MTS1真核表达载体的构建和鉴定
1中国人民解放军第四军医大学唐都医院普通外科 陕西省西安市 710038
2中国人民解放军第四军医大学生物化学教研室 陕西省西安市 710032
3中国人民解放军第四军医大学西京医院消化内科 陕西省西安市 710033
项目负责人 王青中国人民解放军第四军医大学唐都医院普通外科 陕西省西安市 710038
收稿日期 1999-12-01 接收日期 2000-01-08
Subject headings tumor suppression gene; eukaryote expression vector; recombinant plasmid
, http://www.100md.com
主题词 肿瘤抑制基因； 真核表达载体；重组质粒
多肿瘤抑制基因(MTS1)表达产物P16蛋白作为细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)的抑制物，使Rb蛋白磷酸化受阻，细胞不能由G1期进入S期，进而抑制细胞分裂增殖. 为进一步开展消化道肿瘤防治研究，我们构建了MTS1真核表达载体，现报告如下.
1 材料和方法
1.1 材料 pUC19-P16质粒和 pcDNA3真核表达载体由第四军医大学生化教研室提供. Plasmid purification kit 购自上海华顺公司，PCR purification kit 购自美国Clontech公司. BamHⅠ， EcoRⅠ， T4 DNA ligase， XbaⅠ， HindⅢ等限制酶，DNA Marker及其他常用试剂购自美国Promega公司和中国华美公司.
, 百拇医药
1.2 方法 MTS1真核表达载体构建：将pUC19-P16质粒用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切电泳回收目的片段(450bp)，同样将pcDNA3真核表达载体以EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后电泳回收大片段(5.4Kb)，用T4 DNA ligase连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，铺Ap平板，37℃倒置过夜. 构建的MTS1真核表达载体命名为pcDNA16. 初步鉴定：随机挑取8个克隆，以EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定，能切出450bp大小片段的即为阳性克隆. 进一步鉴定：将阳性克隆再重新提取质粒，以XbaⅠ和BamHⅠ，EcoRⅠ和HindⅢ分别双酶切，切出片段大小均为450bp左右.
2 结果
P16经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切20g/L琼脂糖凝胶电泳可见450bp片段，切下胶块. 同时将载体以EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，走8g/L琼脂糖凝胶电泳，显示5.4Kb处仅有一条带，切下条带所在胶块回收连接转化后长出约80个克隆，挑取8个克隆提取质粒，以EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定，可见450bp的片段，该克隆即为阳性克隆.
, 百拇医药
将阳性克隆再重新提取质粒，以XbaⅠ和BamHⅠ，EcoRⅠ和HindⅢ分别双酶切，切出片段大小均为450bp.
3 讨论
细胞周期负调控与抑癌基因密切相关. P16蛋白作为CDK的抑制物，当同Cyclin D竟争与CDK4结合后，抑制其活性，使CDK4不能催化Rb蛋白磷酸化，阻止细胞由G1期进入S期，从而抑制细胞分裂生长[1-5]. 进一步的研究表明P16INK4编码的蛋白是CDK4的抑制因子，直接调控细胞增殖周期[6]. 在间皮瘤细胞(M9K)等三株细胞系中，转染表达P16INK4 cDNA的载体后，其克隆形成效率受到抑制，但在结肠癌细胞系DLD-1中并未发现其生长受到抑制[7，8]. 国内也有作者将MTS1基因导入膀胱癌细胞和胃癌细胞，使表达外源性P16的裸鼠致瘤作用飨允艿揭种篇，[10]. 我们曾使用袁建林et al[11]构建的MTS1逆转录病毒表达载体转染胆管癌细胞和直肠癌细胞. 在实验中发现该载体转染效率较低，转染细胞阳性克隆的筛选及传代均较困难. 为此，我们构建了MTS1真核表达载体，以观察转染消化道肿瘤细胞的克隆形成效率及对肿瘤细胞作用等情况. 本研究首次将MTS1基因cDNA克隆入真核表达载体，构成MTS1重组表达质粒，并命名为pcDNA16，经酶切鉴定表明载体质粒构建正确，可进一步应用，为开展转染肿瘤细胞逆转异质性研究打下了基础.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Kamb A， Gruis NA， Weaver Feldhaus J， Liu Q， Harshman K， Tavtigian SV， Stockert E， Day-RS-3rd， Johnson BE，Skolnick MH. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science， 1994;264:436-440
2 Nobori T， Miura K， Wu DJ， Lois A， Takabayashi K， Carson DA. Deletion of the cyclin dependent kinase-4 inhibitor gene
in multiple human cancers. Nature， 1994;368:753-756
, http://www.100md.com
3 Marx J. A challenge to p16 gene as a major tumor suppressor. Science， 1994;264:1846
4 Marx J. How cells cycle toward cancer. Science， 1994;26:319-321
5 Marx J. New tumor suppressor may rival P53. Science， 1994;264:344-345
6 Spillare EA， Okamoto A， Hagiwara K， Demetrick DJ， Serrano M， Beach D, Harris CC. Suppression of growth in vitro
and tumorigenicity in vivo of human carcinoma cell lines by transfected P16INK4. Mol Carcinog， 1996;16:53-60
, http://www.100md.com
7 Lois AF， Rosenbach M， Miura K， Michimata H， Carson DA， Nobori T. Structural-functional analysis of the P16 tumor
suppressor. Cancer Res， 1995;36(Suppl):575
8 Spillare EA， Okamoto A， Hussain SP， Serrano M， Beach D， Harris CC. Transfected P16INK4 suppresses in vitro growth
of human tumor cell lines. Cancer Res， 1995;36(Suppl):200
9 Yuan JL， Hui HX， Wang JB， Yu MS， Chai YB， Shao GX， Wang ZK， Wang CJ， Xin JG. Inhibitory effects of wild-type MTS1
, 百拇医药
on human bladder cancer line. Zhonghua Miniao Waike Zazhi， 1997;9:545-548
10 Li WM， Lu YY. Introduction of Rb， P53， P16 and H-ras antisense RNA suppresses tumorigenicity in human gastric cancer
cell lines. Zhongguo Zhongliu Shengwu Zhiliao Zazhi， 1997;4:90-94
11 Yuan JL， Chai YB， Yu MS， Hui HX. Construction and identification of retroviral expression vector of MTS1.
Zhonghua Miniao Waike Zazhi， 1996;17:395, http://www.100md.com(王 青1 吴金生1 柴玉波2 赖大年1 要 秀1 潘伯荣3)
2中国人民解放军第四军医大学生物化学教研室 陕西省西安市 710032
3中国人民解放军第四军医大学西京医院消化内科 陕西省西安市 710033
项目负责人 王青中国人民解放军第四军医大学唐都医院普通外科 陕西省西安市 710038
收稿日期 1999-12-01 接收日期 2000-01-08
Subject headings tumor suppression gene; eukaryote expression vector; recombinant plasmid
, http://www.100md.com
主题词 肿瘤抑制基因； 真核表达载体；重组质粒
多肿瘤抑制基因(MTS1)表达产物P16蛋白作为细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)的抑制物，使Rb蛋白磷酸化受阻，细胞不能由G1期进入S期，进而抑制细胞分裂增殖. 为进一步开展消化道肿瘤防治研究，我们构建了MTS1真核表达载体，现报告如下.
1 材料和方法
1.1 材料 pUC19-P16质粒和 pcDNA3真核表达载体由第四军医大学生化教研室提供. Plasmid purification kit 购自上海华顺公司，PCR purification kit 购自美国Clontech公司. BamHⅠ， EcoRⅠ， T4 DNA ligase， XbaⅠ， HindⅢ等限制酶，DNA Marker及其他常用试剂购自美国Promega公司和中国华美公司.
, 百拇医药
1.2 方法 MTS1真核表达载体构建：将pUC19-P16质粒用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切电泳回收目的片段(450bp)，同样将pcDNA3真核表达载体以EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后电泳回收大片段(5.4Kb)，用T4 DNA ligase连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，铺Ap平板，37℃倒置过夜. 构建的MTS1真核表达载体命名为pcDNA16. 初步鉴定：随机挑取8个克隆，以EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定，能切出450bp大小片段的即为阳性克隆. 进一步鉴定：将阳性克隆再重新提取质粒，以XbaⅠ和BamHⅠ，EcoRⅠ和HindⅢ分别双酶切，切出片段大小均为450bp左右.
2 结果
P16经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切20g/L琼脂糖凝胶电泳可见450bp片段，切下胶块. 同时将载体以EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，走8g/L琼脂糖凝胶电泳，显示5.4Kb处仅有一条带，切下条带所在胶块回收连接转化后长出约80个克隆，挑取8个克隆提取质粒，以EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定，可见450bp的片段，该克隆即为阳性克隆.
, 百拇医药
将阳性克隆再重新提取质粒，以XbaⅠ和BamHⅠ，EcoRⅠ和HindⅢ分别双酶切，切出片段大小均为450bp.
3 讨论
细胞周期负调控与抑癌基因密切相关. P16蛋白作为CDK的抑制物，当同Cyclin D竟争与CDK4结合后，抑制其活性，使CDK4不能催化Rb蛋白磷酸化，阻止细胞由G1期进入S期，从而抑制细胞分裂生长[1-5]. 进一步的研究表明P16INK4编码的蛋白是CDK4的抑制因子，直接调控细胞增殖周期[6]. 在间皮瘤细胞(M9K)等三株细胞系中，转染表达P16INK4 cDNA的载体后，其克隆形成效率受到抑制，但在结肠癌细胞系DLD-1中并未发现其生长受到抑制[7，8]. 国内也有作者将MTS1基因导入膀胱癌细胞和胃癌细胞，使表达外源性P16的裸鼠致瘤作用飨允艿揭种篇，[10]. 我们曾使用袁建林et al[11]构建的MTS1逆转录病毒表达载体转染胆管癌细胞和直肠癌细胞. 在实验中发现该载体转染效率较低，转染细胞阳性克隆的筛选及传代均较困难. 为此，我们构建了MTS1真核表达载体，以观察转染消化道肿瘤细胞的克隆形成效率及对肿瘤细胞作用等情况. 本研究首次将MTS1基因cDNA克隆入真核表达载体，构成MTS1重组表达质粒，并命名为pcDNA16，经酶切鉴定表明载体质粒构建正确，可进一步应用，为开展转染肿瘤细胞逆转异质性研究打下了基础.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Kamb A， Gruis NA， Weaver Feldhaus J， Liu Q， Harshman K， Tavtigian SV， Stockert E， Day-RS-3rd， Johnson BE，Skolnick MH. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science， 1994;264:436-440
2 Nobori T， Miura K， Wu DJ， Lois A， Takabayashi K， Carson DA. Deletion of the cyclin dependent kinase-4 inhibitor gene
in multiple human cancers. Nature， 1994;368:753-756
, http://www.100md.com
3 Marx J. A challenge to p16 gene as a major tumor suppressor. Science， 1994;264:1846
4 Marx J. How cells cycle toward cancer. Science， 1994;26:319-321
5 Marx J. New tumor suppressor may rival P53. Science， 1994;264:344-345
6 Spillare EA， Okamoto A， Hagiwara K， Demetrick DJ， Serrano M， Beach D, Harris CC. Suppression of growth in vitro
and tumorigenicity in vivo of human carcinoma cell lines by transfected P16INK4. Mol Carcinog， 1996;16:53-60
, http://www.100md.com
7 Lois AF， Rosenbach M， Miura K， Michimata H， Carson DA， Nobori T. Structural-functional analysis of the P16 tumor
suppressor. Cancer Res， 1995;36(Suppl):575
8 Spillare EA， Okamoto A， Hussain SP， Serrano M， Beach D， Harris CC. Transfected P16INK4 suppresses in vitro growth
of human tumor cell lines. Cancer Res， 1995;36(Suppl):200
9 Yuan JL， Hui HX， Wang JB， Yu MS， Chai YB， Shao GX， Wang ZK， Wang CJ， Xin JG. Inhibitory effects of wild-type MTS1
, 百拇医药
on human bladder cancer line. Zhonghua Miniao Waike Zazhi， 1997;9:545-548
10 Li WM， Lu YY. Introduction of Rb， P53， P16 and H-ras antisense RNA suppresses tumorigenicity in human gastric cancer
cell lines. Zhongguo Zhongliu Shengwu Zhiliao Zazhi， 1997;4:90-94
11 Yuan JL， Chai YB， Yu MS， Hui HX. Construction and identification of retroviral expression vector of MTS1.
Zhonghua Miniao Waike Zazhi， 1996;17:395, http://www.100md.com(王 青1 吴金生1 柴玉波2 赖大年1 要 秀1 潘伯荣3)