凋亡调控蛋白在溃疡性结肠炎活检组织中的表达
中国人民解放军济南军区总医院消化科 山东省济南市 250031
项目负责人 江学良中国人民解放军济南军区总医院消化科 山东省济南市 250031
Tel. +86-531-2600132
Email.xiaohuak@jn-pulic.sd.cninfo.net
收稿日期 1999-11-16 接收日期 1999-12-25
Subject headings apoptosis; colitis, ulcerative/pathology; biopsy
, 百拇医药
主题词 细胞凋亡；结肠炎，溃疡性/病理学；活组织检查
溃疡性结肠炎(UC)的病因和发病机制还不清楚，但由于该病在组织学上主要表现为结肠粘膜损伤，这是否由于结肠粘膜上皮细胞凋亡异常而引起粘膜损伤、溃疡[1-4]为阐明这一问题，我们应用免疫荧光标记和流式细胞技术动态检测了活动期和缓解期UC活检组织中与凋亡有关的3个关键性调控蛋白CD95(Apo-1/Fas)，Apo-2.7，Bcl-2表达，旨在从凋亡的角度探讨UC的发病机制.
1 材料和方法
1.1 材料 UC患者20例，男8例，女12例，平均年龄30.8岁， 均符合1993年太原全国慢性非感染性肠道疾病学术研讨会制订的溃疡性结肠炎诊断标准[5]. 所有患者均于活动期和缓解期各取活检组织1次. 正常人对照组20例，男8例，女12例，平均年龄30.6岁，均为健康查体者.
, 百拇医药
1.2 方法 ①试剂来源：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的单克隆抗体鼠抗人Apo-1-FITC，Bcl-2-FITC，阴性对照IgG1-FITC及藻红蛋白(PE)标记的Apo-2.7mAb(Apo-2.7-PE)均由法国国际免疫公司生产；淋巴细胞分离液由中国医学科学院血液研究所生产. ②样品处理：UC患者肠镜检查时用活检钳取结肠溃疡边缘新鲜组织0.2g～1.0g，正常人在乙状结肠处取新鲜组织0.2g～1.0g，置于重叠的100目铜网及260目尼龙网上，用眼科剪剪成1.0mm×1.0mm×1.0mm碎块，然后用眼科剪轻搓，边搓 边用磷酸缓冲液(PBS)冲洗入小烧瓶中，直至组织搓净. 1500r/min离心5min，再用PBS洗2次，1000r/min，离心2min，弃上清后备用. ③免疫反应：反应前调整细胞数至109/mL，分取100μL放入5支试管，1号，2号管用700mL/L乙醇固定过夜，次晨用生理盐水漂洗2遍，1500r/min 离心5min，分别加入20μL Apo-2.7-PE和Ig-PE，3号，4号，5号管分别加20μL IgG-FITC，Fas-FITC和Bcl-2-FITC，室温避光反应30min，上机. ④流式细胞检测：流式细胞仪为FACScan型，美国Becton Dickinson生产. 上机前先以标准荧光微球调整仪器变异系数在2.0%以内，上机后收集10000个细胞，荧光强度以对数放大，测定光散射数据，结果采用Macintosh 650型计算机及Cell Quest Plot软件进行数据分析点图及组方图，以Fas,Bcl-2及Apo-2.7阳性细胞(细胞膜含Fas,Bcl-2及Apo-2.7的细胞)的百分数表示.
, 百拇医药
统计学处理 各组参数的比较采用计量资料的t检验，各组参数的相关性采用直线相关分析.
2 结果
2.1 UC患者活检组织中Apo-1，Apo-2.7，Bcl-2的表达 表1.
表1 UC患者活检组织中Apo-1，Apo-2.7，Bcl-2的表达(X±s,%)
, 百拇医药
aP<0.05， bP<0.01，vs 正常人；cP<0.05，vs 缓解期.
从表1中可以看出，活动期UC患者结肠粘膜上皮细胞凋亡(Apo-2.7)明显增多，与正常人相比P<0.01；凋亡调控蛋白(Apo-1，Bcl-2)表达显著增加. 经治疗后，随着病情由活动期转变为缓解期，上述指标均明显下降(P<0.05)，但仍显著高于正常人(P<0.05).
2.2 经直线相关分析表明，Apo-2.7与Apo-1成正相关(r=0.513，P<0.05)，Bcl-2与Apo-2.7无显著相关(r=0.322，P>0.05).
3 讨论
细胞凋亡(apoptosis)最初是由英国学者Kerr et al提出的用以描述一种在形态学上有别于细胞坏死的死亡方式，从功能上定义又称细胞程序性死亡(programed cell death)，是细胞接受某种信号或受到某些刺激因素后一种主动的，由凋亡相关基因调控的细胞“自杀”过程[6]. Apo-2.7是Mr38000的线粒体膜蛋白，可作为细胞凋亡的早期，特异的标记，应用流式细胞仪检测此蛋白可定量反映淋巴细胞凋亡率[7]. 正常人结肠粘膜上皮细胞有低水平Apo-2.7表达，表明部分结肠粘膜细胞在机体的总调控下发生细胞凋亡，以去除衰老，异常细胞维持结肠粘膜正常的新陈代谢. 活动期UC患者Apo-2.7表达较正常人明显增加，表明结肠粘膜上皮细胞凋亡增多，由上皮细胞构成的粘膜屏障破坏，导致结肠粘膜的损伤，溃疡. 由于结肠细胞凋亡主要发生在粘膜上皮层，因此病变局限在粘膜层，这可以部分解释UC的发病机制. 经治疗后，随着病情由活动期转变为缓解期，Apo-2.7表达下调，结肠粘膜上皮细胞凋亡减少，粘膜屏障逐渐修复，溃疡逐渐愈合，因此，Apo-2.7检测还可作为判断病情活动的指标.
, 百拇医药
Apo-1又称Fas，现命名为CD95分子，属TNFR和神经生长因子受体家族的成员之一，它是由Fas基因编码的具有诱导细胞凋亡能力的细胞表面Ⅰ型膜蛋白[8，9]. Fas与Fas配体(Fas-L)组蒄as系统，诱导细胞凋亡. 本研究中活动期UC患者Apo-1表达较正常人有显著增高，且相关分析表明Apo-1与Apo-2.7表达呈正相关，提示结肠粘膜上皮细胞凋亡增多与诱导凋亡基因Apo-1高表达有关，即Apo-1表达上调诱导结肠上皮细胞过度凋亡. 而缓解期UC患者Apo-1虽较活动期明显下降，但仍显著高于正常人，是否与疾病复发或预后有关尚需进一步探讨.
Bcl-2基因是人们在研究B细胞淋巴瘤中发现的一种异常表达的原癌基因，位于第18号染色体短臂(18q21.3)[10]. 近年发现，Bcl-2为一种细胞凋亡抑制基因[11]. 正常人结肠粘膜上皮细胞有低水平的Bcl-2表达，保证上皮细胞增生和更新，以维持结肠粘膜屏障的动态平衡. 本研究中，活动期UC患者Bcl-2表达明显增多，但相关分析表明Bcl-2和细胞凋亡的标志物Apo-2.7表达无显著相关(P>0.05)，提示Bcl-2表达上调是对结肠粘膜上皮细胞损伤的一种反应性增生，可能与隐窝上皮细胞再生修复有关[4]. 因此，结肠粘膜活检组织中凋亡调控蛋白Apo-1,Apo-2，Bcl-2异常表达在UC的发病机制中具有重要作用[12].
, 百拇医药
4 参考文献
1 Ueyama H, Kiyohara T, Sawada N, Isozaki K, Kitamuar S, Miyagawa J. High Fas ligand expression on lympocytes in lessions of
ulcerative colitis. Gut, 1998;43:48-55
2 Strater J, Wellish I, Riedl S, Walczak H, Koretz K, Tandara A, Krammer PH, Moller P. CD95 (Apo-1/Fas) mediated apoptosis in
colon epithelial cell: a possible role in ulcerative colitis. Gastroenterology, 1997;113:160-167
, 百拇医药
3 Iwamoto M, Koji T, Makiyama K, Kobayashi N, Nakane PK. Apoptosis of crypt epithelial cells in ulcerative colitis.
J Pathol, 1996;180:152-159
4 Kraus MD, Shahsafaei A, Antin J, Odze RD. Relationship of Bcl-2 expression with apoptosis and proliferation in colonic graft versus
host disease. Hum Pathol, 1998;29:869-875
5 全国慢性非感染性肠道疾病学术研讨会. 溃疡性结肠炎诊断及疗效标准. 中华消化杂志，1993；13：354-356
, 百拇医药
6 Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wild ranging implications in tissue kinetics.
Br J Cancer, 1972;26:239-245
7 江学良，权启镇，孙自勤，王要军，齐风，王东，张修礼. 溃疡性结肠炎患者淋巴细胞凋亡调控蛋白的表达.
世界华人消化杂志，1999；7：904
8 Nagata S, Golstein P. The Fas death factor. Science, 1995;267:1449-1456
9 Smith CA, Farrah T, Goodwin RG. The TNF receptor superfamily of cellular and viral protein: activation and death.
, 百拇医药
Cell, 1994;76:956-959
10 Tsujimoto T, Finger LR, Yunis J. Cloning the chromosome break-point of neoplstic B cells with the t (14;18)
chromosome translocation. Science, 1984;226:1097-1099
11 Talal N. Clncludin remarks: autogenes and oncogenes. Clin Immunol Imuunopathol, 1994;72:208-209
12 Sakai T, Kimura Y, Ohara KI, Kusugami K, Lynch DH, Yoshikai Y. Fas-mediated cytotoxity by intestinal intraepithelial lymphocyte
during acute graft-versus-host desease in mice. Gastroenterology, 1997;113:167-174, http://www.100md.com(江学良 权启镇 陈桂荣 孙自勤 王要军 王玉萍)
项目负责人 江学良中国人民解放军济南军区总医院消化科 山东省济南市 250031
Tel. +86-531-2600132
Email.xiaohuak@jn-pulic.sd.cninfo.net
收稿日期 1999-11-16 接收日期 1999-12-25
Subject headings apoptosis; colitis, ulcerative/pathology; biopsy
, 百拇医药
主题词 细胞凋亡；结肠炎，溃疡性/病理学；活组织检查
溃疡性结肠炎(UC)的病因和发病机制还不清楚，但由于该病在组织学上主要表现为结肠粘膜损伤，这是否由于结肠粘膜上皮细胞凋亡异常而引起粘膜损伤、溃疡[1-4]为阐明这一问题，我们应用免疫荧光标记和流式细胞技术动态检测了活动期和缓解期UC活检组织中与凋亡有关的3个关键性调控蛋白CD95(Apo-1/Fas)，Apo-2.7，Bcl-2表达，旨在从凋亡的角度探讨UC的发病机制.
1 材料和方法
1.1 材料 UC患者20例，男8例，女12例，平均年龄30.8岁， 均符合1993年太原全国慢性非感染性肠道疾病学术研讨会制订的溃疡性结肠炎诊断标准[5]. 所有患者均于活动期和缓解期各取活检组织1次. 正常人对照组20例，男8例，女12例，平均年龄30.6岁，均为健康查体者.
, 百拇医药
1.2 方法 ①试剂来源：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的单克隆抗体鼠抗人Apo-1-FITC，Bcl-2-FITC，阴性对照IgG1-FITC及藻红蛋白(PE)标记的Apo-2.7mAb(Apo-2.7-PE)均由法国国际免疫公司生产；淋巴细胞分离液由中国医学科学院血液研究所生产. ②样品处理：UC患者肠镜检查时用活检钳取结肠溃疡边缘新鲜组织0.2g～1.0g，正常人在乙状结肠处取新鲜组织0.2g～1.0g，置于重叠的100目铜网及260目尼龙网上，用眼科剪剪成1.0mm×1.0mm×1.0mm碎块，然后用眼科剪轻搓，边搓 边用磷酸缓冲液(PBS)冲洗入小烧瓶中，直至组织搓净. 1500r/min离心5min，再用PBS洗2次，1000r/min，离心2min，弃上清后备用. ③免疫反应：反应前调整细胞数至109/mL，分取100μL放入5支试管，1号，2号管用700mL/L乙醇固定过夜，次晨用生理盐水漂洗2遍，1500r/min 离心5min，分别加入20μL Apo-2.7-PE和Ig-PE，3号，4号，5号管分别加20μL IgG-FITC，Fas-FITC和Bcl-2-FITC，室温避光反应30min，上机. ④流式细胞检测：流式细胞仪为FACScan型，美国Becton Dickinson生产. 上机前先以标准荧光微球调整仪器变异系数在2.0%以内，上机后收集10000个细胞，荧光强度以对数放大，测定光散射数据，结果采用Macintosh 650型计算机及Cell Quest Plot软件进行数据分析点图及组方图，以Fas,Bcl-2及Apo-2.7阳性细胞(细胞膜含Fas,Bcl-2及Apo-2.7的细胞)的百分数表示.
, 百拇医药
统计学处理 各组参数的比较采用计量资料的t检验，各组参数的相关性采用直线相关分析.
2 结果
2.1 UC患者活检组织中Apo-1，Apo-2.7，Bcl-2的表达 表1.
表1 UC患者活检组织中Apo-1，Apo-2.7，Bcl-2的表达(X±s,%)
| 组别 | n | Apo-1 | Apo-2.7 | Bcl-2 |
| 正常人 | 20 | 6.0±2.1 | 2.9±0.8 | 5.2±2.0 |
| UC患者 | ||||
| 活动期 | 20 | 14.6±3.2b | 13.2±3.1b | 9.8±2.7b |
| 缓解期 | 20 | 9.8±2.6ac | 6.8±2.2ac | 7.1±2.1ac |
, 百拇医药
aP<0.05， bP<0.01，vs 正常人；cP<0.05，vs 缓解期.
从表1中可以看出，活动期UC患者结肠粘膜上皮细胞凋亡(Apo-2.7)明显增多，与正常人相比P<0.01；凋亡调控蛋白(Apo-1，Bcl-2)表达显著增加. 经治疗后，随着病情由活动期转变为缓解期，上述指标均明显下降(P<0.05)，但仍显著高于正常人(P<0.05).
2.2 经直线相关分析表明，Apo-2.7与Apo-1成正相关(r=0.513，P<0.05)，Bcl-2与Apo-2.7无显著相关(r=0.322，P>0.05).
3 讨论
细胞凋亡(apoptosis)最初是由英国学者Kerr et al提出的用以描述一种在形态学上有别于细胞坏死的死亡方式，从功能上定义又称细胞程序性死亡(programed cell death)，是细胞接受某种信号或受到某些刺激因素后一种主动的，由凋亡相关基因调控的细胞“自杀”过程[6]. Apo-2.7是Mr38000的线粒体膜蛋白，可作为细胞凋亡的早期，特异的标记，应用流式细胞仪检测此蛋白可定量反映淋巴细胞凋亡率[7]. 正常人结肠粘膜上皮细胞有低水平Apo-2.7表达，表明部分结肠粘膜细胞在机体的总调控下发生细胞凋亡，以去除衰老，异常细胞维持结肠粘膜正常的新陈代谢. 活动期UC患者Apo-2.7表达较正常人明显增加，表明结肠粘膜上皮细胞凋亡增多，由上皮细胞构成的粘膜屏障破坏，导致结肠粘膜的损伤，溃疡. 由于结肠细胞凋亡主要发生在粘膜上皮层，因此病变局限在粘膜层，这可以部分解释UC的发病机制. 经治疗后，随着病情由活动期转变为缓解期，Apo-2.7表达下调，结肠粘膜上皮细胞凋亡减少，粘膜屏障逐渐修复，溃疡逐渐愈合，因此，Apo-2.7检测还可作为判断病情活动的指标.
, 百拇医药
Apo-1又称Fas，现命名为CD95分子，属TNFR和神经生长因子受体家族的成员之一，它是由Fas基因编码的具有诱导细胞凋亡能力的细胞表面Ⅰ型膜蛋白[8，9]. Fas与Fas配体(Fas-L)组蒄as系统，诱导细胞凋亡. 本研究中活动期UC患者Apo-1表达较正常人有显著增高，且相关分析表明Apo-1与Apo-2.7表达呈正相关，提示结肠粘膜上皮细胞凋亡增多与诱导凋亡基因Apo-1高表达有关，即Apo-1表达上调诱导结肠上皮细胞过度凋亡. 而缓解期UC患者Apo-1虽较活动期明显下降，但仍显著高于正常人，是否与疾病复发或预后有关尚需进一步探讨.
Bcl-2基因是人们在研究B细胞淋巴瘤中发现的一种异常表达的原癌基因，位于第18号染色体短臂(18q21.3)[10]. 近年发现，Bcl-2为一种细胞凋亡抑制基因[11]. 正常人结肠粘膜上皮细胞有低水平的Bcl-2表达，保证上皮细胞增生和更新，以维持结肠粘膜屏障的动态平衡. 本研究中，活动期UC患者Bcl-2表达明显增多，但相关分析表明Bcl-2和细胞凋亡的标志物Apo-2.7表达无显著相关(P>0.05)，提示Bcl-2表达上调是对结肠粘膜上皮细胞损伤的一种反应性增生，可能与隐窝上皮细胞再生修复有关[4]. 因此，结肠粘膜活检组织中凋亡调控蛋白Apo-1,Apo-2，Bcl-2异常表达在UC的发病机制中具有重要作用[12].
, 百拇医药
4 参考文献
1 Ueyama H, Kiyohara T, Sawada N, Isozaki K, Kitamuar S, Miyagawa J. High Fas ligand expression on lympocytes in lessions of
ulcerative colitis. Gut, 1998;43:48-55
2 Strater J, Wellish I, Riedl S, Walczak H, Koretz K, Tandara A, Krammer PH, Moller P. CD95 (Apo-1/Fas) mediated apoptosis in
colon epithelial cell: a possible role in ulcerative colitis. Gastroenterology, 1997;113:160-167
, 百拇医药
3 Iwamoto M, Koji T, Makiyama K, Kobayashi N, Nakane PK. Apoptosis of crypt epithelial cells in ulcerative colitis.
J Pathol, 1996;180:152-159
4 Kraus MD, Shahsafaei A, Antin J, Odze RD. Relationship of Bcl-2 expression with apoptosis and proliferation in colonic graft versus
host disease. Hum Pathol, 1998;29:869-875
5 全国慢性非感染性肠道疾病学术研讨会. 溃疡性结肠炎诊断及疗效标准. 中华消化杂志，1993；13：354-356
, 百拇医药
6 Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wild ranging implications in tissue kinetics.
Br J Cancer, 1972;26:239-245
7 江学良，权启镇，孙自勤，王要军，齐风，王东，张修礼. 溃疡性结肠炎患者淋巴细胞凋亡调控蛋白的表达.
世界华人消化杂志，1999；7：904
8 Nagata S, Golstein P. The Fas death factor. Science, 1995;267:1449-1456
9 Smith CA, Farrah T, Goodwin RG. The TNF receptor superfamily of cellular and viral protein: activation and death.
, 百拇医药
Cell, 1994;76:956-959
10 Tsujimoto T, Finger LR, Yunis J. Cloning the chromosome break-point of neoplstic B cells with the t (14;18)
chromosome translocation. Science, 1984;226:1097-1099
11 Talal N. Clncludin remarks: autogenes and oncogenes. Clin Immunol Imuunopathol, 1994;72:208-209
12 Sakai T, Kimura Y, Ohara KI, Kusugami K, Lynch DH, Yoshikai Y. Fas-mediated cytotoxity by intestinal intraepithelial lymphocyte
during acute graft-versus-host desease in mice. Gastroenterology, 1997;113:167-174, http://www.100md.com(江学良 权启镇 陈桂荣 孙自勤 王要军 王玉萍)