大鼠血透明质酸检测原位肝移植模型急性排斥反应
1中国人民解放军309医院肝胆外科 北京市 100091
2中国人民解放军301医院肝胆外科 北京市 100853
项目负责人 杜国盛,100091,北京市海淀区黑山沪甲17号.
Tel. +86-10-66775057
Email. duguosh@public2.east.net.cn
收稿日期 1999-08-10 接收日期 1999-11-14
Subject headings liver transplantation; hyaluronic acid/blood; disease model, animal; graft rejection
, http://www.100md.com
主题词 肝移植；透明质酸/血液；疾病模型，动物；移植物排斥
透明质酸是一种大分子线性多聚糖，血中透明质酸水平能够较准确反应肝内皮细胞的功能状态，进而反应肝损害程度. 在肝移植术后，由于肝内皮细胞是主要组织相容性抗原的主要表达细胞，这些抗原在肝细胞几乎不能表达，肝内皮细胞是免疫排斥反应的首要靶细胞测定血中透明质酸水平可较早反应移植肝的功能状态，便于临床观察肝移植术后排斥反应水平.
1 材料和方法
1.1 材料 用♂ SD封闭群大鼠(购自301医院医学实验动物中心)进行预实验，通过对Miyata法的改进，熟练掌握三袖套法原位肝移植的手术技术，达到1wk存活率>90%后开始正式实验. 正式实验受体用♂ SD大鼠，供体为♂ Wistar大鼠，将其随机分到下列4组中. A组：正常对照组，SD，不施行肝移植术. B组：同基因大鼠原位肝移植，(SD-SD). C组：异基因大鼠原位肝移植(Wistar-SD). D组：异基因大鼠原位肝移植+环孢酶素A(CsA)术后1d开始im 15mg/d. 术后3，6d眼球采血或尾静脉采血1mL d9心脏采血，每次采血后由尾静脉输入生理盐水1mL采1mL血后0.5mL肝素抗凝，离心，300r/min，取上清血浆，无菌离心管分装并冻存于-25℃低温冰箱.
, 百拇医药
1.2 方法 测定HA 采用仪器为北京核仪器厂生产FT646型放免测量仪，试剂购于上海第二军医大学海军医学研究所生产的HA放射免疫分析测定盒(HA Kit). 取0.5mL全血留取血清标本. 测定原理系以HA结合蛋白与标准液或待测血清结合，加入125I标记的HA. 以抗HA结合蛋白为第1抗体，第2抗体为分离剂，通过测定HA结合蛋白间接测定HA的含量. 按试剂盒操作步骤表进行. 数据处理以HA标准浓度为横坐标，B/B0×100为纵坐标，用四参数法绘制标准曲线.
2 结果
所测定的HA、转氨酶(ALT)、总胆红素(Bil)正常值；术后3d,6d和9d的HA，ALT，Bil比较详见表1.
表1 Wistar-SD术后HA，ALT，Bil动态变化(X±s，n=6)
, 百拇医药
bP<0.01，vs B组.
3 讨论
进入血液循环的HA主要通过受体介导的吞噬方式由肝内皮细胞摄取，最后由溶酶体降解[1，2]. 首先HA降解为D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺，然后在内皮细胞浆中进一步降解为CO2 NH3，乙酸和乳酸再由肝内皮细胞释出[3]，由肝细胞最终分解为CO2，H2O，尿素. 全部过程大约需要30min～40min血清HA水平主要受合成和清除两方面影响，合成增多多见于一些免疫疾病，如类风湿等[4，5]. 清除能力下降多见肝疾病. 如肝硬变、慢性肝炎及缺血再灌注损伤等[6]. 这是因为肝内皮细胞受损缘故. 因此在排除HA增多因素后，血清HA的水平主要取决于肝内皮细胞的数量和功能[7].
, 百拇医药
肝移植术后的排斥反应是受体针对不同的MHC抗原而继发的一系列免疫作用. Lantenschtarger et al[8]对人和鼠肝不同细胞表达MHC抗原的实验研究证实：肝内皮细胞是表达MHC的主要载体，而肝细胞上的MHC抗原很弱. Snover et al[9]发现：人类肝移植首先发现的病理变化是肝内皮细胞炎性反应，其后才继发一系列病变：如肝细胞坏死等. Porter et al[10]在大鼠肝移植排斥反应的病理分析中，证实单核细胞首先浸润门静脉及窦内皮细胞表面，然后造成门脉水肿及肝细胞浸润. Adama et al[11]认为，肝内皮细胞是异基因排斥反应攻击的靶细胞. 因此，在排斥反应中了解内皮细胞功能可间接反映免疫排斥反应的程度. 由于肝内皮细胞是免疫排斥反应攻击的靶细胞，连续检测肝移植术后的血清HA水平将能有效地反映移植肝内皮细胞的功能. 从而可较早地了解肝移植术后排斥反应的发生及发生的强度.
, 百拇医药
本组实验结果表明肝移植术后B，C，D组血清HA的水平与正常组比较均明显升高，(P<0.01). 其损害机制一方面为缺血再灌注损伤其中包括释放大量的氧自由基直接损害肝内皮细胞[12]. 另外在供肝冷保存液中因缺氧等原因也可造成对肝内皮细胞的损害[13]. 另一方面排斥反应可直接造成内皮细胞的损害. 故本组实验中排斥反应组(C组)术后6d周围血清中HA的水平明显高于B组和D组，而肝移植手术组HA的水平均明显高于正常对照组，统计学上差异有显著意义. 从以上实验结果分析可见单纯的缺血再灌注损伤不会造成C组与B，D组之间的差异，其原因是由于排斥反应的发生，从而可证实肝内皮细胞是排斥反应攻击的靶细胞，血清HA水平在排斥反应中可间接了解排斥反应发生的情况. 本组实验病理上光镜及电镜证实C组具有明确的排斥反应发生而B组及D组排斥反应较轻. HA同时与ALT 、Bilirubin比较，后者主要反映肝细胞功能，直到术后9d两组间才具有统计学上的差异，而血清HA术后6d出现统计学差别，从而从侧面也支持了排斥反应首先攻击内皮细胞的观点. 因而，在一定条件下，连续测定肝移植术后的HA水平将有助于排斥反应的早期诊断.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Tengblad A, Aanrent UBG, Lilia K. Concentration and relative molecular mass of hyaluronate on lumph and blood.
Biochem J, 1986;236:521
2 Fraser JRE, Kimpton WG, Lanrent TC. Uptake and degradation of hyalurona on lymphatic tissue. Biochem J, 1988;256:153
3 Smedsrod H. Cellular events in the uptake and degradation of hyalurona. Adv Drug Delivery Rev, 1991;7:265-269
, http://www.100md.com
4 Smedsro H, Pertoft H, Eriksson S. Studies in vitro on the uptake and degradation of sodium hyaluronate in rat liver
endothelial cell. Biochem J, 1984;223:617-621
5 Paimela L, Heiskanen A, Karki P, Murphy WJ. Serum hyaluronate levels as a predictor of radiologic progression in early
rheumatoid arthritis. Arth Rheum, 1991;34:815-817
6 Lundin A, Laurent A, Devlin J. Circulating hyaluronate in psoriasis. Br J Dermatol, 1985;59:589-592
, 百拇医药
7 张鲁榕. 一种新的血清透明质酸放免测定法. 第二军医大学学报，1990；11：497
8 Lantenschtarger L, Hayry P. Expression of the major histocompatibility complex angigens on different liver cellular components in
rat and man. Scand J Immunol, 1981;14:421-424
9 Snover DC, Sibley RK, Freese DK, Kuo PC, Smith J. Orthotopic liver transplantation: a pathological study of 63 serial liver biopsies
, http://www.100md.com
from 11 patients with special reference to the diagnostic features and natural history of rejection.
Transplantation, 1989;3:134-138
10 Porter KA. Pathology of liver transplantation. Transplantation, 1969;2:129-133
11 Adama DH, Wann L, Hubscher SG. Hepatic endothelial cells: targers in liver allograft rejection. Transplantation,
1989;47:479-481
, 百拇医药
12 Kobayashi H, Nonami T, Kishikawa K. Mechanism and prevention of ischemia reperfusion induced liver injury in rats.
Surg Res, 1991;51:240-243
13 Hiroaki S, He W, Gao P. Evaluation of preservation damage to liver endothelial cells by hyaluronic acid uptake
in vitro. Transplantation, 1994;58:635-639, http://www.100md.com(杜国盛1 黄志强2 萧荫祺1 许红兵1 段伟东2 黄 洁2 王燕生2)
2中国人民解放军301医院肝胆外科 北京市 100853
项目负责人 杜国盛,100091,北京市海淀区黑山沪甲17号.
Tel. +86-10-66775057
Email. duguosh@public2.east.net.cn
收稿日期 1999-08-10 接收日期 1999-11-14
Subject headings liver transplantation; hyaluronic acid/blood; disease model, animal; graft rejection
, http://www.100md.com
主题词 肝移植；透明质酸/血液；疾病模型，动物；移植物排斥
透明质酸是一种大分子线性多聚糖，血中透明质酸水平能够较准确反应肝内皮细胞的功能状态，进而反应肝损害程度. 在肝移植术后，由于肝内皮细胞是主要组织相容性抗原的主要表达细胞，这些抗原在肝细胞几乎不能表达，肝内皮细胞是免疫排斥反应的首要靶细胞测定血中透明质酸水平可较早反应移植肝的功能状态，便于临床观察肝移植术后排斥反应水平.
1 材料和方法
1.1 材料 用♂ SD封闭群大鼠(购自301医院医学实验动物中心)进行预实验，通过对Miyata法的改进，熟练掌握三袖套法原位肝移植的手术技术，达到1wk存活率>90%后开始正式实验. 正式实验受体用♂ SD大鼠，供体为♂ Wistar大鼠，将其随机分到下列4组中. A组：正常对照组，SD，不施行肝移植术. B组：同基因大鼠原位肝移植，(SD-SD). C组：异基因大鼠原位肝移植(Wistar-SD). D组：异基因大鼠原位肝移植+环孢酶素A(CsA)术后1d开始im 15mg/d. 术后3，6d眼球采血或尾静脉采血1mL d9心脏采血，每次采血后由尾静脉输入生理盐水1mL采1mL血后0.5mL肝素抗凝，离心，300r/min，取上清血浆，无菌离心管分装并冻存于-25℃低温冰箱.
, 百拇医药
1.2 方法 测定HA 采用仪器为北京核仪器厂生产FT646型放免测量仪，试剂购于上海第二军医大学海军医学研究所生产的HA放射免疫分析测定盒(HA Kit). 取0.5mL全血留取血清标本. 测定原理系以HA结合蛋白与标准液或待测血清结合，加入125I标记的HA. 以抗HA结合蛋白为第1抗体，第2抗体为分离剂，通过测定HA结合蛋白间接测定HA的含量. 按试剂盒操作步骤表进行. 数据处理以HA标准浓度为横坐标，B/B0×100为纵坐标，用四参数法绘制标准曲线.
2 结果
所测定的HA、转氨酶(ALT)、总胆红素(Bil)正常值；术后3d,6d和9d的HA，ALT，Bil比较详见表1.
表1 Wistar-SD术后HA，ALT，Bil动态变化(X±s，n=6)
| t/d | 组别 | HA(ng/L) | ALT(μ/L) | Bil(μmol/L) |
| 正常组 | 55±27 | 57±25 | 17±5 | |
| B | 542±53 | 500±89 | 29±4 | |
| 3 | C | 554±82 | 533±81 | 33±3 |
| D | 550±48 | 495±90 | 30±3 | |
| B | 597±39 | 168±17 | 38±5 | |
| 6 | C | 757±55b | 186±15 | 42±6 |
| D | 576±40 | 150±20 | 32±8 | |
| B | 663±100 | 127±17 | 34±5 | |
| 9 | C | >800b | 202±23b | 52±9b |
| D | 643±97 | 130±15 | 50±11 |
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bP<0.01，vs B组.
3 讨论
进入血液循环的HA主要通过受体介导的吞噬方式由肝内皮细胞摄取，最后由溶酶体降解[1，2]. 首先HA降解为D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺，然后在内皮细胞浆中进一步降解为CO2 NH3，乙酸和乳酸再由肝内皮细胞释出[3]，由肝细胞最终分解为CO2，H2O，尿素. 全部过程大约需要30min～40min血清HA水平主要受合成和清除两方面影响，合成增多多见于一些免疫疾病，如类风湿等[4，5]. 清除能力下降多见肝疾病. 如肝硬变、慢性肝炎及缺血再灌注损伤等[6]. 这是因为肝内皮细胞受损缘故. 因此在排除HA增多因素后，血清HA的水平主要取决于肝内皮细胞的数量和功能[7].
, 百拇医药
肝移植术后的排斥反应是受体针对不同的MHC抗原而继发的一系列免疫作用. Lantenschtarger et al[8]对人和鼠肝不同细胞表达MHC抗原的实验研究证实：肝内皮细胞是表达MHC的主要载体，而肝细胞上的MHC抗原很弱. Snover et al[9]发现：人类肝移植首先发现的病理变化是肝内皮细胞炎性反应，其后才继发一系列病变：如肝细胞坏死等. Porter et al[10]在大鼠肝移植排斥反应的病理分析中，证实单核细胞首先浸润门静脉及窦内皮细胞表面，然后造成门脉水肿及肝细胞浸润. Adama et al[11]认为，肝内皮细胞是异基因排斥反应攻击的靶细胞. 因此，在排斥反应中了解内皮细胞功能可间接反映免疫排斥反应的程度. 由于肝内皮细胞是免疫排斥反应攻击的靶细胞，连续检测肝移植术后的血清HA水平将能有效地反映移植肝内皮细胞的功能. 从而可较早地了解肝移植术后排斥反应的发生及发生的强度.
, 百拇医药
本组实验结果表明肝移植术后B，C，D组血清HA的水平与正常组比较均明显升高，(P<0.01). 其损害机制一方面为缺血再灌注损伤其中包括释放大量的氧自由基直接损害肝内皮细胞[12]. 另外在供肝冷保存液中因缺氧等原因也可造成对肝内皮细胞的损害[13]. 另一方面排斥反应可直接造成内皮细胞的损害. 故本组实验中排斥反应组(C组)术后6d周围血清中HA的水平明显高于B组和D组，而肝移植手术组HA的水平均明显高于正常对照组，统计学上差异有显著意义. 从以上实验结果分析可见单纯的缺血再灌注损伤不会造成C组与B，D组之间的差异，其原因是由于排斥反应的发生，从而可证实肝内皮细胞是排斥反应攻击的靶细胞，血清HA水平在排斥反应中可间接了解排斥反应发生的情况. 本组实验病理上光镜及电镜证实C组具有明确的排斥反应发生而B组及D组排斥反应较轻. HA同时与ALT 、Bilirubin比较，后者主要反映肝细胞功能，直到术后9d两组间才具有统计学上的差异，而血清HA术后6d出现统计学差别，从而从侧面也支持了排斥反应首先攻击内皮细胞的观点. 因而，在一定条件下，连续测定肝移植术后的HA水平将有助于排斥反应的早期诊断.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Tengblad A, Aanrent UBG, Lilia K. Concentration and relative molecular mass of hyaluronate on lumph and blood.
Biochem J, 1986;236:521
2 Fraser JRE, Kimpton WG, Lanrent TC. Uptake and degradation of hyalurona on lymphatic tissue. Biochem J, 1988;256:153
3 Smedsrod H. Cellular events in the uptake and degradation of hyalurona. Adv Drug Delivery Rev, 1991;7:265-269
, http://www.100md.com
4 Smedsro H, Pertoft H, Eriksson S. Studies in vitro on the uptake and degradation of sodium hyaluronate in rat liver
endothelial cell. Biochem J, 1984;223:617-621
5 Paimela L, Heiskanen A, Karki P, Murphy WJ. Serum hyaluronate levels as a predictor of radiologic progression in early
rheumatoid arthritis. Arth Rheum, 1991;34:815-817
6 Lundin A, Laurent A, Devlin J. Circulating hyaluronate in psoriasis. Br J Dermatol, 1985;59:589-592
, 百拇医药
7 张鲁榕. 一种新的血清透明质酸放免测定法. 第二军医大学学报，1990；11：497
8 Lantenschtarger L, Hayry P. Expression of the major histocompatibility complex angigens on different liver cellular components in
rat and man. Scand J Immunol, 1981;14:421-424
9 Snover DC, Sibley RK, Freese DK, Kuo PC, Smith J. Orthotopic liver transplantation: a pathological study of 63 serial liver biopsies
, http://www.100md.com
from 11 patients with special reference to the diagnostic features and natural history of rejection.
Transplantation, 1989;3:134-138
10 Porter KA. Pathology of liver transplantation. Transplantation, 1969;2:129-133
11 Adama DH, Wann L, Hubscher SG. Hepatic endothelial cells: targers in liver allograft rejection. Transplantation,
1989;47:479-481
, 百拇医药
12 Kobayashi H, Nonami T, Kishikawa K. Mechanism and prevention of ischemia reperfusion induced liver injury in rats.
Surg Res, 1991;51:240-243
13 Hiroaki S, He W, Gao P. Evaluation of preservation damage to liver endothelial cells by hyaluronic acid uptake
in vitro. Transplantation, 1994;58:635-639, http://www.100md.com(杜国盛1 黄志强2 萧荫祺1 许红兵1 段伟东2 黄 洁2 王燕生2)