胃癌组织中cyclin D1 P16和Rb蛋白表达的意义
长治医学院 1基础医学部组织学与胚胎学教研室2附属和平医院消化血液科 3基础医学部病理学教研室 山西省长治市 046000
项目负责人 魏铜有长治医学院基础医学部组织学与胚胎学教研室 山西省长治市 046000
收稿日期 1999-10-03 接收日期 1999-12-05
Subject headings stomach neoplasms; immunohistochemistry; cyclin D1 gene; p16 gene; Rb gene
主题词 胃肿瘤；免疫组织化学；cyclin D1基因；p16基因；Rb基因
, 百拇医药
正常细胞周期中，cyclin D1(细胞周期蛋白D1)与CDK4(细胞周期蛋白激酶)结合形成复合物促进细胞分裂增殖，P16和Rb抑制细胞分裂，从而保证机体细胞的正常生长. 当这一促增生系统成分过表达以及抑制增生系统成分缺失或失活都会导致细胞增殖失控而发生癌变. 研究表明许多肿瘤中均有cyclin D1的过度表达及P16 Rb基因的缺失[1-5]. 我们用免疫组化方法检测了30例胃癌标本中cyclin D1, P16和Rb蛋白的表达，并与手术切缘正常粘膜组织进行比较，旨在探讨三者的相关性及其在胃癌形成中的作用.
1 材料和方法
1.1 材料 本院病理科1995/1996手术切除的原发性胃癌标本30例，同时取其相应切缘正常胃粘膜组织经100mL/L福尔马林固定，常规石蜡包埋切片. 其中管状腺癌13例，乳头状腺癌3例，低分化腺癌9例，粘液腺癌3例，印戒细胞癌2例，均为进展期胃癌，已发生淋巴结转移者21例. 鼠抗cyclin D1, Rb1单克隆抗体及SP试剂盒为美国Zymed公司产品，兔抗P16多克隆抗体为Santa，Cruz公司产品，均购自北京中山生物技术有限公司.
, 百拇医药
1.2 方法 4μm厚连衅徽庞糜贖E染色，另三张用于免疫组化染色. 在加入一抗前将切片放入pH 6.0，0.01mol/L枸橼酸缓冲液内，于微波炉中高温辐射(95℃)10min，进行抗原修复，其他步骤与常规免疫组化染色相同. 抗体最佳稀释度：cyclin D1为1∶45，Rb为1∶20，p16为1∶40. 阳性对照用预实验中表达阳性的标本，空白对照用PBS代替一抗. 结果判断：根据阳性细胞所占面积分4个等级：“-”无明显阳性反应细胞；“+”阳性细胞面积<25%；“++”阳性细胞面积在25%～75%；“+++”阳性细胞面积在75%以上.
统计学处理 秩和检验.
2 结果
正常胃粘膜标本30例中25例表达P16蛋白，27例表达cyclin D1蛋白，全部表达Rb蛋白. 肿瘤组织30例中5例表达P16，20例表达Rb，且表达程度较正常胃粘膜减弱，28例表达cyclin D1，且表达程度较正常胃粘膜增强. 经统计学检验，正常与肿瘤组织3种蛋白表达程度有统计学差异(P<0.01或P<0.05，表1). 3种蛋白表达在胃癌各组织学类型及有无淋巴结转移中表达强度无统计学差异(P>0.05). 20例Rb阳性病例中，P16均呈阴性表达，而cyclin D1 19例呈阳性表达，1例呈阴性表达；10例Rb阴性病例中，P16呈阳性者5例，呈阴性者5例，cyclin D1呈阳性者9例，呈阴性者1例. 25例P16呈阴性者中，24例cyclin D1呈阳性；5例P16呈阳性者，4例cyclin D1也呈阳性表达. 经统计学分析，P16与Rb表达呈负相关关系(P<0.01，表2)，而P16,Rb与cyclin D1之间表达无负相关关系(P>0.05).
, 百拇医药
表1 胃癌生物学特征与cyclin D1 P16 Rb蛋白的表达
, 百拇医药
表2 胃癌组织Rb表达与P16和cyclin D1表达的关系
bP<0.01，vs Rb.
3 讨论
, 百拇医药 CDK4与cyclin D1结合并被激活形成CDK4-D1复合物，促使Rb蛋白的磷酸化作用，正调节细胞增殖周期. P16蛋白能与cyclin D1竞争性结合CDK4并使之灭活，阻止细胞周期从G1期向S期过渡，从而负调节细胞增殖周期. 任何增殖系统成分的过度表达和抑制系统成分的缺失或失活都会产生细胞增殖失控而导致癌变. 本结果表明，P16及Rb在胃癌组织中阳性表达率及强度均低于正常组织. 而cyclin D1表达强度则高于正常，这表明P16和Rb蛋白的表达缺失及cyclin D1的过表达是胃癌发生的重要因素. 有认为cyclin D1在正常细胞中表达不连续，仅在G1期达到峰值，但在肿瘤细胞中其表达不限于G1期细胞，在S期和G2期均有表达[6]. 我们认为正常胃粘膜细胞也呈不同程度阳性表达，可能属于G1期细胞.
我们观察了30例原发性胃癌切片p16, Rb和cyclin D1的表达状态及相互关系，其中有93%均表达cyclin D1，即使Rb和p16呈阳性者仍可见cyclin D1呈过度表达，因此本结果不支持胃癌发生中存在cyclin D1过表达与Rb，p16的失表达或失活之间有负相关性. 另外，Rb阳性者中，p16均呈阴性表达，而Rb阴性者中，p16阳性与阴性表达各5例. 二者之间在胃癌表达中存在负相关关系，这与以前报道结果一致[7，8]. P16和Rb失表达是由于其基因缺失或5＇端CpG岛甲基化所致[4，5，9]，而cyclin D1的过度表达则是与染色体重排或转录后调节使细胞周期蛋白稳定性异常增高所致[6]. 因此，我们可设想胃癌的癌变机制为：在Rb阳性肿瘤中，由于P16基因缺失或5＇端CpG岛甲基化而使P16失表达，一方面不能竞争结合CDK4阻止细胞分裂，另一方面增加了cyclin D1同CDK4结合，从而使Rb蛋白磷酸化而失活，Rb抑制E2F的作用减弱，E2F的激活促进细胞的DNA合成和分裂，从而细胞失控性生长，发生癌变. 而Rb阴性的肿瘤中，即使P16蛋白代偿性增高，也不能发挥其阻止细胞周期的生物学效应. 二者均失表达的肿瘤细胞周期更加失控. 而在P16和Rb均未失表达或失活的肿瘤则可能意味着cyclin D1的生物学效应超过了Rb与p16对细胞周期的抑制. 本结果表明，3种蛋白的表达与胃癌的组织学类型和淋巴结转移无关(P>0.05)，这与其他报道结果不一致[10，11]，其原因可能是我们采取的标本均为晚期胃癌，即使无淋巴结转移，也大都侵犯至深肌层以至浆膜层，另外，各组织学类型的标本量也较少，故应多选用早、中期胃癌标本和增加各组织类型胃癌的标本量进一步研究.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Mate JL, Ariza A. Cyclin D1 overexpression in non-small cell lung carcinoma: Correlation with Ki67 labelling index and poor
cytoplasmic differentiation. J Pathol, 1996;180:395-399
2 Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, Liu Q, Harshman K, Tavitigia SV, Day RS, Johnson BE, Skolnick MH. A cell cycle
regulatoer potentially involved in the genesis of many tumor types. Science, 1994;264:436-440
, 百拇医药
3 宋跃，赵青，贾明库，林海江，杨翰仪. Rb1基因mRNA在人胃癌中表达的研究. 实用肿瘤学杂志，1997；11：170-171
4 吕有勇，高崇峰，崔建涛，孙梅，程金泉. 胃癌中MTS1/P16基因缺失及表达异常的研究. 中华肿瘤杂志，1996；18：189-191
5 李扬，丘钜世. 侵袭性骨肿瘤中Rb基因的产物表达的研究. 中华病理学杂志，1997；26：262-265
6 卢筱洪. D类细胞周期蛋白与肿瘤研究进展. 国外内科学分册，1997；24：432-435
7 Shapiro GI, Eddwards CD, Kobzik L, Godieski J, Richards W, Sugarbaker DJ, Rollins BJ. Reciprocal Rb inactivation and P16INK4 expression in primary lung cancer and cell lines. Cancer Res, 1995;55:505-509
, 百拇医药
8 Yeager T, Studler W, Belair C, Puthenveettil J, Olopade O, Reznikofi C. Increased P16 levels correlate with pRb alterations in
human urothelial cells. Cancer Res, 1995;55:493-496
9 Herman JG, Merlo A, Mao L, Lapidus RG, Issa JPJ, Davidson NE, Sidransky D, Baylin SB. Inactivation of the CDKN2/P16/MTS1 gene
is frequently associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers. Cancer Res, 1995;55:4525-4530
10 蔺玉昌，黄长铭，刘道坤，陈莉. 星形细胞瘤P16与Rb蛋白的表达及其相关性研究. 中华病理学杂志，1997；26：340-342
11 张桂芬，刘荣，孙智才，魏国红. 大肠腺癌中细胞增殖周期调控因子p16和cyclin D1的表达和意义. 诊断病理学杂志，1997；4：142-144, 百拇医药(魏铜有1 魏明霞2 杨苏敏3)
项目负责人 魏铜有长治医学院基础医学部组织学与胚胎学教研室 山西省长治市 046000
收稿日期 1999-10-03 接收日期 1999-12-05
Subject headings stomach neoplasms; immunohistochemistry; cyclin D1 gene; p16 gene; Rb gene
主题词 胃肿瘤；免疫组织化学；cyclin D1基因；p16基因；Rb基因
, 百拇医药
正常细胞周期中，cyclin D1(细胞周期蛋白D1)与CDK4(细胞周期蛋白激酶)结合形成复合物促进细胞分裂增殖，P16和Rb抑制细胞分裂，从而保证机体细胞的正常生长. 当这一促增生系统成分过表达以及抑制增生系统成分缺失或失活都会导致细胞增殖失控而发生癌变. 研究表明许多肿瘤中均有cyclin D1的过度表达及P16 Rb基因的缺失[1-5]. 我们用免疫组化方法检测了30例胃癌标本中cyclin D1, P16和Rb蛋白的表达，并与手术切缘正常粘膜组织进行比较，旨在探讨三者的相关性及其在胃癌形成中的作用.
1 材料和方法
1.1 材料 本院病理科1995/1996手术切除的原发性胃癌标本30例，同时取其相应切缘正常胃粘膜组织经100mL/L福尔马林固定，常规石蜡包埋切片. 其中管状腺癌13例，乳头状腺癌3例，低分化腺癌9例，粘液腺癌3例，印戒细胞癌2例，均为进展期胃癌，已发生淋巴结转移者21例. 鼠抗cyclin D1, Rb1单克隆抗体及SP试剂盒为美国Zymed公司产品，兔抗P16多克隆抗体为Santa，Cruz公司产品，均购自北京中山生物技术有限公司.
, 百拇医药
1.2 方法 4μm厚连衅徽庞糜贖E染色，另三张用于免疫组化染色. 在加入一抗前将切片放入pH 6.0，0.01mol/L枸橼酸缓冲液内，于微波炉中高温辐射(95℃)10min，进行抗原修复，其他步骤与常规免疫组化染色相同. 抗体最佳稀释度：cyclin D1为1∶45，Rb为1∶20，p16为1∶40. 阳性对照用预实验中表达阳性的标本，空白对照用PBS代替一抗. 结果判断：根据阳性细胞所占面积分4个等级：“-”无明显阳性反应细胞；“+”阳性细胞面积<25%；“++”阳性细胞面积在25%～75%；“+++”阳性细胞面积在75%以上.
统计学处理 秩和检验.
2 结果
正常胃粘膜标本30例中25例表达P16蛋白，27例表达cyclin D1蛋白，全部表达Rb蛋白. 肿瘤组织30例中5例表达P16，20例表达Rb，且表达程度较正常胃粘膜减弱，28例表达cyclin D1，且表达程度较正常胃粘膜增强. 经统计学检验，正常与肿瘤组织3种蛋白表达程度有统计学差异(P<0.01或P<0.05，表1). 3种蛋白表达在胃癌各组织学类型及有无淋巴结转移中表达强度无统计学差异(P>0.05). 20例Rb阳性病例中，P16均呈阴性表达，而cyclin D1 19例呈阳性表达，1例呈阴性表达；10例Rb阴性病例中，P16呈阳性者5例，呈阴性者5例，cyclin D1呈阳性者9例，呈阴性者1例. 25例P16呈阴性者中，24例cyclin D1呈阳性；5例P16呈阳性者，4例cyclin D1也呈阳性表达. 经统计学分析，P16与Rb表达呈负相关关系(P<0.01，表2)，而P16,Rb与cyclin D1之间表达无负相关关系(P>0.05).
, 百拇医药
表1 胃癌生物学特征与cyclin D1 P16 Rb蛋白的表达
| 分组 | n | cyclin D1 | P16 | Rb | |||||||||
| - | + | ++ | +++ | - | + | ++ | +++ | - | + | ++ | +++ | ||
| 正常 | 30 | 3 | 10 | 13 | 4 | 5 | 0 | 10 | 15 | 0 | 5 | 20 | 5 |
| 组织学类型 | |||||||||||||
| 管状腺癌 | 13 | 0 | 2 | 8 | 3 | 10 | 2 | 1 | 0 | 3 | 2 | 2 | 5 |
| 乳头状腺癌 | 3 | 0 | 1 | 1 | 1 | 3 | 0 | 0 | 0 | 2 | 1 | 0 | 0 |
| 低分化腺癌 | 9 | 2 | 0 | 6 | 1 | 7 | 1 | 1 | 0 | 5 | 4 | 0 | 0 |
| 粘液腺癌 | 3 | 0 | 1 | 0 | 2 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 1 | 0 |
| 印戒细胞癌 | 2 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 |
| 淋巴结转移 | |||||||||||||
| 有转移 | 21 | 1 | 4 | 11 | 6 | 17 | 3 | 1 | 0 | 6 | 9 | 4 | 2 |
| 无转移 | 9 | 1 | 0 | 4 | 3 | 8 | 0 | 1 | 0 | 4 | 1 | 1 | 3 |
, 百拇医药
表2 胃癌组织Rb表达与P16和cyclin D1表达的关系
| P16 | cyclin D1 | |||
| + | - | + | - | |
| + | 0 | 20b | 19 | 1 |
| - | 5 | 5 | 9 | 1 |
bP<0.01，vs Rb.
3 讨论
, 百拇医药 CDK4与cyclin D1结合并被激活形成CDK4-D1复合物，促使Rb蛋白的磷酸化作用，正调节细胞增殖周期. P16蛋白能与cyclin D1竞争性结合CDK4并使之灭活，阻止细胞周期从G1期向S期过渡，从而负调节细胞增殖周期. 任何增殖系统成分的过度表达和抑制系统成分的缺失或失活都会产生细胞增殖失控而导致癌变. 本结果表明，P16及Rb在胃癌组织中阳性表达率及强度均低于正常组织. 而cyclin D1表达强度则高于正常，这表明P16和Rb蛋白的表达缺失及cyclin D1的过表达是胃癌发生的重要因素. 有认为cyclin D1在正常细胞中表达不连续，仅在G1期达到峰值，但在肿瘤细胞中其表达不限于G1期细胞，在S期和G2期均有表达[6]. 我们认为正常胃粘膜细胞也呈不同程度阳性表达，可能属于G1期细胞.
我们观察了30例原发性胃癌切片p16, Rb和cyclin D1的表达状态及相互关系，其中有93%均表达cyclin D1，即使Rb和p16呈阳性者仍可见cyclin D1呈过度表达，因此本结果不支持胃癌发生中存在cyclin D1过表达与Rb，p16的失表达或失活之间有负相关性. 另外，Rb阳性者中，p16均呈阴性表达，而Rb阴性者中，p16阳性与阴性表达各5例. 二者之间在胃癌表达中存在负相关关系，这与以前报道结果一致[7，8]. P16和Rb失表达是由于其基因缺失或5＇端CpG岛甲基化所致[4，5，9]，而cyclin D1的过度表达则是与染色体重排或转录后调节使细胞周期蛋白稳定性异常增高所致[6]. 因此，我们可设想胃癌的癌变机制为：在Rb阳性肿瘤中，由于P16基因缺失或5＇端CpG岛甲基化而使P16失表达，一方面不能竞争结合CDK4阻止细胞分裂，另一方面增加了cyclin D1同CDK4结合，从而使Rb蛋白磷酸化而失活，Rb抑制E2F的作用减弱，E2F的激活促进细胞的DNA合成和分裂，从而细胞失控性生长，发生癌变. 而Rb阴性的肿瘤中，即使P16蛋白代偿性增高，也不能发挥其阻止细胞周期的生物学效应. 二者均失表达的肿瘤细胞周期更加失控. 而在P16和Rb均未失表达或失活的肿瘤则可能意味着cyclin D1的生物学效应超过了Rb与p16对细胞周期的抑制. 本结果表明，3种蛋白的表达与胃癌的组织学类型和淋巴结转移无关(P>0.05)，这与其他报道结果不一致[10，11]，其原因可能是我们采取的标本均为晚期胃癌，即使无淋巴结转移，也大都侵犯至深肌层以至浆膜层，另外，各组织学类型的标本量也较少，故应多选用早、中期胃癌标本和增加各组织类型胃癌的标本量进一步研究.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Mate JL, Ariza A. Cyclin D1 overexpression in non-small cell lung carcinoma: Correlation with Ki67 labelling index and poor
cytoplasmic differentiation. J Pathol, 1996;180:395-399
2 Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, Liu Q, Harshman K, Tavitigia SV, Day RS, Johnson BE, Skolnick MH. A cell cycle
regulatoer potentially involved in the genesis of many tumor types. Science, 1994;264:436-440
, 百拇医药
3 宋跃，赵青，贾明库，林海江，杨翰仪. Rb1基因mRNA在人胃癌中表达的研究. 实用肿瘤学杂志，1997；11：170-171
4 吕有勇，高崇峰，崔建涛，孙梅，程金泉. 胃癌中MTS1/P16基因缺失及表达异常的研究. 中华肿瘤杂志，1996；18：189-191
5 李扬，丘钜世. 侵袭性骨肿瘤中Rb基因的产物表达的研究. 中华病理学杂志，1997；26：262-265
6 卢筱洪. D类细胞周期蛋白与肿瘤研究进展. 国外内科学分册，1997；24：432-435
7 Shapiro GI, Eddwards CD, Kobzik L, Godieski J, Richards W, Sugarbaker DJ, Rollins BJ. Reciprocal Rb inactivation and P16INK4 expression in primary lung cancer and cell lines. Cancer Res, 1995;55:505-509
, 百拇医药
8 Yeager T, Studler W, Belair C, Puthenveettil J, Olopade O, Reznikofi C. Increased P16 levels correlate with pRb alterations in
human urothelial cells. Cancer Res, 1995;55:493-496
9 Herman JG, Merlo A, Mao L, Lapidus RG, Issa JPJ, Davidson NE, Sidransky D, Baylin SB. Inactivation of the CDKN2/P16/MTS1 gene
is frequently associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers. Cancer Res, 1995;55:4525-4530
10 蔺玉昌，黄长铭，刘道坤，陈莉. 星形细胞瘤P16与Rb蛋白的表达及其相关性研究. 中华病理学杂志，1997；26：340-342
11 张桂芬，刘荣，孙智才，魏国红. 大肠腺癌中细胞增殖周期调控因子p16和cyclin D1的表达和意义. 诊断病理学杂志，1997；4：142-144, 百拇医药(魏铜有1 魏明霞2 杨苏敏3)