体外培养肝细胞合成微量人清蛋白测定方法
1中国人民解放军第三医院普外科 陕西省宝鸡市 721004
2珠江医院普外科 3南方医院核医学科
项目负责人 薛国柱中国人民解放军第三医院普外科 陕西省宝鸡市 721004
收稿日期 2000-01-23 接收日期 2000-03-02
Subject headings albumins; lecture media, serum-free; hepatocyte growth factor; tumour cells, lecture; hepatoma; radioimmunoassay
, http://www.100md.com
主题词 白蛋白类；培养基，无血清；肝细胞生长因子；肿瘤细胞，培养的；肝细胞瘤；免射免疫测定
薛国柱,刘冰艳,高毅,杨继震,黄祖汉. 体外培养肝细胞合成微量人清蛋白测定方法. 世界华人消化杂志，2000；8(4)：473-474
1 材料和方法
1.1 材料 人清蛋白放免试剂盒由北方原子能研究所提供. 人清蛋白放射免疫检测,采用抗原竞争法. 原试剂盒灵敏度为0.25μg/mL,不能满足实验需要,经反复摸索,调整抗体、125I-标记抗原浓度及实验条件，最终得出如下结果:125I-人清蛋白放射性比活度为25μCi/μg，每一样品测定用量2.5μCi，抗体1∶8稀释,并将温育方式改为4℃ 24h,可提高灵敏度至3ng/mL左右.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 清蛋白标准曲线、线性关系及灵敏度 取洁净试管分别标上记号, 非特异性结合管(NSB),标准管S0～S7(n=5),然后用微量加样器加样. 缓冲液：NSB管加300μL,S0管200μL;标准品S1～S7管加200μL;125I-人清蛋白:各管均加100μL;抗体：S0管、S1～S7管各100μL. 4℃ 24h温育后分别加免疫分离试剂1000μL,混匀后室温放置15min,任取5管测放射性计数(cpm)取平均值为总T. 3000r/min离心15min,测沉淀放射性计数. 标准管取放射性计数平均值.
1.2.2 特异性 培养基中的小牛血清含有牛清蛋白，结构与人清蛋白类似，需检验该方法对人清蛋白测定的特异性. 以含10%小牛血清的L-15培养基作样品(n=5)，测定其放射性结合率,并与S0管进行比较.
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1.2.3 回收率试验 L-15培养基分别外加标准人清蛋白,制成浓度为15.6, 31.2, 62.5, 125ng/L的溶液，测定其平均回收率.
1.2.4 重复性试验 上述浓度的样品5次重复测定得出平均批内变异系数;选择其中的62.5ng/mL样品间隔1wk重复测定求出批间变异系数.
2 结果
2.1 标准管放射性计数结果 见表1.
表1 标准管加样表(μL)
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NSB=226，表中数据已减去NSB管放射性计数.
2.1.1 标准曲线与线性关系 平衡反应体系中，抗体处于被饱和状态. 根据平衡反应方程可得出，以浓度x的对数lgx为自变量，以lg(Bx/Bo-Bx)为因变量作图可得一直线,即logitBx数学模型[logitBx即为lg(Bx/Bo-Bx)]. 方程式为:lg(Bx/Bo-Bx)=a+blgx. 以logitBx对lgx作直线回归得回归方程lg(Bx/Bo-Bx)=1.11-0.68lgx；r=-0.993，P<0.01，表明在3.1ng/mL～200ng/mL范围内线性关系良好.
2.1.2 灵敏度 根据5次实验标准曲线结果，按S0管放射性计数2608-366(x-2s)由标准曲线上得出本法最小检测值2.98ng/mL.
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2.2 特异性 L-15培养基放射性计数平均为2594±84(x±s),与S0管进行比较,P>0.5, 两者无差异，说明人清蛋白与牛血清清蛋白无交叉反应.
2.3 回收率结果 如表2.
表2 标准管取放射性计数
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2.4 重复性试验 平均批内变异系数为4.7%;批间变异系数为6.5%.
3 讨论
生物人工肝(Bioartificial Liver,BAL)是一种新型的人工肝辅助装置，如何选择生物材料是目前研究的热点之一[1-4]. BAL研究国内起步较晚,仅在肝细胞移植方面有部分报道[5,6]. 放射免疫分析方法(Radioimmunoassay,RIA)是利用免疫学抗原抗体反应的高度特异性和放射性测量的高度灵敏性相结合形成的一种检测技术[7,8]. 能精确测定各种具有免疫活性的微量物质,灵敏度可达ng(10-9g)至pg(10-12g)级,近年来向fg(10-15g)级水平发展. 其高度特异性可以避免类似物质的干扰[9]. 清蛋白合成和分泌是肝细胞重要功能之一[1,3]. 但体外培养因细胞数量有限其浓度较低,在ng(10-9g)级水平，且培养液中需加入NCS才能更好地保持其生物特性. NCS中的牛血清清蛋白，结构与人清蛋白相似，用具有高特异性和灵敏性的RIA才可避免干扰. 原试剂盒是为适应临床需要而制作的,用于测定人尿中清蛋白含量. 一般要求检测范围在(1～200)μg/mL之间即可[7,10]. 放免试剂盒的灵敏度与抗体结合力关系密切,其滴度并不影响抗体与待测物或标记物的结合力和特异性[8,9]. 因此将抗体稀释到一定倍数仍能结合相当数量的标记物. 实验结果表明，抗体1∶8稀释后其结合率仍达68.35%. 能满足放射性测量控制误差所需最低放射性计数600cpm的要求[9]. 对标记抗原作1∶4稀释,各标准品及样品放射性计数均高于此限,能够满足控制误差需要.
, 百拇医药
原试剂盒反应条件为37℃ 1h,延长温育时间(4℃ 24h)可以使反应体系达到充分平衡, 使抗体最大限度结合抗原[9,10]. 原人清蛋白放免试剂盒通过调整,灵敏度提高到2.98ng/mL. 检测范围内线性关系良好，回收率接近100%,其准确性高. 批内变异和批间变异指标均符合要求(CV<10%测定方法即可采用)[8,11]. 因此该方法简便可靠,适于体外培养肝细胞人清蛋白含量定量测定.
4 参考文献
1 Shatford RA, Nyberg SL, Meier SJ, White JG, Payne WD, Hu WS, Cerra FB. Artificial liver: a forthcoming attraction.
, 百拇医药
Hepatology, 1993;17:1163-1168
2 Chang TM. Artificial liver support based on artificial cells with emphasis on encapsulated hepatocytes.
Artificial Organs, 1992;16:71-74
3 Dunn JCY, Tompkins RG, Yarmush ML. Hepatocytes in collagen Sandwich: Evidence for transcriptional and Translational
Regulation. Cell Biology, 1992;116:1043-1053
, 百拇医药
4 薛国柱, 杨继震, 高毅. 组合性人工肝的研究现状. 新消化病学杂志, 1996;4:36-37
5 孙绵方, 蔡祝辉, 施志清, 马风竹. 一种新型的生物人工肝——微囊肝细胞. 中国生物医学工程学报, 1989;8:230-235
6 李涛, 杨军, 崔润海, 高茹, 宋继昌, 孙多先. 人工细胞微囊材料壳聚糖的实验研究. 中国生物医学工程学报,1995;14:7-10
7 孙继芝, 曹伟, 郑妙 王容, 王广有, 方平, 赵立全, 于淑敏. 人尿白蛋白放射免疫测定. 天津医药, 1990;(9):565-566
8 朱忠勇. 实用医学检验学. 北京: 人民军医出版社, 1992:922-924
9 夏宗勤. 实验核医学与核药学. 上海: 同济大学出版社, 1989:168-207
10 许瑞吉, 杨晓晴, 常愈明. 放射免疫测定人尿白蛋白及其临床意义. 中华肾脏病杂志, 1987;3:196-198
11 赵武述, 李洁, 张玉琴. 白细胞介素2放射免疫分析法. 中华核医学杂志, 1990;10:55-56, http://www.100md.com(薛国柱1 刘冰艳1 高 毅2 杨继震2 黄祖汉3)
2珠江医院普外科 3南方医院核医学科
项目负责人 薛国柱中国人民解放军第三医院普外科 陕西省宝鸡市 721004
收稿日期 2000-01-23 接收日期 2000-03-02
Subject headings albumins; lecture media, serum-free; hepatocyte growth factor; tumour cells, lecture; hepatoma; radioimmunoassay
, http://www.100md.com
主题词 白蛋白类；培养基，无血清；肝细胞生长因子；肿瘤细胞，培养的；肝细胞瘤；免射免疫测定
薛国柱,刘冰艳,高毅,杨继震,黄祖汉. 体外培养肝细胞合成微量人清蛋白测定方法. 世界华人消化杂志，2000；8(4)：473-474
1 材料和方法
1.1 材料 人清蛋白放免试剂盒由北方原子能研究所提供. 人清蛋白放射免疫检测,采用抗原竞争法. 原试剂盒灵敏度为0.25μg/mL,不能满足实验需要,经反复摸索,调整抗体、125I-标记抗原浓度及实验条件，最终得出如下结果:125I-人清蛋白放射性比活度为25μCi/μg，每一样品测定用量2.5μCi，抗体1∶8稀释,并将温育方式改为4℃ 24h,可提高灵敏度至3ng/mL左右.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 清蛋白标准曲线、线性关系及灵敏度 取洁净试管分别标上记号, 非特异性结合管(NSB),标准管S0～S7(n=5),然后用微量加样器加样. 缓冲液：NSB管加300μL,S0管200μL;标准品S1～S7管加200μL;125I-人清蛋白:各管均加100μL;抗体：S0管、S1～S7管各100μL. 4℃ 24h温育后分别加免疫分离试剂1000μL,混匀后室温放置15min,任取5管测放射性计数(cpm)取平均值为总T. 3000r/min离心15min,测沉淀放射性计数. 标准管取放射性计数平均值.
1.2.2 特异性 培养基中的小牛血清含有牛清蛋白，结构与人清蛋白类似，需检验该方法对人清蛋白测定的特异性. 以含10%小牛血清的L-15培养基作样品(n=5)，测定其放射性结合率,并与S0管进行比较.
, http://www.100md.com
1.2.3 回收率试验 L-15培养基分别外加标准人清蛋白,制成浓度为15.6, 31.2, 62.5, 125ng/L的溶液，测定其平均回收率.
1.2.4 重复性试验 上述浓度的样品5次重复测定得出平均批内变异系数;选择其中的62.5ng/mL样品间隔1wk重复测定求出批间变异系数.
2 结果
2.1 标准管放射性计数结果 见表1.
表1 标准管加样表(μL)
| 测定管 | NSB | S0 | 标准管S1～S7 |
| 缓冲液 | 300 | 200 | — |
| 标准品 | — | — | 200 |
| 125I-人清蛋白 | 100 | 100 | 100 |
| 抗体 | — | 100 | 100 |
, 百拇医药
NSB=226，表中数据已减去NSB管放射性计数.
2.1.1 标准曲线与线性关系 平衡反应体系中，抗体处于被饱和状态. 根据平衡反应方程可得出，以浓度x的对数lgx为自变量，以lg(Bx/Bo-Bx)为因变量作图可得一直线,即logitBx数学模型[logitBx即为lg(Bx/Bo-Bx)]. 方程式为:lg(Bx/Bo-Bx)=a+blgx. 以logitBx对lgx作直线回归得回归方程lg(Bx/Bo-Bx)=1.11-0.68lgx；r=-0.993，P<0.01，表明在3.1ng/mL～200ng/mL范围内线性关系良好.
2.1.2 灵敏度 根据5次实验标准曲线结果，按S0管放射性计数2608-366(x-2s)由标准曲线上得出本法最小检测值2.98ng/mL.
, http://www.100md.com
2.2 特异性 L-15培养基放射性计数平均为2594±84(x±s),与S0管进行比较,P>0.5, 两者无差异，说明人清蛋白与牛血清清蛋白无交叉反应.
2.3 回收率结果 如表2.
表2 标准管取放射性计数
| 管号 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S0 |
| 浓度(ng/mL) | 200 | 100 | 50 | 25 | 12.5 | 6.3 | 3.1 | 0 |
| 放射性计数(cpm) | 706 | 925 | 1208 | 1513 | 1841 | 2035 | 2247 | 2608 |
, http://www.100md.com
2.4 重复性试验 平均批内变异系数为4.7%;批间变异系数为6.5%.
3 讨论
生物人工肝(Bioartificial Liver,BAL)是一种新型的人工肝辅助装置，如何选择生物材料是目前研究的热点之一[1-4]. BAL研究国内起步较晚,仅在肝细胞移植方面有部分报道[5,6]. 放射免疫分析方法(Radioimmunoassay,RIA)是利用免疫学抗原抗体反应的高度特异性和放射性测量的高度灵敏性相结合形成的一种检测技术[7,8]. 能精确测定各种具有免疫活性的微量物质,灵敏度可达ng(10-9g)至pg(10-12g)级,近年来向fg(10-15g)级水平发展. 其高度特异性可以避免类似物质的干扰[9]. 清蛋白合成和分泌是肝细胞重要功能之一[1,3]. 但体外培养因细胞数量有限其浓度较低,在ng(10-9g)级水平，且培养液中需加入NCS才能更好地保持其生物特性. NCS中的牛血清清蛋白，结构与人清蛋白相似，用具有高特异性和灵敏性的RIA才可避免干扰. 原试剂盒是为适应临床需要而制作的,用于测定人尿中清蛋白含量. 一般要求检测范围在(1～200)μg/mL之间即可[7,10]. 放免试剂盒的灵敏度与抗体结合力关系密切,其滴度并不影响抗体与待测物或标记物的结合力和特异性[8,9]. 因此将抗体稀释到一定倍数仍能结合相当数量的标记物. 实验结果表明，抗体1∶8稀释后其结合率仍达68.35%. 能满足放射性测量控制误差所需最低放射性计数600cpm的要求[9]. 对标记抗原作1∶4稀释,各标准品及样品放射性计数均高于此限,能够满足控制误差需要.
, 百拇医药
原试剂盒反应条件为37℃ 1h,延长温育时间(4℃ 24h)可以使反应体系达到充分平衡, 使抗体最大限度结合抗原[9,10]. 原人清蛋白放免试剂盒通过调整,灵敏度提高到2.98ng/mL. 检测范围内线性关系良好，回收率接近100%,其准确性高. 批内变异和批间变异指标均符合要求(CV<10%测定方法即可采用)[8,11]. 因此该方法简便可靠,适于体外培养肝细胞人清蛋白含量定量测定.
4 参考文献
1 Shatford RA, Nyberg SL, Meier SJ, White JG, Payne WD, Hu WS, Cerra FB. Artificial liver: a forthcoming attraction.
, 百拇医药
Hepatology, 1993;17:1163-1168
2 Chang TM. Artificial liver support based on artificial cells with emphasis on encapsulated hepatocytes.
Artificial Organs, 1992;16:71-74
3 Dunn JCY, Tompkins RG, Yarmush ML. Hepatocytes in collagen Sandwich: Evidence for transcriptional and Translational
Regulation. Cell Biology, 1992;116:1043-1053
, 百拇医药
4 薛国柱, 杨继震, 高毅. 组合性人工肝的研究现状. 新消化病学杂志, 1996;4:36-37
5 孙绵方, 蔡祝辉, 施志清, 马风竹. 一种新型的生物人工肝——微囊肝细胞. 中国生物医学工程学报, 1989;8:230-235
6 李涛, 杨军, 崔润海, 高茹, 宋继昌, 孙多先. 人工细胞微囊材料壳聚糖的实验研究. 中国生物医学工程学报,1995;14:7-10
7 孙继芝, 曹伟, 郑妙 王容, 王广有, 方平, 赵立全, 于淑敏. 人尿白蛋白放射免疫测定. 天津医药, 1990;(9):565-566
8 朱忠勇. 实用医学检验学. 北京: 人民军医出版社, 1992:922-924
9 夏宗勤. 实验核医学与核药学. 上海: 同济大学出版社, 1989:168-207
10 许瑞吉, 杨晓晴, 常愈明. 放射免疫测定人尿白蛋白及其临床意义. 中华肾脏病杂志, 1987;3:196-198
11 赵武述, 李洁, 张玉琴. 白细胞介素2放射免疫分析法. 中华核医学杂志, 1990;10:55-56, http://www.100md.com(薛国柱1 刘冰艳1 高 毅2 杨继震2 黄祖汉3)