胃康宁对大鼠胃癌VEGF表达的影响
中山医科大学中西医结合研究所 广东省广州市 510120
项目负责人 李庆明中山医科大学中西医结合研究所 广东省广州市 510120
收稿日期 1999-12-22 接收日期 2000-01-15
Subject headings Weikang-ning; stomach neoplasms/TCM therapy
主题词 胃康宁；胃肿瘤/中医药疗法；VEGF
胃康宁具有健脾化痰、清热解毒、理气活血、消瘀散结功效. 中药在临床上治疗胃癌有一定疗效[1]. 为此，我们进行了动物实验，研究胃康宁对大鼠实验性胃癌的防治作用，以及对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.
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1 材料和方法
1.1 材料 ①中药胃康宁制备：由党参、半枝莲、五灵脂等组成，功效：健脾化痰、清热解毒、理气活血、消瘀散结. 制成生药(g)：药液(mL)＝1(g)∶1(mL)浓度的制剂，加防腐剂苯甲酸(0.1g/100mL)、4℃冷藏保存，供大鼠灌胃之用. ②实验动物：♂ Wistar大鼠50只，2～3月龄，体质量120g～140g，清洁级，中山医科大学实验动物中心提供(广东省实验动物监测所检证字98A018). 饲养期wk40末处死全部大鼠并取材. 即时另购♂健康Wistar大白鼠2只，4月龄，体质量200g左右，作正常对照.
1.2 方法
1.2.1 大鼠实验性胃癌造模 ①造模方法：采用甲基硝基亚硝基胍(MNNG)限期给药饲饮法，予♂健康Wistar大白鼠每日自由饮用浓度为100μg/mL的MNNG水溶液24wk，再予饮用自来水16wk，实验时间共计40wk. ②分组及给药措施：对照组20只，MNNG限期给药饲饮法，胃康宁1组15只，MNNG限期给药饲饮法，加全程40wk每日生药灌胃10g/kg体质量的胃康宁. 胃康宁2组15只，MNNG限期给药饲饮法，加后16wk每日生药灌胃10g/kg体重的胃康宁. ③标本制备：先予灌注固定大鼠，经左心室穿刺至主动脉，用生理盐水100mL快冲血管床，用含40mL/L多聚甲醛的0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH 7.4，4℃)经升主动脉灌注，时间约1h. 剖腹取胃，沿胃大弯切开，生理盐水洗净，剪除前胃，将腺胃展平，暴露粘膜面，进行观察；在腺胃粘膜面仔细寻找，在有颜色异常和粟粒状结节处，则连同周围组织行条形切割，大小约15mm×2mm，可取多条组织，分置两处，置于25mL/L戊二醛(PBS液配制)4℃固定1h～2h，送电镜倚型干涞缇导觳椋恢糜讵0mL/L多聚甲醛固定12h，再入200g/L蔗糖PBS液24h，取出，石蜡包埋，切片后行病理检查(HE染色).
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1.2.2 VEGF表达检测 用免疫组化法：链霉菌抗生物毒蛋白-过氧化酶免疫组化染色试剂盒(加强型)(Ultra Vision SP-plus Kit)系福州迈新生物技术开发公司产品，第一抗体来源：Broad Spectrum；产品编号：Cat. No: Kit-9710/9720/9730. 染色程序：①连续石蜡切片，10张，厚度为10μm，随机选取3张，脱蜡至水；②30mL/L过氧化氢室温10min以消除内源性过氧化物酶活性；③蒸留水冲洗，2min×3次；④胰蛋白酶修复抗原：1g/L胰蛋白酶1mL入30mL 1g/L CaCl2中室温消化30min；⑤蒸留水冲洗，2min×3次；⑥每张切片上加入50μL的非免疫性动物血清,室温下孵育10min；⑦加第一抗体(VEGF单克隆抗体, 克隆号为SA-0472)，4℃, 过夜; 取出, 室温下30min；⑧PBS(pH=7.4)冲洗,5min×3次；⑨每张切片上加入50μL生物素标记的第一抗体, 室温下孵育10min; ⑩PBS(pH=7.4)冲洗, 5min×3次; 11每张切片上加入50μL链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶溶液,室温下孵育10min; 12PBS(pH=7.4)冲洗, 5min×3次; 13每张切片上加入100μL新鲜配制的DAB溶液, 显色5min～30min; B14自来水冲洗, 苏木素复染; B15透明中性树胶封固. 对照：PBS代替第一抗体作为阴性对照. 结果判定：以细胞质呈现明确的棕黄色颗粒状染色为阳性反应，并以此为目标进行真彩色图象分析处理，获得定量数据. 图象分析在中山医科大学图象分析室进行，设备条件：德国KONTRON IBAS2.5版本全自动分析系统；德国ZEISS AXIOTRON研究型显微镜，物镜：×20；图象输入：日本JVCKy-F30B 3-CCD彩色摄入仪.
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统计学处理 采用方差分析、两两比较法，本组数据经过方差齐性检验为方差齐，故采用两两比较法LSD法进行显著性检验. 由中山医科大学统计学教研室采用SPSS for Windows 7.0版统计软件进行统计学处理.
2 结果
2.1 大鼠胃肉眼所见 对照组胃粘膜面的颜色异常和粟粒状结节较为多见；胃康宁2组粘膜面亦有颜色异常和粟粒状结节，但较不多见；胃康宁1组粘膜面未见有粟粒状结节，颜色异常亦少见.
2.2 光镜所见(HE染色) 正常大鼠胃粘膜上皮细胞连接完整，腺管排列整齐；上皮细胞圆形，大小正常；细胞核圆形，染色正常；核质比正常. 胃康宁1组大鼠胃粘膜上皮细胞连接比较完整，腺管排列整齐；上皮细胞圆形，大小正常；细胞核圆形，染色正常；核质比正常. 胃康宁2组大鼠胃粘膜上皮细胞连接比较完整，腺管排列比较整齐；上皮细胞圆形，大小接近正常；细胞核圆形，染色基本正常；核质比基本正常. 对照组大鼠胃粘膜上皮细胞连接缺如，腺管排列紊乱；上皮细胞大小形状不一；细胞核异形性，胞核浓染；核质比增大.
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2.3 透射电镜所见 正常组大鼠胃粘膜组织中主细胞、壁细胞及内分泌细胞清晰可见，大小、形态正常，细胞结构正常. 胃康宁1组大鼠胃粘膜组织中，细胞数量少，腺腔完整，细胞分化良好，偶见未分化细胞，呈现细胞凋亡改变. 胃康宁2组大鼠胃粘膜组织中细胞量较多，核异形性. 对照组大鼠胃粘膜组织中细胞数明显增多，细胞小，分化程度低，核浓染，核异形性，腺腔不明显，细胞排列不规整，形态各异.
2.4 VEGF表达 胃康宁1组和胃康宁2组的VEGF表达量均较对照组明显减少，有非常显著性差异(P<0.01)；胃康宁1组与胃康宁2组间的VEGF表达量无显著性差异(P>0.05). 表明胃康宁具有显著抑制VEGF表达的效应(表1).
表1 各组大鼠胃粘膜细胞VEGF表达(x±s)
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aP<0.01 vs 对照组; bP>0.05 vs 胃康宁2组.
3 讨论
本研究采用MNNG饲喂Wistar ♂大鼠诱导生成胃腺癌，经病理切片检查，符合癌变特征[2]. 胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居各种恶性肿瘤之首，严重威胁着人民的生命健康. 目前胃癌的治疗主要依靠早期诊断、早期手术为主，适于胃癌的有效抗癌药物为数不多，疗效也不理想，其单一化疗的有效率仅为20%左右. 因此，寻找更有效的治疗手段也是当前研究的热点. 本课题根据胃癌的发生与气郁、痰积、脾虚、瘀毒等病理因素密切相关的认识，采用健脾化痰、清热解毒、理气活血、消瘀散结的中药复方胃康宁防治胃癌，取得一定疗效. 通过本实验，从病理检查及电镜检查表明，胃康宁具有防治MNNG诱导的大鼠胃粘膜组织细胞恶性表型的作用. 而且在预防组中尚发现未分化细胞呈细胞凋亡改变，是很有意义的. 同时通过免疫组化技术检测，胃康宁对大鼠实验性胃癌VEGF的表达均有明显抑制作用.
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血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)是近年来发现的一种促血管生长因子，它对于正常生理性血管生成和异常病理性血管形成都有着重要的调节作用. 血管内皮细胞的表面存在着VEGF受体，VEGF通过与VEGF受体结合而诱导血管内皮细胞的增殖
[3 ]. 还通过其他机制参与血管形成. VEGF在原位肿瘤的形成和生长以及转移瘤的形成中起着十分重要的作用. 在肿瘤生长过程中，血浆蛋白(如纤维蛋白原和纤溶酶原)从高渗透性的血管中外渗并凝固，形成纵横交错的纤维蛋白胶滞体，纤维蛋白的胶滞体为肿瘤细胞或炎症细胞和从邻近结缔组织来的再生血管提供暂时性基质，这种暂时基质最终降解并转化成胶原结缔组织，将无限地维持于肿瘤的生长[4]. VEGF的表达受到基因水平的调控，阻断VEGF与VEGF受体的结合及VEGF的信号转导，便可抑制VEGF的生理功能，从而抑制肿瘤的形成[5]. 本研究结果在对照组(造模组)VEGF呈高表达，显示了VEGF在胃癌发生，发展过程中的重要作用. 而在用药组(1组与2组)VEGF均呈低表达，表明胃康宁可显著抑制VEGF而阻止胃癌的发展浸润过程.其确切的机制，有待进一步研究.
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4 参考文献
1 李庆明. 中西医结合防治胃癌的研究进展. 现代消化病及内镜杂志，1997;2:30-33
2 邓大君, 朱少侠, 陈强. MNNG诱发新生大鼠胃癌模型的建立及其在胃癌发病机制研究上的应用. 中华病理学杂志，1994;23:293-295
3 Brock TA, Dvotak HF, Senger DR. Tumor-secreted vascular permeability factor increases cytosolic Ca2+ and von willebrand
factor release in human endothelial cells. Am J Pathol, 1991;138:213-221
4 李健. 血管内皮生长因子(VEGF)与肿瘤微环境. 国外医学临床生物化学与检验学分册，1997;(5):231-233
5 Hu DE, Fan TP. Suppression of VEGF-induced angiogenesis by the protein tyrosine Kinase inhibitor, lavendustin A.
Br J Pharmacol, 1995;114:262-268, 百拇医药(李庆明 余 谦 曾 敬 吴伟康)
项目负责人 李庆明中山医科大学中西医结合研究所 广东省广州市 510120
收稿日期 1999-12-22 接收日期 2000-01-15
Subject headings Weikang-ning; stomach neoplasms/TCM therapy
主题词 胃康宁；胃肿瘤/中医药疗法；VEGF
胃康宁具有健脾化痰、清热解毒、理气活血、消瘀散结功效. 中药在临床上治疗胃癌有一定疗效[1]. 为此，我们进行了动物实验，研究胃康宁对大鼠实验性胃癌的防治作用，以及对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.
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1 材料和方法
1.1 材料 ①中药胃康宁制备：由党参、半枝莲、五灵脂等组成，功效：健脾化痰、清热解毒、理气活血、消瘀散结. 制成生药(g)：药液(mL)＝1(g)∶1(mL)浓度的制剂，加防腐剂苯甲酸(0.1g/100mL)、4℃冷藏保存，供大鼠灌胃之用. ②实验动物：♂ Wistar大鼠50只，2～3月龄，体质量120g～140g，清洁级，中山医科大学实验动物中心提供(广东省实验动物监测所检证字98A018). 饲养期wk40末处死全部大鼠并取材. 即时另购♂健康Wistar大白鼠2只，4月龄，体质量200g左右，作正常对照.
1.2 方法
1.2.1 大鼠实验性胃癌造模 ①造模方法：采用甲基硝基亚硝基胍(MNNG)限期给药饲饮法，予♂健康Wistar大白鼠每日自由饮用浓度为100μg/mL的MNNG水溶液24wk，再予饮用自来水16wk，实验时间共计40wk. ②分组及给药措施：对照组20只，MNNG限期给药饲饮法，胃康宁1组15只，MNNG限期给药饲饮法，加全程40wk每日生药灌胃10g/kg体质量的胃康宁. 胃康宁2组15只，MNNG限期给药饲饮法，加后16wk每日生药灌胃10g/kg体重的胃康宁. ③标本制备：先予灌注固定大鼠，经左心室穿刺至主动脉，用生理盐水100mL快冲血管床，用含40mL/L多聚甲醛的0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH 7.4，4℃)经升主动脉灌注，时间约1h. 剖腹取胃，沿胃大弯切开，生理盐水洗净，剪除前胃，将腺胃展平，暴露粘膜面，进行观察；在腺胃粘膜面仔细寻找，在有颜色异常和粟粒状结节处，则连同周围组织行条形切割，大小约15mm×2mm，可取多条组织，分置两处，置于25mL/L戊二醛(PBS液配制)4℃固定1h～2h，送电镜倚型干涞缇导觳椋恢糜讵0mL/L多聚甲醛固定12h，再入200g/L蔗糖PBS液24h，取出，石蜡包埋，切片后行病理检查(HE染色).
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1.2.2 VEGF表达检测 用免疫组化法：链霉菌抗生物毒蛋白-过氧化酶免疫组化染色试剂盒(加强型)(Ultra Vision SP-plus Kit)系福州迈新生物技术开发公司产品，第一抗体来源：Broad Spectrum；产品编号：Cat. No: Kit-9710/9720/9730. 染色程序：①连续石蜡切片，10张，厚度为10μm，随机选取3张，脱蜡至水；②30mL/L过氧化氢室温10min以消除内源性过氧化物酶活性；③蒸留水冲洗，2min×3次；④胰蛋白酶修复抗原：1g/L胰蛋白酶1mL入30mL 1g/L CaCl2中室温消化30min；⑤蒸留水冲洗，2min×3次；⑥每张切片上加入50μL的非免疫性动物血清,室温下孵育10min；⑦加第一抗体(VEGF单克隆抗体, 克隆号为SA-0472)，4℃, 过夜; 取出, 室温下30min；⑧PBS(pH=7.4)冲洗,5min×3次；⑨每张切片上加入50μL生物素标记的第一抗体, 室温下孵育10min; ⑩PBS(pH=7.4)冲洗, 5min×3次; 11每张切片上加入50μL链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶溶液,室温下孵育10min; 12PBS(pH=7.4)冲洗, 5min×3次; 13每张切片上加入100μL新鲜配制的DAB溶液, 显色5min～30min; B14自来水冲洗, 苏木素复染; B15透明中性树胶封固. 对照：PBS代替第一抗体作为阴性对照. 结果判定：以细胞质呈现明确的棕黄色颗粒状染色为阳性反应，并以此为目标进行真彩色图象分析处理，获得定量数据. 图象分析在中山医科大学图象分析室进行，设备条件：德国KONTRON IBAS2.5版本全自动分析系统；德国ZEISS AXIOTRON研究型显微镜，物镜：×20；图象输入：日本JVCKy-F30B 3-CCD彩色摄入仪.
, http://www.100md.com
统计学处理 采用方差分析、两两比较法，本组数据经过方差齐性检验为方差齐，故采用两两比较法LSD法进行显著性检验. 由中山医科大学统计学教研室采用SPSS for Windows 7.0版统计软件进行统计学处理.
2 结果
2.1 大鼠胃肉眼所见 对照组胃粘膜面的颜色异常和粟粒状结节较为多见；胃康宁2组粘膜面亦有颜色异常和粟粒状结节，但较不多见；胃康宁1组粘膜面未见有粟粒状结节，颜色异常亦少见.
2.2 光镜所见(HE染色) 正常大鼠胃粘膜上皮细胞连接完整，腺管排列整齐；上皮细胞圆形，大小正常；细胞核圆形，染色正常；核质比正常. 胃康宁1组大鼠胃粘膜上皮细胞连接比较完整，腺管排列整齐；上皮细胞圆形，大小正常；细胞核圆形，染色正常；核质比正常. 胃康宁2组大鼠胃粘膜上皮细胞连接比较完整，腺管排列比较整齐；上皮细胞圆形，大小接近正常；细胞核圆形，染色基本正常；核质比基本正常. 对照组大鼠胃粘膜上皮细胞连接缺如，腺管排列紊乱；上皮细胞大小形状不一；细胞核异形性，胞核浓染；核质比增大.
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2.3 透射电镜所见 正常组大鼠胃粘膜组织中主细胞、壁细胞及内分泌细胞清晰可见，大小、形态正常，细胞结构正常. 胃康宁1组大鼠胃粘膜组织中，细胞数量少，腺腔完整，细胞分化良好，偶见未分化细胞，呈现细胞凋亡改变. 胃康宁2组大鼠胃粘膜组织中细胞量较多，核异形性. 对照组大鼠胃粘膜组织中细胞数明显增多，细胞小，分化程度低，核浓染，核异形性，腺腔不明显，细胞排列不规整，形态各异.
2.4 VEGF表达 胃康宁1组和胃康宁2组的VEGF表达量均较对照组明显减少，有非常显著性差异(P<0.01)；胃康宁1组与胃康宁2组间的VEGF表达量无显著性差异(P>0.05). 表明胃康宁具有显著抑制VEGF表达的效应(表1).
表1 各组大鼠胃粘膜细胞VEGF表达(x±s)
| 组别 | n | VEGF(目标面积μm2/视场面积μm2) |
| 胃康宁1组 | 12 | 3.3779±3.5450a |
| 胃康宁2组 | 11 | 3.5190±2.2041b |
| 对照组 | 17 | 5.7000±3.1884 |
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aP<0.01 vs 对照组; bP>0.05 vs 胃康宁2组.
3 讨论
本研究采用MNNG饲喂Wistar ♂大鼠诱导生成胃腺癌，经病理切片检查，符合癌变特征[2]. 胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居各种恶性肿瘤之首，严重威胁着人民的生命健康. 目前胃癌的治疗主要依靠早期诊断、早期手术为主，适于胃癌的有效抗癌药物为数不多，疗效也不理想，其单一化疗的有效率仅为20%左右. 因此，寻找更有效的治疗手段也是当前研究的热点. 本课题根据胃癌的发生与气郁、痰积、脾虚、瘀毒等病理因素密切相关的认识，采用健脾化痰、清热解毒、理气活血、消瘀散结的中药复方胃康宁防治胃癌，取得一定疗效. 通过本实验，从病理检查及电镜检查表明，胃康宁具有防治MNNG诱导的大鼠胃粘膜组织细胞恶性表型的作用. 而且在预防组中尚发现未分化细胞呈细胞凋亡改变，是很有意义的. 同时通过免疫组化技术检测，胃康宁对大鼠实验性胃癌VEGF的表达均有明显抑制作用.
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血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)是近年来发现的一种促血管生长因子，它对于正常生理性血管生成和异常病理性血管形成都有着重要的调节作用. 血管内皮细胞的表面存在着VEGF受体，VEGF通过与VEGF受体结合而诱导血管内皮细胞的增殖
[3 ]. 还通过其他机制参与血管形成. VEGF在原位肿瘤的形成和生长以及转移瘤的形成中起着十分重要的作用. 在肿瘤生长过程中，血浆蛋白(如纤维蛋白原和纤溶酶原)从高渗透性的血管中外渗并凝固，形成纵横交错的纤维蛋白胶滞体，纤维蛋白的胶滞体为肿瘤细胞或炎症细胞和从邻近结缔组织来的再生血管提供暂时性基质，这种暂时基质最终降解并转化成胶原结缔组织，将无限地维持于肿瘤的生长[4]. VEGF的表达受到基因水平的调控，阻断VEGF与VEGF受体的结合及VEGF的信号转导，便可抑制VEGF的生理功能，从而抑制肿瘤的形成[5]. 本研究结果在对照组(造模组)VEGF呈高表达，显示了VEGF在胃癌发生，发展过程中的重要作用. 而在用药组(1组与2组)VEGF均呈低表达，表明胃康宁可显著抑制VEGF而阻止胃癌的发展浸润过程.其确切的机制，有待进一步研究.
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4 参考文献
1 李庆明. 中西医结合防治胃癌的研究进展. 现代消化病及内镜杂志，1997;2:30-33
2 邓大君, 朱少侠, 陈强. MNNG诱发新生大鼠胃癌模型的建立及其在胃癌发病机制研究上的应用. 中华病理学杂志，1994;23:293-295
3 Brock TA, Dvotak HF, Senger DR. Tumor-secreted vascular permeability factor increases cytosolic Ca2+ and von willebrand
factor release in human endothelial cells. Am J Pathol, 1991;138:213-221
4 李健. 血管内皮生长因子(VEGF)与肿瘤微环境. 国外医学临床生物化学与检验学分册，1997;(5):231-233
5 Hu DE, Fan TP. Suppression of VEGF-induced angiogenesis by the protein tyrosine Kinase inhibitor, lavendustin A.
Br J Pharmacol, 1995;114:262-268, 百拇医药(李庆明 余 谦 曾 敬 吴伟康)