明胶酶原A在实验性肝纤维化过程中表达变化
中国人民解放军第一军医大学附属珠江医院肝胆外科 广东省广州市 510282
王宇，男，1974-02-24生，辽宁省营口市人，汉族. 1997年第一军医大学军医系本科毕业，现为第一军医大学肝胆外科研究生，主要从事肝硬变及肝癌的基础及临床研究，发表论文5篇.
广东省自然科学基金资助项目，No.960362
项目负责人 王宇，510282，广东省广州市工业大道253号，中国人民解放军第一军医大学附属珠江医院肝胆外科.
Supported by the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No.960362
, http://www.100md.com
Correspondence to Yu Wang, Department of Hepatobiliary Surgery of Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
Tel. +86-20-85143556
收稿日期 1999-11-16 接收日期 2000-01-03
Gelatinase A proenzyme expression in the process of experimental liver fibrosis
Yu Wang, Yi Gao, Yu-Qi Huang, Jin-Long Yu and Shi-Gang Fang
, 百拇医药
Department of Hepatobiliary Surgery of Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282,Guangdong Province, China
Abstract
AIM To investigate the dynamic alteration of gelatinase A (metalloproteinase-2, mmp-2) proenzyme protein expression in the process of experimental liver fibrosis.
METHODS The carbon tetrachloride-induced hepatic fibrosis rat models was used. mmp-2 proenzyme protein expression in the different stages of liver fibrosis was measured by quantitative analysis of Western blot and immunohistochemical technique.
, 百拇医药
RESULTS mmp-2 proenzyme protein expression could be detected in normal rat liver. In the pathogenesis and development of liver fibrosis, mmp-2 proenzyme protein expression level was increased gradually, the expression rate being highest at an intermediate stage of fibrosis. And it decreased gradually during the late liver fibrosis and at stage of liver cirrhosis, but remained relatively high levels above normal. The expression of mmp-2 was located in sinusoidal cells, biliary ducts and capillary endothelial cells in the space of Disse, it was more intense around fibers in fibrous septa in liver cirrhosis.
, 百拇医药
CONCLUSION mmp-2 might participate in pathogenesis of liver fibrosis and cirrhosis as an important role.
Subject headings liver cirrhosis; gelatinase A; disease model, animal
Wang Y,Gao Y,Huang YQ,Yu JL,Fang SG.Gelatinase A proenzyme expression in the process of experimental liver fibrosis.
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,2000;8(2):165-167
, 百拇医药
摘要
目的 研究实验性肝纤维化过程中明胶酶A(mmp-2)酶原蛋白表达的动态变化.
方法 建立四氯化碳大鼠肝纤维化模型,采用Western印迹法和免疫组化方法,对肝纤维化不同阶段肝内mmp-2的酶原蛋白的表达水平与分布进行了检测.
结果 在正常大鼠肝组织中有mmp-2的酶原表达.在肝纤维化发生发展过程中mmp-2酶原蛋白表达水平逐渐增强,至肝纤维化中期到达最高峰,到肝纤维化晚期及肝硬变阶段其表达较中期下降,但仍高于正常对照水平.正常肝组织内,mmp-2的表达主要位于汇管区的胆管壁和毛细血管壁及肝窦壁的间质细胞;纤维化时,增生的纤维间隔附近亦有较高表达.
结论 mmp2在肝纤维化的发生、发展直至肝硬变形成过程中发挥着重要作用.
, 百拇医药
主题词 肝硬化;明胶酶原A;疾病模型,动物
王宇,高毅,黄宇琦,俞金龙,方石岗.明胶酶原A在实验性肝纤维化过程中表达变化.世界华人消化杂志,2000;8(2):165-167
0 引言
肝纤维化过程中，胶原纤维等细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的合成与降解是一个复杂的过程. 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一族参与降解ECM的主要水解蛋白酶，肝内发现了8种，其中明胶酶A(mmp-2)，即Mr72000的Ⅳ型胶原酶，主要参与基底膜Ⅳ型胶原的代谢，与肝纤维化的发生发展紧密相关[1]. 为了了解肝纤维化过程中mmp-2酶原表达变化，我们应用四氯化碳(CCl4)建立大鼠肝纤维化模型，通过免疫组化癢estern免疫印迹方法对肝内mmp-2酶原蛋白的表达分布和水平作了检测，现报道
, http://www.100md.com
如下.
1 材料和方法
1.1 材料 清洁型Wistar大鼠120只，雌雄各半，体质量180g～300g，第一军医大学实验动物中心提供. CCl4为汕头化工厂产品，含量>99.5%. APA免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司；蛋白抽提及定量试剂盒为Bio-Rad产品；mmp-2兔多克隆抗体由美国(NIH)William G. Stetler-Stevenson惠赠，辣根过氧化物酶标二抗(羊抗兔IgG-HRP)为华美公司产品. 电转膜仪为Bio-Rad公司产品；凝胶成象扫描分析系统系第一军医大学中心实验室提供的Gel Documentation Analysis System, GDAS.
1.2 方法
, http://www.100md.com
1.2.1 肝纤维化模型制备 参照Montfort et al[2]方法，400mL/L CCl4花生油溶液按2mL/kg予Wistar大鼠ip，2次/wk，共12wk. 120只大鼠随机分为模型组和正常对照组，模型组70只，按上述方法造模(死亡率7%)；正常对照组50只，用相应量生理盐水ip. 在0，2，5，7，9，12，14wk时，对照组活杀7只，模型组活杀9只，切取肝脏同一部分，迅速投入液氮，之后转入-70℃保存.
1.2.2 免疫组化方法 冻冻切片，厚3μm，应用APA即用型试剂盒，按说明书进行检测，DAB显色. MMP-2一抗工作浓度1∶200. 结果判断镜下观察棕黄着色为阳性.
1.2.3 蛋白质的提取及定量 参考Bio-Rad试剂盒说明书进行，并根据各个样品蛋白质A595值的差异行标准化处理.
, 百拇医药
1.2.4 Western印迹[3] 取等量标准化后的蛋白溶液加入等体积的2×SDS上样缓冲液并沸水煮约10min，使蛋白变性. 再取等量变性的蛋白溶液，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔上样量为25μL，并以电转膜仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜(90mA，1.5h)，经丽春红S染色鉴定并标记标准蛋白位置，再以50g/L脱脂奶粉封闭、一抗及二抗温育、DAB显色.
1.2.5 结果分析定量 硝酸纤维素膜显色条带为Mr72000的MMP-2酶原蛋白，对结果扫描定量分析.
统计学处理 扫描结果以X±s表示. 组内、组间比较采用单因素方差分析方法.
2 结果
, http://www.100md.com
2.1 免疫组化结果 MMP-2在正常肝组织有阳性着色，主要出现于汇管区的血管壁和胆管壁周围及肝窦周围的间质细胞(主要是内皮细胞和贮脂细胞). 当纤维化发生发展以及形成肝硬变时，阳性着色多集中于增生的纤维条索区域(成纤维细胞和贮脂细胞). 相比而言，随着肝纤维化的发展，mmp-2的阳性着色逐渐加强，至肝纤维化中晚期着色区域最广，着色最深，肝硬变阶段阳性着色又有所减低(图1～4).
2.2 Western blot结果 正常大鼠肝内有mmp-2酶原蛋白的表达，整个实验过程中正常对照组mmp-2酶原蛋白表达无显著性差异变化(P>0.05)，模型组大鼠随肝纤维化的发展(0wk～9wk)mmp-2酶原蛋白表达逐渐增强，至肝纤维化中期(9wk)达到高峰，肝纤维化晚期(12wk)及肝硬变阶段(14wk)又逐步下降，但仍高于对照组的表达水平(表1，图5，6).
, 百拇医药 图1 正常大鼠肝脏内MMP-2表达情况 10×
图2 4wk大鼠模型肝脏内MMP-2表达情况 10×
图3 9wk大鼠模型肝脏内MMP-2表达情况 4×
图4 14wk大鼠模型肝脏内MMP-2表达情况 4×
图5 对照组MMP-2 Western 印迹图.
图6 模型组MMP-2 Western 印迹图.
, 百拇医药
(从右至左M，A，B，C，D，E，F，G依次代表标准蛋白，0wk,2wk,5wk,7wk,9wk,12wk,14wk)
表1 大鼠CCl4性肝纤维化mmp-2酶原蛋白表达水平(X±s,×103)
, 百拇医药
aP>0.05vs 前期；bP<0.05vs 正常对照组,vs 前期.
3 讨论
肝内基质金属蛋白酶在损伤肝组织重建、修复以及纤维化中发挥着重要的作用. 明胶酶A是基质金属蛋白酶家族(MMPs)的主要成员之一，主要降解基底膜Ⅳ型胶原及明胶(变性胶原)等ECM，从而直接参与调节ECM合成与降解的动态平衡，与肝纤维化发生、发展及形成密切相关. 本实验以免疫组化和Western印迹方法从定位与定量两方面对肝纤维化不同阶段肝内明胶酶A(mmp-2)的酶原蛋白的分布与表达水平进行了检测. 结果表明集中于汇管区及肝窦周围的间质细胞，主要是贮脂细胞和内皮细胞，是mmp-2主要表达细胞；纤维化时，在增生的纤维间隔处的成纤维细胞和内皮细胞亦可合成mmp-2. 人的纤维化肝脏亦是如此[4]. 在正常肝组织有mmp-2的酶原蛋白表达，肝纤维化发生、发展过程中其表达逐渐增强，至肝纤维化中期达到高峰，肝纤维化晚期及肝硬变阶段又逐步下降，但仍高于正常对照的表达水平. 这与有关Ⅳ型胶原酶在肝纤维化过程中的活性变化研究结果是一致的[5]. 由于mmp-2这类破坏基底膜样胶原的胶原酶可降解正常肝脏结缔组织，所以其表达增高，会加强Disse腔内皮下基质的降解，破坏肝小叶排列，影响细胞与基质、细胞与细胞间的正常关系而促使肝纤维化的形成. 肝硬变阶段的mmp-2表达较肝纤维化中期有所下降，其原因可能是此时胶原的代谢活动已较肝纤维化阶段缓慢，机体通过自身的反馈调节使mmp-2表达下降. 关于mmp-2在肝纤维化发病机制中的意义还有待于进一步探讨. 显然通过调控mmp-2酶原表达干预肝内ECM的降解可能是治疗肝纤维化的新途径.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Iredale JP.Matrix turnover in fibrogenesis.Hepato Gastroen,1998;59:376-380
2 Montfort I,Perez Tamayo R.Collagenase in exprimental carbon tetrachloride cirrhosis of the liver.Am J Pathol,1978;92:411-420
3 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning laboratory manual.Second Edition.Beijing: Science Publishing House,1998：888-897
4 Takahara T,Furui K,Yata Y,Jin B,Zhang LP,Nambu S,Sato H,Seiki M,Watanabe A.Dual expression of matrix metalloproteinase 2
and membrane type 1 matrix metalloproteinase in fibrotic human livers.Hepatology,1997;26:1521-1529
5 Wang AM,Yang YW,Zhang B,Zhang ZY,Liang BZ,Sun ZZ. Type Ⅳ collagenases activity in the process of experimental
liver fibrosis.Zhonghua Ganzhangbing Zazhi,1998；6：98-99, 百拇医药(王宇 高毅 黄宇琦 俞金龙 方石岗)
王宇，男，1974-02-24生，辽宁省营口市人，汉族. 1997年第一军医大学军医系本科毕业，现为第一军医大学肝胆外科研究生，主要从事肝硬变及肝癌的基础及临床研究，发表论文5篇.
广东省自然科学基金资助项目，No.960362
项目负责人 王宇，510282，广东省广州市工业大道253号，中国人民解放军第一军医大学附属珠江医院肝胆外科.
Supported by the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No.960362
, http://www.100md.com
Correspondence to Yu Wang, Department of Hepatobiliary Surgery of Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
Tel. +86-20-85143556
收稿日期 1999-11-16 接收日期 2000-01-03
Gelatinase A proenzyme expression in the process of experimental liver fibrosis
Yu Wang, Yi Gao, Yu-Qi Huang, Jin-Long Yu and Shi-Gang Fang
, 百拇医药
Department of Hepatobiliary Surgery of Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282,Guangdong Province, China
Abstract
AIM To investigate the dynamic alteration of gelatinase A (metalloproteinase-2, mmp-2) proenzyme protein expression in the process of experimental liver fibrosis.
METHODS The carbon tetrachloride-induced hepatic fibrosis rat models was used. mmp-2 proenzyme protein expression in the different stages of liver fibrosis was measured by quantitative analysis of Western blot and immunohistochemical technique.
, 百拇医药
RESULTS mmp-2 proenzyme protein expression could be detected in normal rat liver. In the pathogenesis and development of liver fibrosis, mmp-2 proenzyme protein expression level was increased gradually, the expression rate being highest at an intermediate stage of fibrosis. And it decreased gradually during the late liver fibrosis and at stage of liver cirrhosis, but remained relatively high levels above normal. The expression of mmp-2 was located in sinusoidal cells, biliary ducts and capillary endothelial cells in the space of Disse, it was more intense around fibers in fibrous septa in liver cirrhosis.
, 百拇医药
CONCLUSION mmp-2 might participate in pathogenesis of liver fibrosis and cirrhosis as an important role.
Subject headings liver cirrhosis; gelatinase A; disease model, animal
Wang Y,Gao Y,Huang YQ,Yu JL,Fang SG.Gelatinase A proenzyme expression in the process of experimental liver fibrosis.
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,2000;8(2):165-167
, 百拇医药
摘要
目的 研究实验性肝纤维化过程中明胶酶A(mmp-2)酶原蛋白表达的动态变化.
方法 建立四氯化碳大鼠肝纤维化模型,采用Western印迹法和免疫组化方法,对肝纤维化不同阶段肝内mmp-2的酶原蛋白的表达水平与分布进行了检测.
结果 在正常大鼠肝组织中有mmp-2的酶原表达.在肝纤维化发生发展过程中mmp-2酶原蛋白表达水平逐渐增强,至肝纤维化中期到达最高峰,到肝纤维化晚期及肝硬变阶段其表达较中期下降,但仍高于正常对照水平.正常肝组织内,mmp-2的表达主要位于汇管区的胆管壁和毛细血管壁及肝窦壁的间质细胞;纤维化时,增生的纤维间隔附近亦有较高表达.
结论 mmp2在肝纤维化的发生、发展直至肝硬变形成过程中发挥着重要作用.
, 百拇医药
主题词 肝硬化;明胶酶原A;疾病模型,动物
王宇,高毅,黄宇琦,俞金龙,方石岗.明胶酶原A在实验性肝纤维化过程中表达变化.世界华人消化杂志,2000;8(2):165-167
0 引言
肝纤维化过程中，胶原纤维等细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的合成与降解是一个复杂的过程. 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一族参与降解ECM的主要水解蛋白酶，肝内发现了8种，其中明胶酶A(mmp-2)，即Mr72000的Ⅳ型胶原酶，主要参与基底膜Ⅳ型胶原的代谢，与肝纤维化的发生发展紧密相关[1]. 为了了解肝纤维化过程中mmp-2酶原表达变化，我们应用四氯化碳(CCl4)建立大鼠肝纤维化模型，通过免疫组化癢estern免疫印迹方法对肝内mmp-2酶原蛋白的表达分布和水平作了检测，现报道
, http://www.100md.com
如下.
1 材料和方法
1.1 材料 清洁型Wistar大鼠120只，雌雄各半，体质量180g～300g，第一军医大学实验动物中心提供. CCl4为汕头化工厂产品，含量>99.5%. APA免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司；蛋白抽提及定量试剂盒为Bio-Rad产品；mmp-2兔多克隆抗体由美国(NIH)William G. Stetler-Stevenson惠赠，辣根过氧化物酶标二抗(羊抗兔IgG-HRP)为华美公司产品. 电转膜仪为Bio-Rad公司产品；凝胶成象扫描分析系统系第一军医大学中心实验室提供的Gel Documentation Analysis System, GDAS.
1.2 方法
, http://www.100md.com
1.2.1 肝纤维化模型制备 参照Montfort et al[2]方法，400mL/L CCl4花生油溶液按2mL/kg予Wistar大鼠ip，2次/wk，共12wk. 120只大鼠随机分为模型组和正常对照组，模型组70只，按上述方法造模(死亡率7%)；正常对照组50只，用相应量生理盐水ip. 在0，2，5，7，9，12，14wk时，对照组活杀7只，模型组活杀9只，切取肝脏同一部分，迅速投入液氮，之后转入-70℃保存.
1.2.2 免疫组化方法 冻冻切片，厚3μm，应用APA即用型试剂盒，按说明书进行检测，DAB显色. MMP-2一抗工作浓度1∶200. 结果判断镜下观察棕黄着色为阳性.
1.2.3 蛋白质的提取及定量 参考Bio-Rad试剂盒说明书进行，并根据各个样品蛋白质A595值的差异行标准化处理.
, 百拇医药
1.2.4 Western印迹[3] 取等量标准化后的蛋白溶液加入等体积的2×SDS上样缓冲液并沸水煮约10min，使蛋白变性. 再取等量变性的蛋白溶液，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔上样量为25μL，并以电转膜仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜(90mA，1.5h)，经丽春红S染色鉴定并标记标准蛋白位置，再以50g/L脱脂奶粉封闭、一抗及二抗温育、DAB显色.
1.2.5 结果分析定量 硝酸纤维素膜显色条带为Mr72000的MMP-2酶原蛋白，对结果扫描定量分析.
统计学处理 扫描结果以X±s表示. 组内、组间比较采用单因素方差分析方法.
2 结果
, http://www.100md.com
2.1 免疫组化结果 MMP-2在正常肝组织有阳性着色，主要出现于汇管区的血管壁和胆管壁周围及肝窦周围的间质细胞(主要是内皮细胞和贮脂细胞). 当纤维化发生发展以及形成肝硬变时，阳性着色多集中于增生的纤维条索区域(成纤维细胞和贮脂细胞). 相比而言，随着肝纤维化的发展，mmp-2的阳性着色逐渐加强，至肝纤维化中晚期着色区域最广，着色最深，肝硬变阶段阳性着色又有所减低(图1～4).
2.2 Western blot结果 正常大鼠肝内有mmp-2酶原蛋白的表达，整个实验过程中正常对照组mmp-2酶原蛋白表达无显著性差异变化(P>0.05)，模型组大鼠随肝纤维化的发展(0wk～9wk)mmp-2酶原蛋白表达逐渐增强，至肝纤维化中期(9wk)达到高峰，肝纤维化晚期(12wk)及肝硬变阶段(14wk)又逐步下降，但仍高于对照组的表达水平(表1，图5，6).
, 百拇医药 图1 正常大鼠肝脏内MMP-2表达情况 10×
图2 4wk大鼠模型肝脏内MMP-2表达情况 10×
图3 9wk大鼠模型肝脏内MMP-2表达情况 4×
图4 14wk大鼠模型肝脏内MMP-2表达情况 4×
图5 对照组MMP-2 Western 印迹图.
图6 模型组MMP-2 Western 印迹图.
, 百拇医药
(从右至左M，A，B，C，D，E，F，G依次代表标准蛋白，0wk,2wk,5wk,7wk,9wk,12wk,14wk)
表1 大鼠CCl4性肝纤维化mmp-2酶原蛋白表达水平(X±s,×103)
| 分组 | 0wk | 2wk | 5wk | 7wk | 9wk | 12wk | 14wk |
| 对照组 | 30.40±1.78 | 32.15±1.51a | 31.41±1.02a | 31.09±2.64a | 31.26±1.44a | 32.12±1.16a | 31.89±1.85a |
| 模型组 | 31.82±2.92 | 38.10±5.15b | 49.98±10.04b | 88.47±7.25b | 158.25±10.28b | 134.11±14.82b | 121.03±10.89b |
, 百拇医药
aP>0.05vs 前期；bP<0.05vs 正常对照组,vs 前期.
3 讨论
肝内基质金属蛋白酶在损伤肝组织重建、修复以及纤维化中发挥着重要的作用. 明胶酶A是基质金属蛋白酶家族(MMPs)的主要成员之一，主要降解基底膜Ⅳ型胶原及明胶(变性胶原)等ECM，从而直接参与调节ECM合成与降解的动态平衡，与肝纤维化发生、发展及形成密切相关. 本实验以免疫组化和Western印迹方法从定位与定量两方面对肝纤维化不同阶段肝内明胶酶A(mmp-2)的酶原蛋白的分布与表达水平进行了检测. 结果表明集中于汇管区及肝窦周围的间质细胞，主要是贮脂细胞和内皮细胞，是mmp-2主要表达细胞；纤维化时，在增生的纤维间隔处的成纤维细胞和内皮细胞亦可合成mmp-2. 人的纤维化肝脏亦是如此[4]. 在正常肝组织有mmp-2的酶原蛋白表达，肝纤维化发生、发展过程中其表达逐渐增强，至肝纤维化中期达到高峰，肝纤维化晚期及肝硬变阶段又逐步下降，但仍高于正常对照的表达水平. 这与有关Ⅳ型胶原酶在肝纤维化过程中的活性变化研究结果是一致的[5]. 由于mmp-2这类破坏基底膜样胶原的胶原酶可降解正常肝脏结缔组织，所以其表达增高，会加强Disse腔内皮下基质的降解，破坏肝小叶排列，影响细胞与基质、细胞与细胞间的正常关系而促使肝纤维化的形成. 肝硬变阶段的mmp-2表达较肝纤维化中期有所下降，其原因可能是此时胶原的代谢活动已较肝纤维化阶段缓慢，机体通过自身的反馈调节使mmp-2表达下降. 关于mmp-2在肝纤维化发病机制中的意义还有待于进一步探讨. 显然通过调控mmp-2酶原表达干预肝内ECM的降解可能是治疗肝纤维化的新途径.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Iredale JP.Matrix turnover in fibrogenesis.Hepato Gastroen,1998;59:376-380
2 Montfort I,Perez Tamayo R.Collagenase in exprimental carbon tetrachloride cirrhosis of the liver.Am J Pathol,1978;92:411-420
3 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning laboratory manual.Second Edition.Beijing: Science Publishing House,1998：888-897
4 Takahara T,Furui K,Yata Y,Jin B,Zhang LP,Nambu S,Sato H,Seiki M,Watanabe A.Dual expression of matrix metalloproteinase 2
and membrane type 1 matrix metalloproteinase in fibrotic human livers.Hepatology,1997;26:1521-1529
5 Wang AM,Yang YW,Zhang B,Zhang ZY,Liang BZ,Sun ZZ. Type Ⅳ collagenases activity in the process of experimental
liver fibrosis.Zhonghua Ganzhangbing Zazhi,1998；6：98-99, 百拇医药(王宇 高毅 黄宇琦 俞金龙 方石岗)