检测凝血酶原前体蛋白判断维生素K营养状况
1 河北医科大学第二医院儿科 河北省石家庄市 050000
2河北医科大学第二医院免疫室
3伦敦圣托马斯医院维生素K研究室
河北省科研基金资助，NO.982763020
项目负责人 张会丰 河北医科大学第二医院儿科 河北省石家庄市 050000
Tel/Fax. +86-311-7046901 Ext.8648
Email. Hfzhang＠sj-user.he.cninfo.net
, http://www.100md.com
收稿日期 1999-09-22 接收日期 1999-12-02
Subject headings PIVKA-Ⅱ; vitamin K; nutrition condition; enzyme linked immunosorbent assay; antibody， monoclonal
主题词 凝血酶原前体蛋白；维生素K；营养状况；酶联免疫吸附测定；单克隆，抗体
至今尚无理想指标评价机体的Vit K营养状况. 当Vit K缺乏或使用拮抗剂时，血清中检测到一组蛋白质，并称之为Vit K缺乏或Vit K拮抗剂诱生蛋白(proteins induced by Vitamin K absence or antagonism， 简称PIVKA)，其中凝血酶原前体蛋白(PIVKA-Ⅱ)变化最明显. 目前国际上已把PIVKA-Ⅱ作为生化水平反映机体Vit K营养状况最敏感的指标[1]. 我们使用PIVKA-Ⅱ的单克隆抗体(mAb)率先在国内建立了PIVKA-Ⅱ检测的ELISA法，以推动我国Vit K营养问题的研究.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 正常新生儿34例，其母无胃肠疾患和肝功能异常，饮食正常，均未使用抗生素，于分娩后采集新生儿脐静脉血3mL，不抗凝，室温放置3h，离心3500r/min，10min，分离血清，置-20℃冰箱保存. PIVKA-Ⅱ mAb(Martin J. Shearer教授惠赠)，兔抗人凝血酶原抗体(Dako公司)，辣根标记的羊抗兔IgG(Sigma公司)，包被液pH 9.6 0.05mol/L碳酸盐缓冲液，洗涤液pH 7.5 0.02 Tris-0.15mol/L NaCl-1g/L Tween，标本稀释液40mL洗涤液加入0.123g乳酸钙，底物稀释液pH 5.0 0.1mol/L磷酸盐-柠檬酸缓冲液，底物邻苯二胺(Sigma公司)，终止液1.0mol/L硫酸，全自动酶标仪(Clinibio 128C，奥地利)，全自动洗板机(DEM-Ⅱ，北京).
, http://www.100md.com 1.2 方法 用碳酸盐缓冲液稀释C4B6 mAb为5μg/L，每孔加100μL稀释后抗体，4℃，16h. 制作标准曲线：PIVKA-Ⅱ标准血清(37kAU/L)，用正常血清稀释至浓度为10kAU/L，-20℃冰箱保存备用. 取浓度为10kAU/L的标准血清用标本稀释液做倍比系列稀释. 用标本稀释液稀释待测标本和质控血清，取聚苯乙烯酶标板，吸干、取标本、质控、空白、和标准血清各100μL(双孔)，加到酶标板微孔. 室温，孵育1h. 用洗涤液洗板4次，吸干，用标本稀释液稀释兔抗人凝血酶原抗体，1∶4000倍，取100μL加入每孔中，室温孵育30min. 用洗涤液洗板4次，吸干，用标本稀释液稀释辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG，1∶2000，取100μL加入每孔中，室温孵育30min，用洗涤液洗板4次，吸干，各孔加100μL底物溶液，室温孵育4min，加终止液100μL测A，检测波长为490nm. 每孔A减去空白A，以A对PIVKA-Ⅱ绘制标准曲线(图1)，得出每孔PIVKA-Ⅱ含量.
, 百拇医药
图1 凝血酶原前体蛋白ELISA标准曲线.
2 结果
图1为典型的测定PIVKA-Ⅱ含量的标准曲线(双对数的4参数逻辑曲线). 通过零标准，计算A，再加两个标准差，得出本方法的最小检出值是0.15kAU/L. 重复检测9份第1次阳性新生儿脐血标本，得出本实验室批间变异系数为9.85%；4份不同浓度的阳性血清，重复5孔，得出批内变异为5.16%；4份标准的阴性血清中依次加入不同浓度的阳性标准血清，求得总回吸收率为99.8%. 在检测的34例新生儿脐血标本中，9例PIVKA-Ⅱ含量高于0.15AU/mL阳性率为26%(9/34)，范围0.181kAU/L～2.650kAU/L. 正常参考值小于0.15kAU/L. 检测时间2h.
, 百拇医药
3 讨论
Shearer[2]认为，以凝血酶原前体蛋白的检测了解机体的Vit K营养状况较凝血酶原时间敏感1000倍，在常规凝血试验未出现变化之前PIVKA-Ⅱ即可在血液中检测到，它反映机体亚临床Vit K缺乏阶段. 当机体生化水平Vit K缺乏时，PIVKA-Ⅱ出现，而此时这些功能性指标如依赖VitK的凝血因子含量或凝血酶原时间、部分凝血活酶时间、凝血试验、Normotest等尚无变化. 从抗原特点看，PIVKA-Ⅱ和凝血酶原相近，但有部分抗原决定簇不同，从功能特点看，凝血酶原前体蛋白无凝血活性. 依赖Vit K的凝血因子包括Ⅱ，Ⅶ，Ⅸ，Ⅹ. 由于凝血酶原在血中浓度最高，因此阐述Vit K的作用机制多以凝血酶原为代表. 凝血酶原前体蛋白在肝细胞微粒体中由羧化酶催化、Vit K为辅酶PIVKA-Ⅱ氨基末端的谷氨酸(Glu)转变为γ-羧基谷氨酸(Gla)，γ-羧基谷氨酸具有结合二价金属离子如Ca2+的能力，γ-羧基谷氨酸为凝血酶原提供了Ca2+结合位点，此时PIVKA-Ⅱ成为有活性的凝血酶原. PIVKA-Ⅱ在肝脏不断产生，PIVKA-Ⅱ本身的生物合成不受Vit K影响. 在羧化酶功能正常和Vit K存在时PIVKA-Ⅱ全部转变为凝血酶原，血液中不能检测到PIVKA-Ⅱ. 当用于肝脏完成羧化反应所需Vit K缺乏或使用Vit K拮抗剂时，PIVKA-Ⅱ则不能完全转化为凝血酶原，PIVKA-Ⅱ出现在循环血液中，因此，PIVKA-Ⅱ出现是与Vit K缺乏状况同步的.
, 百拇医药
PIVKA-Ⅱ的检测经历了间接到直接，定性、半定量到微量测定的过程. 间接定量技术是根据PIVKA-Ⅱ与凝血酶原化学结构的差异所表现的化学特性不同而设计的. 氢氧化铝凝胶及钡盐能吸附掉血浆中的凝血酶原，而PIVKA-Ⅱ不被吸附. 鉴于PIVKA-Ⅱ分子的氨基末段与凝血酶原不同，可制备与凝血酶原无交叉反应的mAb，利用特异性抗体直接检测PIVKA-Ⅱ含量. Belle et al[3]生产了新一类mAb即C4B6，我们所建立的方法就是使用该mAb. 基于mAb的ELISA法是最特异、敏感的方法，理论上讲Vit K营养充足的人群其血中检测不到PIVKA-Ⅱ，只要血循环中检测到PIVKA-Ⅱ就表示机体存在Vit K缺乏，因此，PIVKA-Ⅱ是判断机体Vit K营养状况的理想指标. 由于胎盘屏障的存在母体血液中的Vit K不易通过胎盘到达胎儿体内，母血和胎儿血有较大的浓度梯度差异，部分新生儿脐血检测不到Vit K[4]，这预示着新生儿处于Vit K缺乏的状态. 从我们对34例新生儿的脐血PIVKA-Ⅱ检测来看，有1/4的新生儿存在维生素K缺乏情况，这为为什么新生儿容易发生出血症提供了理论依据.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Shearer MJ. Vitamin K: its physiological role and the assessment of clinical and subclinical deficiency states. JIFCC，
1995;7:88-95
2 Shearer MJ. Vitamin K. Lancet， 1995;345:229-234
3 Belle M， Brebant R， Guinet R， Leclercq M. Production of a new monoclonal antibody specific to
human des-gamma-carboxyprothrombin in the presence of calcium ions. Application to the development of a sensitive ELISA-test.
J Immunoassay， 1995;16:213-229
4 Shearer MJ. Vitamin K metabolism and nutriture. Blood Rev， 1992;6:92, http://www.100md.com(张会丰1 王丽芳2 范士英2 Julia Harvey3 Martin J. Shearer3)
2河北医科大学第二医院免疫室
3伦敦圣托马斯医院维生素K研究室
河北省科研基金资助，NO.982763020
项目负责人 张会丰 河北医科大学第二医院儿科 河北省石家庄市 050000
Tel/Fax. +86-311-7046901 Ext.8648
Email. Hfzhang＠sj-user.he.cninfo.net
, http://www.100md.com
收稿日期 1999-09-22 接收日期 1999-12-02
Subject headings PIVKA-Ⅱ; vitamin K; nutrition condition; enzyme linked immunosorbent assay; antibody， monoclonal
主题词 凝血酶原前体蛋白；维生素K；营养状况；酶联免疫吸附测定；单克隆，抗体
至今尚无理想指标评价机体的Vit K营养状况. 当Vit K缺乏或使用拮抗剂时，血清中检测到一组蛋白质，并称之为Vit K缺乏或Vit K拮抗剂诱生蛋白(proteins induced by Vitamin K absence or antagonism， 简称PIVKA)，其中凝血酶原前体蛋白(PIVKA-Ⅱ)变化最明显. 目前国际上已把PIVKA-Ⅱ作为生化水平反映机体Vit K营养状况最敏感的指标[1]. 我们使用PIVKA-Ⅱ的单克隆抗体(mAb)率先在国内建立了PIVKA-Ⅱ检测的ELISA法，以推动我国Vit K营养问题的研究.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 正常新生儿34例，其母无胃肠疾患和肝功能异常，饮食正常，均未使用抗生素，于分娩后采集新生儿脐静脉血3mL，不抗凝，室温放置3h，离心3500r/min，10min，分离血清，置-20℃冰箱保存. PIVKA-Ⅱ mAb(Martin J. Shearer教授惠赠)，兔抗人凝血酶原抗体(Dako公司)，辣根标记的羊抗兔IgG(Sigma公司)，包被液pH 9.6 0.05mol/L碳酸盐缓冲液，洗涤液pH 7.5 0.02 Tris-0.15mol/L NaCl-1g/L Tween，标本稀释液40mL洗涤液加入0.123g乳酸钙，底物稀释液pH 5.0 0.1mol/L磷酸盐-柠檬酸缓冲液，底物邻苯二胺(Sigma公司)，终止液1.0mol/L硫酸，全自动酶标仪(Clinibio 128C，奥地利)，全自动洗板机(DEM-Ⅱ，北京).
, http://www.100md.com 1.2 方法 用碳酸盐缓冲液稀释C4B6 mAb为5μg/L，每孔加100μL稀释后抗体，4℃，16h. 制作标准曲线：PIVKA-Ⅱ标准血清(37kAU/L)，用正常血清稀释至浓度为10kAU/L，-20℃冰箱保存备用. 取浓度为10kAU/L的标准血清用标本稀释液做倍比系列稀释. 用标本稀释液稀释待测标本和质控血清，取聚苯乙烯酶标板，吸干、取标本、质控、空白、和标准血清各100μL(双孔)，加到酶标板微孔. 室温，孵育1h. 用洗涤液洗板4次，吸干，用标本稀释液稀释兔抗人凝血酶原抗体，1∶4000倍，取100μL加入每孔中，室温孵育30min. 用洗涤液洗板4次，吸干，用标本稀释液稀释辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG，1∶2000，取100μL加入每孔中，室温孵育30min，用洗涤液洗板4次，吸干，各孔加100μL底物溶液，室温孵育4min，加终止液100μL测A，检测波长为490nm. 每孔A减去空白A，以A对PIVKA-Ⅱ绘制标准曲线(图1)，得出每孔PIVKA-Ⅱ含量.
, 百拇医药
图1 凝血酶原前体蛋白ELISA标准曲线.
2 结果
图1为典型的测定PIVKA-Ⅱ含量的标准曲线(双对数的4参数逻辑曲线). 通过零标准，计算A，再加两个标准差，得出本方法的最小检出值是0.15kAU/L. 重复检测9份第1次阳性新生儿脐血标本，得出本实验室批间变异系数为9.85%；4份不同浓度的阳性血清，重复5孔，得出批内变异为5.16%；4份标准的阴性血清中依次加入不同浓度的阳性标准血清，求得总回吸收率为99.8%. 在检测的34例新生儿脐血标本中，9例PIVKA-Ⅱ含量高于0.15AU/mL阳性率为26%(9/34)，范围0.181kAU/L～2.650kAU/L. 正常参考值小于0.15kAU/L. 检测时间2h.
, 百拇医药
3 讨论
Shearer[2]认为，以凝血酶原前体蛋白的检测了解机体的Vit K营养状况较凝血酶原时间敏感1000倍，在常规凝血试验未出现变化之前PIVKA-Ⅱ即可在血液中检测到，它反映机体亚临床Vit K缺乏阶段. 当机体生化水平Vit K缺乏时，PIVKA-Ⅱ出现，而此时这些功能性指标如依赖VitK的凝血因子含量或凝血酶原时间、部分凝血活酶时间、凝血试验、Normotest等尚无变化. 从抗原特点看，PIVKA-Ⅱ和凝血酶原相近，但有部分抗原决定簇不同，从功能特点看，凝血酶原前体蛋白无凝血活性. 依赖Vit K的凝血因子包括Ⅱ，Ⅶ，Ⅸ，Ⅹ. 由于凝血酶原在血中浓度最高，因此阐述Vit K的作用机制多以凝血酶原为代表. 凝血酶原前体蛋白在肝细胞微粒体中由羧化酶催化、Vit K为辅酶PIVKA-Ⅱ氨基末端的谷氨酸(Glu)转变为γ-羧基谷氨酸(Gla)，γ-羧基谷氨酸具有结合二价金属离子如Ca2+的能力，γ-羧基谷氨酸为凝血酶原提供了Ca2+结合位点，此时PIVKA-Ⅱ成为有活性的凝血酶原. PIVKA-Ⅱ在肝脏不断产生，PIVKA-Ⅱ本身的生物合成不受Vit K影响. 在羧化酶功能正常和Vit K存在时PIVKA-Ⅱ全部转变为凝血酶原，血液中不能检测到PIVKA-Ⅱ. 当用于肝脏完成羧化反应所需Vit K缺乏或使用Vit K拮抗剂时，PIVKA-Ⅱ则不能完全转化为凝血酶原，PIVKA-Ⅱ出现在循环血液中，因此，PIVKA-Ⅱ出现是与Vit K缺乏状况同步的.
, 百拇医药
PIVKA-Ⅱ的检测经历了间接到直接，定性、半定量到微量测定的过程. 间接定量技术是根据PIVKA-Ⅱ与凝血酶原化学结构的差异所表现的化学特性不同而设计的. 氢氧化铝凝胶及钡盐能吸附掉血浆中的凝血酶原，而PIVKA-Ⅱ不被吸附. 鉴于PIVKA-Ⅱ分子的氨基末段与凝血酶原不同，可制备与凝血酶原无交叉反应的mAb，利用特异性抗体直接检测PIVKA-Ⅱ含量. Belle et al[3]生产了新一类mAb即C4B6，我们所建立的方法就是使用该mAb. 基于mAb的ELISA法是最特异、敏感的方法，理论上讲Vit K营养充足的人群其血中检测不到PIVKA-Ⅱ，只要血循环中检测到PIVKA-Ⅱ就表示机体存在Vit K缺乏，因此，PIVKA-Ⅱ是判断机体Vit K营养状况的理想指标. 由于胎盘屏障的存在母体血液中的Vit K不易通过胎盘到达胎儿体内，母血和胎儿血有较大的浓度梯度差异，部分新生儿脐血检测不到Vit K[4]，这预示着新生儿处于Vit K缺乏的状态. 从我们对34例新生儿的脐血PIVKA-Ⅱ检测来看，有1/4的新生儿存在维生素K缺乏情况，这为为什么新生儿容易发生出血症提供了理论依据.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Shearer MJ. Vitamin K: its physiological role and the assessment of clinical and subclinical deficiency states. JIFCC，
1995;7:88-95
2 Shearer MJ. Vitamin K. Lancet， 1995;345:229-234
3 Belle M， Brebant R， Guinet R， Leclercq M. Production of a new monoclonal antibody specific to
human des-gamma-carboxyprothrombin in the presence of calcium ions. Application to the development of a sensitive ELISA-test.
J Immunoassay， 1995;16:213-229
4 Shearer MJ. Vitamin K metabolism and nutriture. Blood Rev， 1992;6:92, http://www.100md.com(张会丰1 王丽芳2 范士英2 Julia Harvey3 Martin J. Shearer3)