中性粒细胞多肽体外杀伤胃癌细胞活性观察
中国人民解放军第四军医大学西京医院 1肿瘤中心 2消化疾病研究所 陕西省西安市 710032
军队医药卫生科研基金资助课题，No.98Q066
项目负责人 刘文超中国人民解放军第四军医大学西京医院肿瘤中心
收稿日期 1999-11-16 接收日期 2000-01-05
Subject headings defensins; stomach neoplasm; neutrophil peptides
, 百拇医药 主题词 防御素；胃肿瘤；中性粒细胞多肽
防御素(defensins)是一组具有抗微生物活性和细胞毒活性的多肽，相对分子质量3000～4000，包括人中性粒细胞多肽(human neutrophil peptides, HNP). HNP占多形核中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils，PMNs)总蛋白/肽量的5%，含量4～6pg/PMN[1]，目前在国内外文献中有关防御素对胃癌细胞的毒性作用研究未见报道. 本研究目的在于观察HNP对胃癌细胞系的毒性作用，并探讨其毒性作用机制.
1 材料和方法
1.1 材料 人胃癌细胞系SGC-7901由军事医学科学院惠赠，小牛血清购自华美公司，RPMI1640培养基为Gibco产品，MTT及二甲基亚砜(DMSO)为Sigma产品，ELISA检测仪DG-3022为南京华东电子管厂产品，流式细胞仪为Coulter Int.产品，HNP如文献所述方法[2]获得.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 细胞毒性作用 采用MTT法[3]. 将SGC-7901细胞接种于96孔细胞培养板，每孔1×104个细胞，37℃孵箱中培养过夜后，分别加入不同浓度的HNP，使HNP终质量浓度分别为10，20，40，60，80，100mg/L，每一质量浓度均做2个复孔，并设未加HNP为对照孔，及未接种细胞为空白孔. 37℃孵箱中培养，分别于4，6，8，10，12h加入MTT 100μg，37℃孵育4h，弃上清液，每孔加入150μL DMSO，振荡后测每孔A90值，计算杀伤率. 采用随机单位组方差分析进行统计学处理.
1- 处理孔A490 / 对照孔A490 ×100%
, 百拇医药
1.2.2 流式细胞仪分析 分别取常规条件下培养的SGC-7901细胞，经PBS洗涤、离心后，将细胞注入振荡的-20℃，700mL/L乙醇中固定，制成单细胞悬液，经DNA荧光染色后上流式细胞仪，进行细胞周期分析. 采用团体t检验进行统计学处理.
2 结果
2.1 细胞毒性作用结果 实验结果显示，各个不同HNP浓度组间具有非常显著性差异(P<0.01)，杀伤作用随着HNP浓度的增高而增强(图1). 比较各个时间组的杀伤作用，也具有非常显著性差异(P<0.01)，并且其杀伤作用随着时间的延长而增强(图2)，提示HNP对SGC-7901细胞的杀伤与HNP的质量浓度和时间呈高度正相关，在80mg/L～100mg/L,10h，杀伤率达90%～97%.
, 百拇医药
图1 HNP对SGC-7901细胞杀伤的剂量依赖性.
图2 HNP对SGC-7901细胞杀伤的时间依赖性.
2.2 流式细胞仪分析结果 经过HNP作用后的SGC-7901细胞周期，与对照组相比，其G1，G2期变化不显著(P>0.05，表1)，而S期则略有减少(0.01
表1 HNP作用于SGS-7901细胞的流式细胞仪分析(n=3, x±s)
, 百拇医药
aP<0.05, vs 对照组.
3 讨论
细胞毒活性是防御素的一大重要特性[4]. 一些体外研究发现，防御素对白血病细胞系淋巴瘤细胞系[5,6]及实体瘤神经母细胞瘤细胞[7]具有毒性作用. 我们采用MTT法观察了HNP对胃癌细胞系SGC-7901细胞的毒性作用，发现该毒性作用呈剂量依赖及时间依赖性，这与文献报道所观察到的结果一致.
关于HNP的细胞毒性作用机制尚不十分清楚，一些实验研究发现，HNP作用于靶细胞膜，使胞膜通透性改变，最终导致靶细胞死亡[8,9]. 此外，它还可能诱导DNA单链断裂[10]. 我们在实验中应用流式细胞术进行细胞周期分析，发现SGC-7901细胞在经过HNP作用后，其S期细胞比例有所减少，考虑可能为处于DNA合成期的细胞对HNP更敏感，或是HNP对细胞S期具有延迟或阻抑作用.
, 百拇医药
4 参考文献
1 刘文超，张学庸，胡家露. 中性粒细胞的抗微生物多肽. 第四军医大学学报，1996；17(增)：23-25
2 刘文超，刘智广，张晓楠，胡家露，张学庸. 液相色谱法纯化人中性粒细胞防御素. 第四军医大学学报，1997；18：525-527
3 Murphy CJ, Foster BA, Manis MJ, Selsted ME, Reid TW. Defensins are mitogenic for epithelial cells and fibroblasts.
J Cell Physiol, 1993;155:408-413
, 百拇医药 4 Lehrer RI, Lichtenstein AK, Ganz T. Defensins: antimicrobial and cytotoxic peptides of mammalian cell.
Annu Rev Immunol, 1993;11:105-112
5 Lichtenstein AK, Ganz T, Selsted ME, Lehrer RI. In vitro tumor cell cytolysis mediated by peptide defensins of human and
rabbit granulocytes. Blood, 1986;68:1407-1410
6 Lichtenstein AK, Ganz T, Nguyen TM, Selsted ME, Lehrer RI. Mechanism of target cytolysis by peptide defensins.
, 百拇医药
J Immunol, 1988;140:2689-2694
7 Barker E, Reisfeld RA. A mechanism for neutrophil-mediated lysis of human neuroblastoma cells. Cancer Res, 1993;53:362-367
8 Wimley WC, Selsted ME, White SH. Interactions between human defensins and lipid bilayers: evidence for formation of
multimeric pores. Protein Sci, 1994;3:1362-1373
9 White SH, Wimley WC, Selsted ME. Structure, function, and membrane integration of defensins.
Curr Opin Struct Biol, 1995;5:521-527
10 Gera JF, Lichtenstein AK. Human neutrophil peptide defensins induce single strand DNA breaks in target cells.
Cell Immunol, 1991;138:108-120, 百拇医药(刘文超1 任 军1 张学庸2)
军队医药卫生科研基金资助课题，No.98Q066
项目负责人 刘文超中国人民解放军第四军医大学西京医院肿瘤中心
收稿日期 1999-11-16 接收日期 2000-01-05
Subject headings defensins; stomach neoplasm; neutrophil peptides
, 百拇医药 主题词 防御素；胃肿瘤；中性粒细胞多肽
防御素(defensins)是一组具有抗微生物活性和细胞毒活性的多肽，相对分子质量3000～4000，包括人中性粒细胞多肽(human neutrophil peptides, HNP). HNP占多形核中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils，PMNs)总蛋白/肽量的5%，含量4～6pg/PMN[1]，目前在国内外文献中有关防御素对胃癌细胞的毒性作用研究未见报道. 本研究目的在于观察HNP对胃癌细胞系的毒性作用，并探讨其毒性作用机制.
1 材料和方法
1.1 材料 人胃癌细胞系SGC-7901由军事医学科学院惠赠，小牛血清购自华美公司，RPMI1640培养基为Gibco产品，MTT及二甲基亚砜(DMSO)为Sigma产品，ELISA检测仪DG-3022为南京华东电子管厂产品，流式细胞仪为Coulter Int.产品，HNP如文献所述方法[2]获得.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 细胞毒性作用 采用MTT法[3]. 将SGC-7901细胞接种于96孔细胞培养板，每孔1×104个细胞，37℃孵箱中培养过夜后，分别加入不同浓度的HNP，使HNP终质量浓度分别为10，20，40，60，80，100mg/L，每一质量浓度均做2个复孔，并设未加HNP为对照孔，及未接种细胞为空白孔. 37℃孵箱中培养，分别于4，6，8，10，12h加入MTT 100μg，37℃孵育4h，弃上清液，每孔加入150μL DMSO，振荡后测每孔A90值，计算杀伤率. 采用随机单位组方差分析进行统计学处理.
1- 处理孔A490 / 对照孔A490 ×100%
, 百拇医药
1.2.2 流式细胞仪分析 分别取常规条件下培养的SGC-7901细胞，经PBS洗涤、离心后，将细胞注入振荡的-20℃，700mL/L乙醇中固定，制成单细胞悬液，经DNA荧光染色后上流式细胞仪，进行细胞周期分析. 采用团体t检验进行统计学处理.
2 结果
2.1 细胞毒性作用结果 实验结果显示，各个不同HNP浓度组间具有非常显著性差异(P<0.01)，杀伤作用随着HNP浓度的增高而增强(图1). 比较各个时间组的杀伤作用，也具有非常显著性差异(P<0.01)，并且其杀伤作用随着时间的延长而增强(图2)，提示HNP对SGC-7901细胞的杀伤与HNP的质量浓度和时间呈高度正相关，在80mg/L～100mg/L,10h，杀伤率达90%～97%.
, 百拇医药
图1 HNP对SGC-7901细胞杀伤的剂量依赖性.
图2 HNP对SGC-7901细胞杀伤的时间依赖性.
2.2 流式细胞仪分析结果 经过HNP作用后的SGC-7901细胞周期，与对照组相比，其G1，G2期变化不显著(P>0.05，表1)，而S期则略有减少(0.01
表1 HNP作用于SGS-7901细胞的流式细胞仪分析(n=3, x±s)
| 细胞周期 | 对照组 | 实验组 |
| G1期 | 62.7±3.0 | 63.6±1.1 |
| G2期 | 14.9±1.8 | 16.6±0.8 |
| S 期 | 22.4±1.3 | 19.9±0.6a |
, 百拇医药
aP<0.05, vs 对照组.
3 讨论
细胞毒活性是防御素的一大重要特性[4]. 一些体外研究发现，防御素对白血病细胞系淋巴瘤细胞系[5,6]及实体瘤神经母细胞瘤细胞[7]具有毒性作用. 我们采用MTT法观察了HNP对胃癌细胞系SGC-7901细胞的毒性作用，发现该毒性作用呈剂量依赖及时间依赖性，这与文献报道所观察到的结果一致.
关于HNP的细胞毒性作用机制尚不十分清楚，一些实验研究发现，HNP作用于靶细胞膜，使胞膜通透性改变，最终导致靶细胞死亡[8,9]. 此外，它还可能诱导DNA单链断裂[10]. 我们在实验中应用流式细胞术进行细胞周期分析，发现SGC-7901细胞在经过HNP作用后，其S期细胞比例有所减少，考虑可能为处于DNA合成期的细胞对HNP更敏感，或是HNP对细胞S期具有延迟或阻抑作用.
, 百拇医药
4 参考文献
1 刘文超，张学庸，胡家露. 中性粒细胞的抗微生物多肽. 第四军医大学学报，1996；17(增)：23-25
2 刘文超，刘智广，张晓楠，胡家露，张学庸. 液相色谱法纯化人中性粒细胞防御素. 第四军医大学学报，1997；18：525-527
3 Murphy CJ, Foster BA, Manis MJ, Selsted ME, Reid TW. Defensins are mitogenic for epithelial cells and fibroblasts.
J Cell Physiol, 1993;155:408-413
, 百拇医药 4 Lehrer RI, Lichtenstein AK, Ganz T. Defensins: antimicrobial and cytotoxic peptides of mammalian cell.
Annu Rev Immunol, 1993;11:105-112
5 Lichtenstein AK, Ganz T, Selsted ME, Lehrer RI. In vitro tumor cell cytolysis mediated by peptide defensins of human and
rabbit granulocytes. Blood, 1986;68:1407-1410
6 Lichtenstein AK, Ganz T, Nguyen TM, Selsted ME, Lehrer RI. Mechanism of target cytolysis by peptide defensins.
, 百拇医药
J Immunol, 1988;140:2689-2694
7 Barker E, Reisfeld RA. A mechanism for neutrophil-mediated lysis of human neuroblastoma cells. Cancer Res, 1993;53:362-367
8 Wimley WC, Selsted ME, White SH. Interactions between human defensins and lipid bilayers: evidence for formation of
multimeric pores. Protein Sci, 1994;3:1362-1373
9 White SH, Wimley WC, Selsted ME. Structure, function, and membrane integration of defensins.
Curr Opin Struct Biol, 1995;5:521-527
10 Gera JF, Lichtenstein AK. Human neutrophil peptide defensins induce single strand DNA breaks in target cells.
Cell Immunol, 1991;138:108-120, 百拇医药(刘文超1 任 军1 张学庸2)