外周血淋巴细胞凋亡在慢性乙型肝炎发病机制中的作用
中国人民解放军第一军医大学南方医院感染内科 广东省广州市 510515
项目负责人 邢同京中国人民解放军第一军医大学南方医院感染内科 广东省广州市 510515
收稿日期 1999-08-10 接收日期 1999-12-02
Subject headings hepatitis B; apoptosis; flow cytometer; lymphocytes
主题词 肝炎，乙型；细胞凋亡；流式细胞术；淋巴细胞
目前认为，活化诱导的淋巴细胞凋亡在许多疾病的发病机制中起重要作用，但其在慢性乙型肝炎中的作用研究较少. 为此，我们应用流式细胞仪，对乙型肝炎患者外周血淋巴细胞的凋亡进行检测，并结合临床资料进行分析，探讨其在慢性乙型肝炎发病机制中的作用.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 我院1998年住院的乙型肝炎患者43例，男32例，女11例，年龄17岁～61岁，平均33岁±8岁. 诊断按1995年全国病毒性肝炎会议标准. 24例行肝穿组织活检术，肝组织炎症活动分级按Scheuer标准[1]. 正常对照15例取自献血员. Annexin V试剂盒购自BioDirectory公司. HBV DNA定量检测采用斑点杂交法，试剂盒购自上海预防医学研究所，灵敏度1ng/L. 乙肝标志物采用中山生物工程公司ELISA试剂盒检测. 均按说明书操作.
1.2 方法 无菌采集乙型肝炎患者空腹静脉血3mL，肝素抗凝，常规分离淋巴细胞，用含150mL/L胎牛血清的RMPI 1640培养基稀释至1×109个细胞/L，加入24孔细胞培养板，每份标本分为两组：一组加入植物血凝素(PHA)100μg刺激，一组不加. 37℃，50mL/L CO2培养箱温育4h，弃上清，预冷PBS洗2遍，加入Annexin V和PI混合液100μL染10min，上机检测，计数10000个细胞，FACS软件分析. 结果判断：与标记FITC的Annexin V结合的细胞为早期凋亡细胞，与PI结合的细胞为死亡细胞. 同法检测正常对照组的淋巴细胞凋亡.
, 百拇医药
统计学处理 采用t检验及等级相关分析.
2 结果
乙型肝炎患者共43例，急性肝炎9例，慢性肝炎26例，慢性重型肝炎8例. 各型乙型肝炎患者外周血淋巴细胞的凋亡情况见表1，结果表明：乙型肝炎患者与正常对照组自发的淋巴细胞凋亡都很低，两组比较差异无显著性. 但与正常对照组比较，活化诱导的淋巴细胞凋亡在慢性乙型肝炎患者明显升高，而在重型肝炎则降低，差异有显著性，在急性肝炎中则没有差异. 慢性乙肝患者24例肝内炎症按Scheuer分级：G1 5例，G2 8例，G3 7例，G4 4例，肝内炎症程度分级与淋巴细胞凋亡无明显相关性(表2). 乙型肝炎患者血清中的HBV DNA水平与外周血淋巴细胞凋亡呈正相关(表3).
表1 乙型肝炎患者外周血淋巴细胞的凋亡(x±s，%)
, 百拇医药
aP<0.05，t=2.69，bP<0.01，t=3.27，vs对照组.
图1A 正常对照(未加PHA)
图1B 正常对照(加PHA)
图1C 乙型肝炎患者(未加PHA)
图1D 乙型肝炎患者(加PHA)
表2 慢性乙型肝炎肝内炎症与淋巴细胞凋亡的关系(x±s，%)
, 百拇医药
a P>0.05，rs=-0.27
表3 乙型肝炎患者外周血淋巴细胞凋亡与HBV DNA定量的关系(x±s，%)
, http://www.100md.com
aP<0.05，rs=0.73，vs加PHA组.
3 讨论
活化诱导的淋巴细胞凋亡与免疫功能的负调节有密切关系，活化的淋巴细胞能否及时的清除对于调节机体免疫应答的程度起重要作用[2]. 近年来研究表明，活化诱导的淋巴细胞凋亡在许多疾病发病机制中占有重要地位，但其在慢性乙型肝炎发病机制中的作用报道甚少[3]. APOPTEST是新近发展的应用流式细胞仪检测早期凋亡的技术，比DNA检测法敏感性更高[4]. 结果提示在慢性乙型肝炎的淋巴细胞凋亡增强，在一定程度上减弱了机体特异性的免疫反应，可能与乙肝病毒持续感染有关；而在重型肝炎中表现为凋亡不足，使抗原诱发的免疫反应持续增强，造成大量的肝细胞损伤. 产生这种现象的原因尚不清楚，推测可能与活化的淋巴细胞表达Fas和FasL的程度不同有关[5].
, 百拇医药
慢性乙型肝炎患者肝内炎症活动主要与乙肝病毒复制激发的免疫反应有关. Nakamura et al[6]研究发现：在慢性乙型肝炎患者中，活化诱导的淋巴细胞凋亡比例在炎症恢复期明显高于炎症活动期，导致在炎症恢复期大量抗原特异的T细胞被清除，由此削弱了对HBV感染肝细胞的细胞毒性作用，防止发生过度的免疫病理损害，有利于机体功能的恢复. 我们的结果提示活化诱导的外周血淋巴细胞凋亡可能与肝内炎症活动程度无关.
已经证实，乙肝病毒是一种泛嗜性病毒，可以侵犯淋巴细胞，并可能与乙肝的慢性化有关. 另一方面，亦可能影响被感染淋巴细胞的生物学特性. 从表3结果来看：乙肝外周血淋巴细胞的凋亡比例与血清HBV DNA含量呈正相关. 这可能与乙肝病毒在外周血淋巴细胞的感染水平不同有关，有待于进一步深入研究.
4 参考文献
, 百拇医药
1 Scheuer PJ. Taxonomy of chronic hepatitis. In 4th biennial scientific meeting asia pacific association for the study of the liver.
1994-01-26/29:403
2 Kabelitz D, Pohl T, Pechhold K. Activation-induced cell death of mature peripheral T lymphocytes.
Immunol Today, 1993;14:338-339
3 Green DR, Scott DW. Activation-induced apoptosis in lymphocyte. Curr Opin Immunol, 1994;6:476-479
, 百拇医药
4 Vermes IC, Haanen H, Steffens N. A novel assay for apoptosis, flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on
early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J Immunol Meth, 1995;184:39-51
5 Lynch DH, Ranmsdell F, Aldelson MR. Fas and FasL in the homeostatic regulation of immune responses.
Immunol Today, 1995;16:569-577
6 Nakamura K, Yuh K, Sugyo S, Shuo H, Kimura N, Okumura M. Apoptosis observed in peripheral T lymphocytes from patients
with chronic hepatitis B. Gastroenterology, 1996;111:156-164, http://www.100md.com(邢同京 章 廉 骆抗先 侯金林 冯筱榕 何海棠)
项目负责人 邢同京中国人民解放军第一军医大学南方医院感染内科 广东省广州市 510515
收稿日期 1999-08-10 接收日期 1999-12-02
Subject headings hepatitis B; apoptosis; flow cytometer; lymphocytes
主题词 肝炎，乙型；细胞凋亡；流式细胞术；淋巴细胞
目前认为，活化诱导的淋巴细胞凋亡在许多疾病的发病机制中起重要作用，但其在慢性乙型肝炎中的作用研究较少. 为此，我们应用流式细胞仪，对乙型肝炎患者外周血淋巴细胞的凋亡进行检测，并结合临床资料进行分析，探讨其在慢性乙型肝炎发病机制中的作用.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 我院1998年住院的乙型肝炎患者43例，男32例，女11例，年龄17岁～61岁，平均33岁±8岁. 诊断按1995年全国病毒性肝炎会议标准. 24例行肝穿组织活检术，肝组织炎症活动分级按Scheuer标准[1]. 正常对照15例取自献血员. Annexin V试剂盒购自BioDirectory公司. HBV DNA定量检测采用斑点杂交法，试剂盒购自上海预防医学研究所，灵敏度1ng/L. 乙肝标志物采用中山生物工程公司ELISA试剂盒检测. 均按说明书操作.
1.2 方法 无菌采集乙型肝炎患者空腹静脉血3mL，肝素抗凝，常规分离淋巴细胞，用含150mL/L胎牛血清的RMPI 1640培养基稀释至1×109个细胞/L，加入24孔细胞培养板，每份标本分为两组：一组加入植物血凝素(PHA)100μg刺激，一组不加. 37℃，50mL/L CO2培养箱温育4h，弃上清，预冷PBS洗2遍，加入Annexin V和PI混合液100μL染10min，上机检测，计数10000个细胞，FACS软件分析. 结果判断：与标记FITC的Annexin V结合的细胞为早期凋亡细胞，与PI结合的细胞为死亡细胞. 同法检测正常对照组的淋巴细胞凋亡.
, 百拇医药
统计学处理 采用t检验及等级相关分析.
2 结果
乙型肝炎患者共43例，急性肝炎9例，慢性肝炎26例，慢性重型肝炎8例. 各型乙型肝炎患者外周血淋巴细胞的凋亡情况见表1，结果表明：乙型肝炎患者与正常对照组自发的淋巴细胞凋亡都很低，两组比较差异无显著性. 但与正常对照组比较，活化诱导的淋巴细胞凋亡在慢性乙型肝炎患者明显升高，而在重型肝炎则降低，差异有显著性，在急性肝炎中则没有差异. 慢性乙肝患者24例肝内炎症按Scheuer分级：G1 5例，G2 8例，G3 7例，G4 4例，肝内炎症程度分级与淋巴细胞凋亡无明显相关性(表2). 乙型肝炎患者血清中的HBV DNA水平与外周血淋巴细胞凋亡呈正相关(表3).
表1 乙型肝炎患者外周血淋巴细胞的凋亡(x±s，%)
| 分期 | n | 加PHA组 | 未加PHA组 |
| 急性肝炎 | 9 | 31.2±7.6 | 4.6±1.5 |
| 慢性肝炎 | 26 | 41.9±9.7b | 5.3±2.1 |
| 重型肝炎 | 8 | 21.7±6.3a | 3.4±0.8 |
| 对照组 | 15 | 29.8±7.8 | 3.8±0.7 |
, 百拇医药
aP<0.05，t=2.69，bP<0.01，t=3.27，vs对照组.
图1A 正常对照(未加PHA)
图1B 正常对照(加PHA)
图1C 乙型肝炎患者(未加PHA)
图1D 乙型肝炎患者(加PHA)
表2 慢性乙型肝炎肝内炎症与淋巴细胞凋亡的关系(x±s，%)
| 分期 | n | 加PHA组a | 未加PHA组 |
| G1 | 5 | 32.1±8.4 | 5.2±2.1 |
| G2 | 8 | 43.2±12.7 | 4.7±1.9 |
| G3 | 7 | 36.7±9.3 | 5.5±2.4 |
| G4 | 4 | 30.4±6.29 | 3.7±1.3 |
, 百拇医药
a P>0.05，rs=-0.27
表3 乙型肝炎患者外周血淋巴细胞凋亡与HBV DNA定量的关系(x±s，%)
| P(HBV DNA)ng/L | n | 加PHA组 | 未加PHA组a |
| <50 | 9 | 28.4±6.7 | 4.5±1.4 |
| ～250 | 10 | 36.8±7.4 | 6.3±2.7 |
| ～500 | 13 | 34.5±6.5 | 4.1±1.8 |
| ～1000 | 6 | 43.2±11.3 | 3.7±1.2 |
| >1000 | 5 | 41.6±12.8 | 5.2±2.4 |
, http://www.100md.com
aP<0.05，rs=0.73，vs加PHA组.
3 讨论
活化诱导的淋巴细胞凋亡与免疫功能的负调节有密切关系，活化的淋巴细胞能否及时的清除对于调节机体免疫应答的程度起重要作用[2]. 近年来研究表明，活化诱导的淋巴细胞凋亡在许多疾病发病机制中占有重要地位，但其在慢性乙型肝炎发病机制中的作用报道甚少[3]. APOPTEST是新近发展的应用流式细胞仪检测早期凋亡的技术，比DNA检测法敏感性更高[4]. 结果提示在慢性乙型肝炎的淋巴细胞凋亡增强，在一定程度上减弱了机体特异性的免疫反应，可能与乙肝病毒持续感染有关；而在重型肝炎中表现为凋亡不足，使抗原诱发的免疫反应持续增强，造成大量的肝细胞损伤. 产生这种现象的原因尚不清楚，推测可能与活化的淋巴细胞表达Fas和FasL的程度不同有关[5].
, 百拇医药
慢性乙型肝炎患者肝内炎症活动主要与乙肝病毒复制激发的免疫反应有关. Nakamura et al[6]研究发现：在慢性乙型肝炎患者中，活化诱导的淋巴细胞凋亡比例在炎症恢复期明显高于炎症活动期，导致在炎症恢复期大量抗原特异的T细胞被清除，由此削弱了对HBV感染肝细胞的细胞毒性作用，防止发生过度的免疫病理损害，有利于机体功能的恢复. 我们的结果提示活化诱导的外周血淋巴细胞凋亡可能与肝内炎症活动程度无关.
已经证实，乙肝病毒是一种泛嗜性病毒，可以侵犯淋巴细胞，并可能与乙肝的慢性化有关. 另一方面，亦可能影响被感染淋巴细胞的生物学特性. 从表3结果来看：乙肝外周血淋巴细胞的凋亡比例与血清HBV DNA含量呈正相关. 这可能与乙肝病毒在外周血淋巴细胞的感染水平不同有关，有待于进一步深入研究.
4 参考文献
, 百拇医药
1 Scheuer PJ. Taxonomy of chronic hepatitis. In 4th biennial scientific meeting asia pacific association for the study of the liver.
1994-01-26/29:403
2 Kabelitz D, Pohl T, Pechhold K. Activation-induced cell death of mature peripheral T lymphocytes.
Immunol Today, 1993;14:338-339
3 Green DR, Scott DW. Activation-induced apoptosis in lymphocyte. Curr Opin Immunol, 1994;6:476-479
, 百拇医药
4 Vermes IC, Haanen H, Steffens N. A novel assay for apoptosis, flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on
early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J Immunol Meth, 1995;184:39-51
5 Lynch DH, Ranmsdell F, Aldelson MR. Fas and FasL in the homeostatic regulation of immune responses.
Immunol Today, 1995;16:569-577
6 Nakamura K, Yuh K, Sugyo S, Shuo H, Kimura N, Okumura M. Apoptosis observed in peripheral T lymphocytes from patients
with chronic hepatitis B. Gastroenterology, 1996;111:156-164, http://www.100md.com(邢同京 章 廉 骆抗先 侯金林 冯筱榕 何海棠)