亚硝胺含量均显著高于阴性对照，提示Hp对亚硝酸盐、亚硝胺合成有影响，Hp菌体有亚硝酸盐还原酶、亚硝胺合成酶系的存在. 然胃癌组与非癌组Hp培养上清液中的亚硝酸盐、亚硝胺含量无显著性差别(P>0.05，表1)，提示Hp对亚硝酸盐，亚硝胺合成的影响与不同菌株有关.
2.2 亚硝酸盐还原酶/亚硝胺合成酶 若以亚硝酸盐还原酶、亚硝胺合成酶均阴性的金葡菌标准株为标准，凡含量大于或等于标准株的+1.96S以上者为阳性，则胃癌组亚硝酸盐还原酶阳性率14.3%，与非癌组比较P>0.05，表2；胃癌组亚硝胺合成酶阳性率10.0%，与非癌组比较P亦>0.05，提示Hp的亚硝酸盐还原酶、亚硝胺合成酶活性与菌株来源无关.
, 百拇医药
表1 胃癌组Hp培养上清液亚硝酸盐/亚硝胺含量(X±s, mg/L)
| 分组 | n | 亚硝酸盐 | 亚硝胺 |
| 胃癌组 | 21 | 0.061±0.056a | 0.011±0.009a |
| 非胃癌组 | 38 | 0.054±0.049a | 0.013±0.011a |
| 阴性对照 | 18 | 0.018±0.008 | 0.006±0.003 |
aP<0.05，vs 阴性对照.
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表2 胃癌组Hp培养上清液亚硝酸盐还原酶、亚硝胺合成酶(%)
| 分组 | n | 亚硝酸盐还原酶 | 亚硝胺合成酶 |
| 胃癌组 | 21 | 14.3(3) | 9.5(2) |
| 非胃癌组 | 38 | 15.8(6) | 10.5(4) |
3 讨论
胃癌的发生是一个多病因，多阶段的过程. 在慢性胃炎-萎缩性胃炎-肠上皮化生-异型增生-胃癌这样一个漫长的过程中，各种致病因子可能单独或协同作用于不同的阶段. Hp是重要的致病因子之一. 目前大多数学者认为Hp感染主要作用于癌变的起始阶段，但其作用机制未明. Parsonnet提出Hp致癌机制；①细菌代谢产物直接作用于胃粘膜细胞；②类似病毒致癌机制，Hp DNA整合入胃粘膜细胞的DNA中；③Hp感染引起的炎性反应使胃粘膜细胞DNA受损[4]. 尽管目前对Parsonnet的3种假设已取得一些证据，但仍不足以阐明Hp与胃癌之间的关系. 亚硝酸盐是氮循环的中间产物，不稳定，在pH值较低时可与仲胺类化合物反应生成具致癌性的亚硝胺类物质. 亚硝胺在体内经一系列代谢生成不稳定的α-羟化衍生物，并自发裂解成醛和相应亚硝基单烷基胺，后者具有亲核性，可与DNA，RNA的碱基发生结合而致碱基对突变，引起DNA，RNA链大面积损伤等而致癌. 亚硝胺目前已广泛应用于实验动物胃癌模型的研究，约100μg/d的亚硝胺使动物诱癌发生率达90%[5]. 目前的研究已表明多种细菌在体外实验中均表达有亚硝酸盐还原酶、亚硝胺合成酶酶系活性，Hp是否亦具有该酶系活性呢迄今国内未见报道.
, http://www.100md.com
本结果表明，胃癌、非胃癌组Hp培养上清液亚硝酸盐、亚硝胺浓度显著高于阴性对照，提示Hp亦具有亚硝酸盐还原酶、亚硝胺合成酶系. 然胃癌与非胃癌组二者无显著性差异，提示Hp的酶活性与Hp菌株来源无关，进一步佐证了Hp致癌作用时间的长期性. 若以亚硝酸盐还原酶亚硝胺合成酶均阴性的金葡菌标准株为标准，胃癌组、非胃癌组Hp亚硝酸盐还原酶阳性率14.3%，15.8%，亚硝胺合成酶9.5%，10.5%，二组间均P>0.05，亦提示Hp菌株来源对酶系活性影响无关. 然Hp亚硝酸盐还原酶、亚硝胺合成酶阳性菌株感染患者胃液亚硝酸盐、亚硝胺含量和机体对亚硝酸盐、亚硝胺合成的影响因素等需进一步探讨总结.
4 参考文献
1 胡伏莲，周殿元，贾博琦. 幽门螺杆菌感染的基础与临床. 北京：中国科学技术出版社，1997：210-212
, 百拇医药
2 Granner ME. Intestinal metaplasia and Helicobacter pylori: an endoscopic bioptic study of the gastric antrum.
Gut, 1992;33:16
3 国家环保局主编. 水和废水监测分析方法. 北京：中国环境科学出版社，1989：260-263
4 Parsonnet J. Helicobacter pylori and gastric cancer. Clin Gastroenterol North Am, 1993;22:99
5 江希明，郑树，丁仁瑞. 肿瘤生物学. 杭州：浙江科学技术出版社，1990：105-106, 百拇医药(施有奎1 谢鑫友2 林 洁2 钱可大2 劳征虹1 何世华1 陈一平1)