外源性一氧化氮对豚鼠酸化乙醇性胃粘膜损伤的保护作用
1广西百色地区人民医院消化科 533000
2右江民族医学院附属医院检验科 533000
项目负责人 余贤恩广西百色地区人民医院消化科 533000
收稿日期 1999-08-27 接收日期 1999-12-01
Subject headings nitric oxide; ethanol; gastric mucosa
主题词 一氧化氮；乙醇；胃粘膜
, 百拇医药
我们用硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)作为外源性NO供体，观察其对胃壁结合粘液含量及胃粘膜损伤的影响来研究其保护胃粘膜对抗酸化乙醇损伤的作用.
1 材料和方法
1.1 材料 ①硝普钠粉剂由北京制药工业研究所实验药厂提供，使用前用蒸馏水配成0.1mmol/L溶液. 溶液配制到使用完不超过2h，并避光保存. ②阿利斯蓝粉剂(Alican blue, 进口药品)，上海化学试剂分装厂提供. ③动物：豚鼠(右江民族医学院动物室提供)，共40只，雌雄不拘，体重328g～392g. 实验前禁食36h，自由饮水；实验前2h禁水. 实验时按随机原则分组.
1.2 方法 ①胃壁结合粘液测定：参考的阿利斯蓝染色法测定胃壁结合粘液含量. 将动物处死后，取胃，沿胃大弯剪开并外翻. 为避免实验误差，将剪开之胃立即放入生理盐水中轻摇数次，洗尽残留物，并避免接触胃粘膜面，然后浸入20mL阿利斯蓝染液中(阿利斯蓝浓度：200g/L；缓冲液：0.12mol/L Na2 HPO4和0.04mol/L柠檬酸，pH 5.8)，孵育2h后将胃取出，取7mL孵育液放入离心管进行离心(3000r/min,15min)，取上清液在721型分光光度计(上海第三分析仪器厂产品)上于615nm波长比色. 根据下列公式计算结合染料量：4-20×实测光密度 标准管光密度×5=结合染料量(mg)式中“4”为20mL染液中所含染料的毫克数. 胃所结合的染料量反映胃壁结合粘液的分泌量. ②胃粘膜损伤模型的制备及损伤测量方法：用胃饲器把酸化乙醇(150mmol/h HCl+400mL/L乙醇，2mL/kg)灌入豚鼠胃内，60min后用颈椎脱臼法处死动物，剖腹，将胃在贲门和幽门结扎后取出，向胃腔内注入8mL/L甲醛，并将胃浸泡于10mL/L甲醛溶液中20min,然后取出沿胃大弯剪开. 参考Guth的方法计算损伤指数，即依照粘膜损伤的长径计算，损伤≤1mm(包括糜烂点)为1分，大于1mm而≤2mm为2分，依此类推. 损伤宽度>2mm者，指数加倍. ③SNP对胃壁结合粘液分泌的影响及对粘膜损伤的保护作用. 豚鼠分两组，每组10只. SNP组：胃饲0.1mmol/L SNP溶液(10mL/kg)，15min后再胃饲酸化乙醇(2mL/kg). 对照组：胃饲等量蒸馏水，15min后胃饲酸化乙醇(2mL/kg). 1h后处死动物，分别测定胃壁结合粘液含量及胃粘膜损伤指数.
, 百拇医药
统计学处理 数据以x±s表示，采用t检验. 胃组织病理切片后行光镜检查及摄影.
2 结果
SNP组全胃壁结合粘液量为3.5mg±0.16mg；对照组为3.3mg±0.14mg(P<0.01). 对照组和SNP组的全胃粘膜损伤指数分别为：25±16及6±4(P<0.01).
3 讨论
400mL/L乙醇和150mol/L盐酸均可引起胃粘膜损伤，而且两者具有加强作用. H+在胃腔内扩散进入胃粘膜组织使组织酸化而破坏. 乙醇能加速盐酸溶液中HCl分子离子化，生成H+及Cl-. 乙醇还增加中性粒细胞聚集在粘膜细胞而释放超氧化阴离子,H2O2并加强胃运动等而加重组织损伤.
, 百拇医药
胃粘膜在抗损伤中起着重要作用，而在这个防御系统中，面对众多致损因子，首当其冲的是胃粘膜表面连续的胃壁粘液层，它具有粘滞性和弹性，能防御机械性损伤. 同时，粘液可减慢H+在其中的扩散速度，其扩散速度为相同厚度水层H+扩散速度的1/3～1/4. 与上皮细胞分泌的HCO-3一起，在胃腔与胃粘膜上皮之间形成一个pH梯度，从而构成胃粘膜保护的第一道屏障，即粘液——碳酸氢盐屏障. 本结果表明，胃内0.1mmol/LSNP可极显著地增加胃壁粘液含量，这与Brown et al关于NO供体可刺激离体及在体鼠胃粘液及碳酸氢盐分泌的报道一致. 胃粘液的增加可减轻酸化乙醇所致的急性胃粘膜损伤.
乙醇使白细胞浸润于胃粘膜，并释放超氧化物、次氯酸等引起组织损伤. 同时，乙醇还激活胃肠道的肥大细胞使其释放组胺、血小板致活因子(PAF)、内皮素、白三烯及各种超氧化物. 其中组胺、PAF可增加粘膜的通透性；内皮素、白三烯可增加胃粘膜损伤的敏感性. NOS抑制剂增加白细胞浸润及肥大细胞兴奋所引起的组织损伤，而NO则能抑制白细胞粘着及肥大细胞兴奋，同时NO能清除超氧化物而保持粘膜完整.
, 百拇医药
胃粘膜血流(GMBF)减少，将导致胃粘膜缺乏营养和不能及时清除有害物质，因而造成胃粘膜损伤[1]. 支配粘膜的血管是嵌入在肌肉层内的. HCl，乙醇可刺激胃运动，当肌肉收缩时将挤压血管，造成局部缺血，导致胃损伤. NO一方面可以直接舒张血管；另一方面，NO还刺激胃释放血管活性肠肽，两者分别作用于胃平滑肌细胞膜上的鸟苷酸环化酶及腺苷酸环化酶并分别增加细胞内cGMP及cAMP浓度而激活蛋白激酶G，蛋白激酶A，从而引起胃平滑肌舒张，解除对血管的压迫. 通过这两方面的作用，NO使GMBF增加，保护了胃粘膜. 同时，NO抑制胃运动可以减少胃粘液的消耗并减轻胃的机械损伤.
本研究表明，0.1mol/L SNP溶液能极明显地减轻酸化乙醇对豚鼠胃粘膜损伤，这是SNP所生成的NO能有效地增加胃粘液分泌、减少白细胞浸润、抑制肥大细胞兴奋、舒张胃平滑肌、增加GMBF和及时清除氧自由基等作用的结果.
, 百拇医药 NOS广泛分布于多种动物的胃肠道的神经、肌肉及粘膜之中. 研究表明内源性NO也具有保护胃粘膜对抗损伤的作用. Davies et al[2]及Donnelly et al[3]使用能释放NO的新形非甾体类抗炎药，能明显减轻NSAID对胃粘膜的损伤.
致谢 美国加尼福尼亚大学Tache博士寄来珍贵资料，右江民族医学院病理教研室曲德英和潘金娥帮助病理检查，电教室王飞帮助标本摄影.
4 参考文献
1 Piasecki CK, Thraswoulou C. Spasm of gastric muscularis mucosae might play a key role in causing focal mucosal ischemia and
, 百拇医药
ulceration: an experimental study in guinea pigs. Dig Dis Sci, 1993;38:1183-1189
2 Davies NM, Roseth AG, Appleyard CB, Mcknight W, Del Soldato P, Calignano A, Cirino G, Wallace JC. NO_mproxen vs.
naproxen: ulcerogenic, analgesic and anti_inflammatory effects. Aliment pharmacol Ther, 1997;11:69-79
3 Donnelly MT, Stack WA, Courtauld EM, Garlick N, Del Soldato P, Hawkey CJ. Nitric oxide donating flurbiprofen (HCT 1026) causes
less endoscopic damage in healthy volunteers than flurbiprofen. Gut, 1998;42(Suppl 1):A6, 百拇医药(余贤恩1 罗绮凝2)
2右江民族医学院附属医院检验科 533000
项目负责人 余贤恩广西百色地区人民医院消化科 533000
收稿日期 1999-08-27 接收日期 1999-12-01
Subject headings nitric oxide; ethanol; gastric mucosa
主题词 一氧化氮；乙醇；胃粘膜
, 百拇医药
我们用硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)作为外源性NO供体，观察其对胃壁结合粘液含量及胃粘膜损伤的影响来研究其保护胃粘膜对抗酸化乙醇损伤的作用.
1 材料和方法
1.1 材料 ①硝普钠粉剂由北京制药工业研究所实验药厂提供，使用前用蒸馏水配成0.1mmol/L溶液. 溶液配制到使用完不超过2h，并避光保存. ②阿利斯蓝粉剂(Alican blue, 进口药品)，上海化学试剂分装厂提供. ③动物：豚鼠(右江民族医学院动物室提供)，共40只，雌雄不拘，体重328g～392g. 实验前禁食36h，自由饮水；实验前2h禁水. 实验时按随机原则分组.
1.2 方法 ①胃壁结合粘液测定：参考的阿利斯蓝染色法测定胃壁结合粘液含量. 将动物处死后，取胃，沿胃大弯剪开并外翻. 为避免实验误差，将剪开之胃立即放入生理盐水中轻摇数次，洗尽残留物，并避免接触胃粘膜面，然后浸入20mL阿利斯蓝染液中(阿利斯蓝浓度：200g/L；缓冲液：0.12mol/L Na2 HPO4和0.04mol/L柠檬酸，pH 5.8)，孵育2h后将胃取出，取7mL孵育液放入离心管进行离心(3000r/min,15min)，取上清液在721型分光光度计(上海第三分析仪器厂产品)上于615nm波长比色. 根据下列公式计算结合染料量：4-20×实测光密度 标准管光密度×5=结合染料量(mg)式中“4”为20mL染液中所含染料的毫克数. 胃所结合的染料量反映胃壁结合粘液的分泌量. ②胃粘膜损伤模型的制备及损伤测量方法：用胃饲器把酸化乙醇(150mmol/h HCl+400mL/L乙醇，2mL/kg)灌入豚鼠胃内，60min后用颈椎脱臼法处死动物，剖腹，将胃在贲门和幽门结扎后取出，向胃腔内注入8mL/L甲醛，并将胃浸泡于10mL/L甲醛溶液中20min,然后取出沿胃大弯剪开. 参考Guth的方法计算损伤指数，即依照粘膜损伤的长径计算，损伤≤1mm(包括糜烂点)为1分，大于1mm而≤2mm为2分，依此类推. 损伤宽度>2mm者，指数加倍. ③SNP对胃壁结合粘液分泌的影响及对粘膜损伤的保护作用. 豚鼠分两组，每组10只. SNP组：胃饲0.1mmol/L SNP溶液(10mL/kg)，15min后再胃饲酸化乙醇(2mL/kg). 对照组：胃饲等量蒸馏水，15min后胃饲酸化乙醇(2mL/kg). 1h后处死动物，分别测定胃壁结合粘液含量及胃粘膜损伤指数.
, 百拇医药
统计学处理 数据以x±s表示，采用t检验. 胃组织病理切片后行光镜检查及摄影.
2 结果
SNP组全胃壁结合粘液量为3.5mg±0.16mg；对照组为3.3mg±0.14mg(P<0.01). 对照组和SNP组的全胃粘膜损伤指数分别为：25±16及6±4(P<0.01).
3 讨论
400mL/L乙醇和150mol/L盐酸均可引起胃粘膜损伤，而且两者具有加强作用. H+在胃腔内扩散进入胃粘膜组织使组织酸化而破坏. 乙醇能加速盐酸溶液中HCl分子离子化，生成H+及Cl-. 乙醇还增加中性粒细胞聚集在粘膜细胞而释放超氧化阴离子,H2O2并加强胃运动等而加重组织损伤.
, 百拇医药
胃粘膜在抗损伤中起着重要作用，而在这个防御系统中，面对众多致损因子，首当其冲的是胃粘膜表面连续的胃壁粘液层，它具有粘滞性和弹性，能防御机械性损伤. 同时，粘液可减慢H+在其中的扩散速度，其扩散速度为相同厚度水层H+扩散速度的1/3～1/4. 与上皮细胞分泌的HCO-3一起，在胃腔与胃粘膜上皮之间形成一个pH梯度，从而构成胃粘膜保护的第一道屏障，即粘液——碳酸氢盐屏障. 本结果表明，胃内0.1mmol/LSNP可极显著地增加胃壁粘液含量，这与Brown et al关于NO供体可刺激离体及在体鼠胃粘液及碳酸氢盐分泌的报道一致. 胃粘液的增加可减轻酸化乙醇所致的急性胃粘膜损伤.
乙醇使白细胞浸润于胃粘膜，并释放超氧化物、次氯酸等引起组织损伤. 同时，乙醇还激活胃肠道的肥大细胞使其释放组胺、血小板致活因子(PAF)、内皮素、白三烯及各种超氧化物. 其中组胺、PAF可增加粘膜的通透性；内皮素、白三烯可增加胃粘膜损伤的敏感性. NOS抑制剂增加白细胞浸润及肥大细胞兴奋所引起的组织损伤，而NO则能抑制白细胞粘着及肥大细胞兴奋，同时NO能清除超氧化物而保持粘膜完整.
, 百拇医药
胃粘膜血流(GMBF)减少，将导致胃粘膜缺乏营养和不能及时清除有害物质，因而造成胃粘膜损伤[1]. 支配粘膜的血管是嵌入在肌肉层内的. HCl，乙醇可刺激胃运动，当肌肉收缩时将挤压血管，造成局部缺血，导致胃损伤. NO一方面可以直接舒张血管；另一方面，NO还刺激胃释放血管活性肠肽，两者分别作用于胃平滑肌细胞膜上的鸟苷酸环化酶及腺苷酸环化酶并分别增加细胞内cGMP及cAMP浓度而激活蛋白激酶G，蛋白激酶A，从而引起胃平滑肌舒张，解除对血管的压迫. 通过这两方面的作用，NO使GMBF增加，保护了胃粘膜. 同时，NO抑制胃运动可以减少胃粘液的消耗并减轻胃的机械损伤.
本研究表明，0.1mol/L SNP溶液能极明显地减轻酸化乙醇对豚鼠胃粘膜损伤，这是SNP所生成的NO能有效地增加胃粘液分泌、减少白细胞浸润、抑制肥大细胞兴奋、舒张胃平滑肌、增加GMBF和及时清除氧自由基等作用的结果.
, 百拇医药 NOS广泛分布于多种动物的胃肠道的神经、肌肉及粘膜之中. 研究表明内源性NO也具有保护胃粘膜对抗损伤的作用. Davies et al[2]及Donnelly et al[3]使用能释放NO的新形非甾体类抗炎药，能明显减轻NSAID对胃粘膜的损伤.
致谢 美国加尼福尼亚大学Tache博士寄来珍贵资料，右江民族医学院病理教研室曲德英和潘金娥帮助病理检查，电教室王飞帮助标本摄影.
4 参考文献
1 Piasecki CK, Thraswoulou C. Spasm of gastric muscularis mucosae might play a key role in causing focal mucosal ischemia and
, 百拇医药
ulceration: an experimental study in guinea pigs. Dig Dis Sci, 1993;38:1183-1189
2 Davies NM, Roseth AG, Appleyard CB, Mcknight W, Del Soldato P, Calignano A, Cirino G, Wallace JC. NO_mproxen vs.
naproxen: ulcerogenic, analgesic and anti_inflammatory effects. Aliment pharmacol Ther, 1997;11:69-79
3 Donnelly MT, Stack WA, Courtauld EM, Garlick N, Del Soldato P, Hawkey CJ. Nitric oxide donating flurbiprofen (HCT 1026) causes
less endoscopic damage in healthy volunteers than flurbiprofen. Gut, 1998;42(Suppl 1):A6, 百拇医药(余贤恩1 罗绮凝2)