内毒素诱导大鼠暴发性肝衰竭中肝细胞再生
1中国医科大学第二临床学院传染科 辽宁省沈阳市 110003
2大石桥市中心医院传染科 辽宁省大石桥市 115100
辽宁省自然科学基金资助课题，No.962259
项目负责人 冯国和中国医科大学第二临床学院传染科 辽宁省沈阳市 110003
收稿日期 1999-10-19 接收日期 1999-12-01
Subject headings hepatic failure; endotoxin; hepatocyte regeneration; proliferating cellular nuclear antigen
, 百拇医药
主题词 肝功能衰竭；内毒素；肝再生；增殖核细胞抗原
冯国和,王玉梅,张琳,刘沛,高瑾. 内毒素诱导大鼠暴发性肝衰竭中肝细胞再生. 世界华人消化杂志，2000；8(4)：468-469
我们通过制备实验性亚急性肝功能衰竭模型，运用免疫组化技术，检测再生肝细胞表面增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)表达分布状态，旨在对肝细胞再生程度作一动态评价.
1 材料和方法
1.1 材料 亚急性肝功衰竭模型的制备，参照Ohnishi et al[1]方法并加以改进，Wistar ♂大白鼠(中国医科大学第二临床学院实验动物室提供)110只，体质量200g，先取50只，分5组，每组10只. 选用内毒素同型物FS-112(购自Ono Phamaceutical Co Japan)，以30mg/kg(溶于50mL/L乙二醇，50mL/L乙醇，50g/L葡萄糖)经尾静脉注入，2d后行70%部分肝切除术，分别在术后12，24，36，48，72h进行心脏采血，3000r/min离心10min，分离血清，-20℃保存待检，之后立即开腹留取剩余肝组织标本，经10mL/L中性福尔马林固定保存. 另50只，分组方式同前，经尾静脉注入等剂量生理盐水，留取肝组织标本，方式同前，用于对照. 另10只正常鼠，直接心脏采血，离心获血清，用于正常鼠ALT，TB水平检测，以设ALT，TB水平正常对照.
, 百拇医药
1.2 方法 所留血清标本用于谷丙转氨酶(ALT)及总胆红素(总TB)水平检测，应用Enore Chemistry System (Barker Instrument)，采用PCNA单克隆抗体(Sigma公司)及过氧化酶标记的链霉卵白素染色试剂盒(北京中山生物技术有限公司)，对所留取不同时期肝组织标本进行免疫组化染色，其中PCNA单抗稀释浓度为1∶60. PCNA阳性细胞数计算方法：PCNA阳性细胞数/100个肝细胞数×100%.
统计学处理 在不同分布区域反复计数三次而取均值，采用两个同样样本均数比较的t检验.
2 结果
经FS-112予处理，2d后行70%部分肝脏切除术，经病理形态学检查可见亚大块状出血性坏死，并发现术后不同时期ALT、总TB水平进行性增高(表1).
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选用PCNA单抗、经免疫组化染色，可见术后PCNA阳性细胞数百分率随着时间的延长呈现进行性减少的趋向，从术后24h开始，与对照组相比差别逐渐显著(P<0.05，P<0.01，表1).
表1 FHF不同时期ALT，TB，PCNA检测结果
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aP<0.05， vs 未手术组；bP<0.01， vs 未手术组及生理盐水对照组；cP<0.05， vs 生理盐水对照组.
3 讨论
关于暴发性肝功能衰竭(FHF)中肝细胞再生机制实验性研究国外有报道说法不一. Wolf et al[2]曾利用Fisher大鼠动物模型研究报道，在模型制备后1h与12h，PCNA阳性细胞百分率在FHF与急性肝炎之间无显著性差别，认为在早期二者肝细胞再生程度无显著性差别. Ohnishi et al[1，4]利用Balb/c小鼠动物模型研究发现，模型制备后36h，PCNA阳性细胞数百分率较对照组显著性低下，从而认为肝细胞再生程度受到抑制. 本项研究如下：经内毒素同型物FS-112予处理2d后，行70%部分肝脏切除术，于术后12h，PCNA阳性细胞数百分率为38.6%±6.3%，与对照组(41.7%±6.7%)无显著性差别，于术后24h，PCNA阳性细胞数百分率为18.8%±4.2%，与对照组(30.7%±6.8%)有显著性差别(P<0.05)；于术后36h，PCNA阳性细胞数百分率为7.7%±1.7%，与对照组(28.5%±4.3%)相比差别更加显著(P<0.01)，术后48h与72h，结果显著性检出正常肝细胞在一定因素启动下从G0至G1期，后者持续12h～14h，及进入S期，即DNA合成期，亦是PCNA表达的高峰时期，可持续22h～24h. 以往人们往往通过部分肝脏切除术这一机械性刺激，来研究正常肝脏再生潜能. 近10a+已发现了许多影响肝细胞再生的因子和激素，提出以细胞表面调节物、损伤素及肝细胞生长因子为核心的肝细胞再生机制[3]. 内毒素诱导实验性肝功能衰竭模型的建立因其发病机制与临床上FHF非常相似，故为FHF发病机制的实验室研究提供了必要手段[4]. 该研究结合上述特点，首先选用内毒素同型物FS-112造成肝细胞进行性坏死，2d后做70%部分肝脏切除术以刺激肝细胞再生，病理学检查可见肝细胞呈现进行性坏死，同时伴有一定程度地肝细胞再生，血清学检查可见ALT，TB水平进行性增高，符合临床FHF特点，说明此模型可为暴发性肝功能衰竭中肝细胞再生机制研究提供一定帮助. 检验均为P<0.01(表1). 该结果提示：在FHF动物模型中，在PCNA表达高峰期(S期)存在着PCNA进行性减少的趋向，提示肝细胞再生受到进行性抑制，可能体内存在某些抑制因素参与了对肝细胞再生的抑制作用. Ohnishi et al[4]通过肝细胞体外培养实验还发现，机体内NK淋巴细胞经诱导活化后对再生肝细胞有选择性免疫杀伤作用. 但我们考虑：肝再生的调控是一个众多因素相互作用，相互制约和协同调节的复杂过程，并非单一因素所致，故应需进一步研究，以期从不同环节为临床肝损伤后的肝再生提供治疗方法.
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4 参考文献
1 Ohnishi H, Muto Y, Maeda T, Hayashi T, Nagaki M, Yamada T, Shimazaki M, Yamada Y, Sugihara Z, Moriwaka H. Natural killer cell
may impair liver regeneration in fulminant hepatic failure. Gastroenterol Jpn, 1993;28:40-44
2 Wolf HK, Michalopoulos GK. Hepatocyte regeneration in acute fulminant and nonfulminant hepatitis: a study of proliferating
, 百拇医药
cell nuclear antigen expression. Hepatology, 1992;15:707-713
3 Simposon KJ, Lukacs NW, Colletti L, Sterieter RM, Kunkel SL. Cytokines and the liver. J Hepatol, 1997;27:1120-1132
4 Ohnishi H, Muto Y. Immunogical approach to impaired liver regeneration in fulminant hepatic failure.
Trop Gastroenterol, 1993;14:127-131, 百拇医药(冯国和1 王玉梅1 张 琳1 刘 沛1 高 瑾2)
2大石桥市中心医院传染科 辽宁省大石桥市 115100
辽宁省自然科学基金资助课题，No.962259
项目负责人 冯国和中国医科大学第二临床学院传染科 辽宁省沈阳市 110003
收稿日期 1999-10-19 接收日期 1999-12-01
Subject headings hepatic failure; endotoxin; hepatocyte regeneration; proliferating cellular nuclear antigen
, 百拇医药
主题词 肝功能衰竭；内毒素；肝再生；增殖核细胞抗原
冯国和,王玉梅,张琳,刘沛,高瑾. 内毒素诱导大鼠暴发性肝衰竭中肝细胞再生. 世界华人消化杂志，2000；8(4)：468-469
我们通过制备实验性亚急性肝功能衰竭模型，运用免疫组化技术，检测再生肝细胞表面增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)表达分布状态，旨在对肝细胞再生程度作一动态评价.
1 材料和方法
1.1 材料 亚急性肝功衰竭模型的制备，参照Ohnishi et al[1]方法并加以改进，Wistar ♂大白鼠(中国医科大学第二临床学院实验动物室提供)110只，体质量200g，先取50只，分5组，每组10只. 选用内毒素同型物FS-112(购自Ono Phamaceutical Co Japan)，以30mg/kg(溶于50mL/L乙二醇，50mL/L乙醇，50g/L葡萄糖)经尾静脉注入，2d后行70%部分肝切除术，分别在术后12，24，36，48，72h进行心脏采血，3000r/min离心10min，分离血清，-20℃保存待检，之后立即开腹留取剩余肝组织标本，经10mL/L中性福尔马林固定保存. 另50只，分组方式同前，经尾静脉注入等剂量生理盐水，留取肝组织标本，方式同前，用于对照. 另10只正常鼠，直接心脏采血，离心获血清，用于正常鼠ALT，TB水平检测，以设ALT，TB水平正常对照.
, 百拇医药
1.2 方法 所留血清标本用于谷丙转氨酶(ALT)及总胆红素(总TB)水平检测，应用Enore Chemistry System (Barker Instrument)，采用PCNA单克隆抗体(Sigma公司)及过氧化酶标记的链霉卵白素染色试剂盒(北京中山生物技术有限公司)，对所留取不同时期肝组织标本进行免疫组化染色，其中PCNA单抗稀释浓度为1∶60. PCNA阳性细胞数计算方法：PCNA阳性细胞数/100个肝细胞数×100%.
统计学处理 在不同分布区域反复计数三次而取均值，采用两个同样样本均数比较的t检验.
2 结果
经FS-112予处理，2d后行70%部分肝脏切除术，经病理形态学检查可见亚大块状出血性坏死，并发现术后不同时期ALT、总TB水平进行性增高(表1).
, http://www.100md.com
选用PCNA单抗、经免疫组化染色，可见术后PCNA阳性细胞数百分率随着时间的延长呈现进行性减少的趋向，从术后24h开始，与对照组相比差别逐渐显著(P<0.05，P<0.01，表1).
表1 FHF不同时期ALT，TB，PCNA检测结果
| 分组 | n | ALT (IU/L) | TB (μmol/L) | PCNA (%) | |||
| 内毒素 | 生理盐水 | 内毒素 | 生理盐水 | 内毒素 | 生理盐水 | ||
| 未手术 | 10 | 54.9±9.4 | 16.8±3.7 | ||||
| 术后12h | 10 | 142.3±23.6 | 35.6±6.3 | 19.3±3.2 | 10.3±2.3 | 38.6±6.3c | 41.7±6.7 |
| 术后24h | 10 | 138.2±21.8a | 32.5±4.3 | 26.7±4.4a | 5.3±1.2 | 18.8±4.2c | 30.7±6.8 |
| 术后36h | 10 | 582.9±92.6b | 29.3±5.1 | 38.5±6.6b | 4.2±0.9 | 7.7±1.7b | 28.5±4.3 |
| 术后48h | 10 | 632.4±100.7b | 17.6±3.4 | 78.7±13.8b | 4.3±1.1 | 5.7±0.9b | 25.8±4.9 |
| 术后72h | 10 | 511.5±85.6b | 14.8±2.5 | 91.4±10.3b | 3.9±1.3 | 2.8±0.4b | 15.6±2.2 |
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aP<0.05， vs 未手术组；bP<0.01， vs 未手术组及生理盐水对照组；cP<0.05， vs 生理盐水对照组.
3 讨论
关于暴发性肝功能衰竭(FHF)中肝细胞再生机制实验性研究国外有报道说法不一. Wolf et al[2]曾利用Fisher大鼠动物模型研究报道，在模型制备后1h与12h，PCNA阳性细胞百分率在FHF与急性肝炎之间无显著性差别，认为在早期二者肝细胞再生程度无显著性差别. Ohnishi et al[1，4]利用Balb/c小鼠动物模型研究发现，模型制备后36h，PCNA阳性细胞数百分率较对照组显著性低下，从而认为肝细胞再生程度受到抑制. 本项研究如下：经内毒素同型物FS-112予处理2d后，行70%部分肝脏切除术，于术后12h，PCNA阳性细胞数百分率为38.6%±6.3%，与对照组(41.7%±6.7%)无显著性差别，于术后24h，PCNA阳性细胞数百分率为18.8%±4.2%，与对照组(30.7%±6.8%)有显著性差别(P<0.05)；于术后36h，PCNA阳性细胞数百分率为7.7%±1.7%，与对照组(28.5%±4.3%)相比差别更加显著(P<0.01)，术后48h与72h，结果显著性检出正常肝细胞在一定因素启动下从G0至G1期，后者持续12h～14h，及进入S期，即DNA合成期，亦是PCNA表达的高峰时期，可持续22h～24h. 以往人们往往通过部分肝脏切除术这一机械性刺激，来研究正常肝脏再生潜能. 近10a+已发现了许多影响肝细胞再生的因子和激素，提出以细胞表面调节物、损伤素及肝细胞生长因子为核心的肝细胞再生机制[3]. 内毒素诱导实验性肝功能衰竭模型的建立因其发病机制与临床上FHF非常相似，故为FHF发病机制的实验室研究提供了必要手段[4]. 该研究结合上述特点，首先选用内毒素同型物FS-112造成肝细胞进行性坏死，2d后做70%部分肝脏切除术以刺激肝细胞再生，病理学检查可见肝细胞呈现进行性坏死，同时伴有一定程度地肝细胞再生，血清学检查可见ALT，TB水平进行性增高，符合临床FHF特点，说明此模型可为暴发性肝功能衰竭中肝细胞再生机制研究提供一定帮助. 检验均为P<0.01(表1). 该结果提示：在FHF动物模型中，在PCNA表达高峰期(S期)存在着PCNA进行性减少的趋向，提示肝细胞再生受到进行性抑制，可能体内存在某些抑制因素参与了对肝细胞再生的抑制作用. Ohnishi et al[4]通过肝细胞体外培养实验还发现，机体内NK淋巴细胞经诱导活化后对再生肝细胞有选择性免疫杀伤作用. 但我们考虑：肝再生的调控是一个众多因素相互作用，相互制约和协同调节的复杂过程，并非单一因素所致，故应需进一步研究，以期从不同环节为临床肝损伤后的肝再生提供治疗方法.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Ohnishi H, Muto Y, Maeda T, Hayashi T, Nagaki M, Yamada T, Shimazaki M, Yamada Y, Sugihara Z, Moriwaka H. Natural killer cell
may impair liver regeneration in fulminant hepatic failure. Gastroenterol Jpn, 1993;28:40-44
2 Wolf HK, Michalopoulos GK. Hepatocyte regeneration in acute fulminant and nonfulminant hepatitis: a study of proliferating
, 百拇医药
cell nuclear antigen expression. Hepatology, 1992;15:707-713
3 Simposon KJ, Lukacs NW, Colletti L, Sterieter RM, Kunkel SL. Cytokines and the liver. J Hepatol, 1997;27:1120-1132
4 Ohnishi H, Muto Y. Immunogical approach to impaired liver regeneration in fulminant hepatic failure.
Trop Gastroenterol, 1993;14:127-131, 百拇医药(冯国和1 王玉梅1 张 琳1 刘 沛1 高 瑾2)