当归促进大肠癌HCT-8细胞增殖及抑制5-氟尿嘧啶致凋亡的作用
中国人民解放军北京军区总医院消化内科 北京市 100700
项目负责人 邹明中国人民解放军北京军区总医院消化内科 北京市 100700
收稿日期 1999-12-22 接收日期 2000-01-13
Subject headings angelica; 5-Fu; MTT; flow cytometry; apoptosis; colon canser HCT-8 cell line
主题词 当归；5-氟尿嘧啶；四甲基偶氮唑盐；流式细胞仪；细胞凋亡；大肠癌HCT-8细胞
, 百拇医药
邹明,韩英,纪欣. 当归促进大肠癌HCT-8细胞增殖及抑制5-氟尿嘧啶致凋亡的作用. 世界华人消化杂志，2000；8(4)：475-476
1 材料和方法
1.1 材料 大肠癌HCT-8细胞为中国医学科学院药物研究所提供；5-氟尿嘧啶(5-Fu)注射液系天津氨基酸公司人民制药厂出品；当归注射液系北京第四制药厂出品；RPMI-1640培养基为Gibco BRL产品；小牛血清购自天津生化制品厂；胰蛋白酶购自天象人生物制品有限公司；DMSO系天津化学试剂六厂出品；PI(碘化丙啶)、RNAse(RNA酶)、MTT(四甲基偶氮唑盐)均为Sigma产品.
1.2 方法
, 百拇医药 1.2.1 细胞培养 以2.5g/L的胰蛋白酶消化传代，培养液用RPMI-1640(内含150mL/L小牛血清)，于36.5℃～37.0℃，50mL/L CO2培养箱中培养.
1.2.2 细胞处理 ①实验组：按预处理和处理的药物及处理时间的不同分为五组(表1). ②对照组：设阴性对照和阳性对照(表2).
表1 实验组分组及细胞处理方法
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表2 对照组分组及细胞处理方法
1.2.3 光学显微镜HE染色制片及照相 取6孔培养板先加入经高温蒸汽消毒的碎盖玻片，每孔3～4片，并使碎玻片与培养板底壁贴牢固定，再加入细胞数为1×105/mL的细胞悬液2mL/孔，待细胞生长至对数期，换液. 按表1和表2的加药顺序及培养时间作细胞处理(调整加药剂量使终浓度与表1、表2一致). 取各孔内碎玻片行HE染色，染色后封片并照相.
, 百拇医药
1.2.4 透射电镜(DXB2-12型)观察 取7只50mL培养瓶分别加入细胞数为1×105/mL的细胞悬液10mL/瓶，以与并镜观察相同的加药种类、顺序、培养时间处理细胞(剂量增加5倍以保持浓度不变)，并于相同的预处理和处理时间收集细胞(用细胞刮子轻轻刮下，使细胞混合于原培养液中)，2500r/min离心15min，弃上清，PBS洗1遍，移入1.5mL离心管离心去上清后加30mL/L戊二醛1mL/管固定. 后续过程为我院电镜室完成.
1.2.5 MTT法 取96孔板，平行4孔为一组，每孔加入细胞悬液100μL，加药浓度和培养时间保持不变. 至预定时间后各孔加入5g/L的MTT 10μL继续培养4h，后各孔加入DMSO 100μL轻轻振荡混匀，10min左右用酶联免疫检测仪(BIO RAD 550型)测570nm和630nm两波长各孔的OD值，按下列公式计算细胞存活率：存活率=[(实验孔OD570-实验孔OD630)/(对照孔OD570-对照孔OD630)]×100%，抑制率(或增殖率)=100%-存活率.
, 百拇医药
1.2.6 流式细胞仪检测-PI单染色法 细胞培养及处理过程同电镜标本制备，收集细胞采取胰蛋白酶消化法，消化下来的细胞用PBS洗2遍，4℃ 70mL/L酒精固定2h以上，再用PBS洗2遍，加100mg/L的RNAse 0.5mL 150mg/L的PI 0.5mL吹打混匀，避光静置30min，生理盐水洗1遍，300目尼龙网过滤，上流式细胞仪检测.
2 结果
2.1 光镜及电镜观察 光镜细胞形态及电镜超微结构改变(表3).
表3 细胞形态学改变的光镜和电镜观察
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2.2 MTT法及流式细胞仪测定 阴性对照细胞存活率按100%计算，其他各组存活率以此标准计算(表4).
表4 各处理方法细胞存活率及凋亡率比较
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aP<0.05 vs 阳性对照组.
3 讨论
当归为多年生草本植物，根含多种化学成分，其中的阿魏酸可促进ConA诱导的小鼠淋巴细胞DNA和蛋白质的合成，促进脾淋巴细胞的增殖，减少超氧自由基(·O2-)和过氧化氢(H2O2)对细胞的损伤作用[1]. 有人报道H2O2能诱导白血病细胞凋亡[2]，而抗氧化剂可防止H2O2诱导的胸腺细胞凋亡[3]，陆怡 et al[4]研究发现阿魏酸可防止H2O2诱导的淋巴细胞凋亡. 本实验发现当归具有促进大肠癌HCT-8细胞增殖的作用，在本实验的用药浓度和时间点用光镜观察发现细胞数增多，MTT法测得的增殖率分别为8%，19%，22%，随给药浓度的增加，增殖率有上升的趋势(P<0.05)；同时可抑制5-氟尿嘧啶对细胞的杀伤作用，致使5-Fu诱导的凋亡起始时间由18h延长至24h(P<0.05)，凋亡率为10.4%，较阳性对照的25%明显降低. 提示当归在促进HCT-8细胞增殖的同时可拮抗5-氟尿嘧啶对其的杀伤作用，降低细胞对5-Fu的敏感性.
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大肠癌临床化疗尚未开展药敏试验，目前有关肿瘤细胞对药物敏感性的判定均以MTT法为主. 细胞凋亡(apoptosis)这一概念是Kerr et al在1972年首先提出的，从此将原先统归为坏死范畴的细胞死亡明确区分为严格意义上的被动性死亡-坏死和主动性死亡-凋亡两个不同性质的类型[5]. 细胞凋亡属于程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)，其形态学及生物化学改变具有自身的特点，其中值得特别指出的是在凋亡过程中线粒体的结构保持完整[6]，也就是说MTT检测过程中凋亡细胞的线粒体酶仍能降解MTT使其变色，所以MTT法在计算存活率时将凋亡细胞按活细胞计算[7]，不能准确反映药敏结果. 本实验结果亦反映出这一问题. 从定性的角度分析，MTT法测得当归(40mL/L)预处理24h细胞增殖8%，再加5-氟尿嘧啶处理24h仍增殖4%，与阴性对照比较说明5-Fu对当归预处理过的细胞已无杀伤作用，但此时FCM测得的凋亡率为10.4%，显然二者结论相悖；从定量的角度来看，5-Fu处理细胞18h MTT法测得存活率为93%，FCM测得凋亡率为25%，如果以MTT法结果为准，其抑制率仅为7%，将凋亡细胞划归无效范围，结论也与事实不符. 如何克服MTT法的这一局限性，是一个值得探讨的
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问题.
根据实验结果可得出如下结论：①当归可促进大肠癌HCT-8细胞的增殖并降低其对5-Fu的敏感性. ②利用本实验方法可检测化疗方案中各药物之间以及治疗其他疾病的辅助用药与化疗药物之间的相互协同或拮抗作用，从而对临床用药的选择提供参考.
4 参考文献
1 谢宗万. 全国中草药汇编. 上册. 第2版. 北京：人民卫生出版社，1996：362-363
2 Lennen SV, Martin SJ, Cotter JG. Dose-dependent induction of apoptosis in human tumour cell lines by widely diverging stimuli.
, 百拇医药
Cell Prolif, 1991;24:203-214
3 Forrest VJ, Kang YH, McClain DE. Oxidative stress-induced apoptosis prevented by trolox. Free Radical Biology and
Medicine, 1994;16:675-684
4 陆怡，许彩民，杨洋，潘华珍. 阿魏酸钠对氧化诱导人淋巴细胞凋亡的抑制作用. 中国医学科学院学报，1998；20：44-48
5 王安福，樊代明，张学庸. 生物大分子的内化. 第1版. 北京：科学出版社，1995：237
6 成军. 程序性细胞死亡与疾病. 第1版. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997：191
7 钟晓松，童善庆，张希衡，朱佑明，胡宝瑜，丁建青，陆德源. 细胞凋亡荧光染色法检测肿瘤化疗药物敏感性并与MTT法的比较.
中国肿瘤生物治疗杂志，1997；4：125-129, 百拇医药(邹 明 韩 英 纪 欣)
项目负责人 邹明中国人民解放军北京军区总医院消化内科 北京市 100700
收稿日期 1999-12-22 接收日期 2000-01-13
Subject headings angelica; 5-Fu; MTT; flow cytometry; apoptosis; colon canser HCT-8 cell line
主题词 当归；5-氟尿嘧啶；四甲基偶氮唑盐；流式细胞仪；细胞凋亡；大肠癌HCT-8细胞
, 百拇医药
邹明,韩英,纪欣. 当归促进大肠癌HCT-8细胞增殖及抑制5-氟尿嘧啶致凋亡的作用. 世界华人消化杂志，2000；8(4)：475-476
1 材料和方法
1.1 材料 大肠癌HCT-8细胞为中国医学科学院药物研究所提供；5-氟尿嘧啶(5-Fu)注射液系天津氨基酸公司人民制药厂出品；当归注射液系北京第四制药厂出品；RPMI-1640培养基为Gibco BRL产品；小牛血清购自天津生化制品厂；胰蛋白酶购自天象人生物制品有限公司；DMSO系天津化学试剂六厂出品；PI(碘化丙啶)、RNAse(RNA酶)、MTT(四甲基偶氮唑盐)均为Sigma产品.
1.2 方法
, 百拇医药 1.2.1 细胞培养 以2.5g/L的胰蛋白酶消化传代，培养液用RPMI-1640(内含150mL/L小牛血清)，于36.5℃～37.0℃，50mL/L CO2培养箱中培养.
1.2.2 细胞处理 ①实验组：按预处理和处理的药物及处理时间的不同分为五组(表1). ②对照组：设阴性对照和阳性对照(表2).
表1 实验组分组及细胞处理方法
| 实验分组 | 预处理因素 | 预处理时间(h) | 处理因素(终浓度) | 培养时间(h) |
| 1 | — | — | 当归注射液(40mL/L) | 24 |
| 2 | — | — | 当归注射液(60mL/L) | 24 |
| 3 | — | — | 当归注射液(80mL/L) | 24 |
| 4 | 当归注射液(40mL/L) | 24 | 5-Fu注射液(1mmol/L) | 18 |
| 5 | 当归注射液(40mL/L) | 24 | 5-Fu注射液(1mmol/L) | 24 |
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表2 对照组分组及细胞处理方法
| 对照分组 | 处理因素 | 培养时间(h) |
| 阴性对照 | 无菌注射用水 | 24 |
| 阳性对照 | 5-氟尿嘧啶注射液(1mmol/L) | 18 |
1.2.3 光学显微镜HE染色制片及照相 取6孔培养板先加入经高温蒸汽消毒的碎盖玻片，每孔3～4片，并使碎玻片与培养板底壁贴牢固定，再加入细胞数为1×105/mL的细胞悬液2mL/孔，待细胞生长至对数期，换液. 按表1和表2的加药顺序及培养时间作细胞处理(调整加药剂量使终浓度与表1、表2一致). 取各孔内碎玻片行HE染色，染色后封片并照相.
, 百拇医药
1.2.4 透射电镜(DXB2-12型)观察 取7只50mL培养瓶分别加入细胞数为1×105/mL的细胞悬液10mL/瓶，以与并镜观察相同的加药种类、顺序、培养时间处理细胞(剂量增加5倍以保持浓度不变)，并于相同的预处理和处理时间收集细胞(用细胞刮子轻轻刮下，使细胞混合于原培养液中)，2500r/min离心15min，弃上清，PBS洗1遍，移入1.5mL离心管离心去上清后加30mL/L戊二醛1mL/管固定. 后续过程为我院电镜室完成.
1.2.5 MTT法 取96孔板，平行4孔为一组，每孔加入细胞悬液100μL，加药浓度和培养时间保持不变. 至预定时间后各孔加入5g/L的MTT 10μL继续培养4h，后各孔加入DMSO 100μL轻轻振荡混匀，10min左右用酶联免疫检测仪(BIO RAD 550型)测570nm和630nm两波长各孔的OD值，按下列公式计算细胞存活率：存活率=[(实验孔OD570-实验孔OD630)/(对照孔OD570-对照孔OD630)]×100%，抑制率(或增殖率)=100%-存活率.
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1.2.6 流式细胞仪检测-PI单染色法 细胞培养及处理过程同电镜标本制备，收集细胞采取胰蛋白酶消化法，消化下来的细胞用PBS洗2遍，4℃ 70mL/L酒精固定2h以上，再用PBS洗2遍，加100mg/L的RNAse 0.5mL 150mg/L的PI 0.5mL吹打混匀，避光静置30min，生理盐水洗1遍，300目尼龙网过滤，上流式细胞仪检测.
2 结果
2.1 光镜及电镜观察 光镜细胞形态及电镜超微结构改变(表3).
表3 细胞形态学改变的光镜和电镜观察
| 实验分组 | 光镜观察 | 电镜观察 |
| 阴性对照 | 细胞呈棱形，形态规整，伪足丰满 | 胞膜完整，细胞器清晰，核呈圆形，核仁规整 |
| 阳性对照 | 细胞变圆，伪足回缩，贴壁疏松，体积变小，细胞透明度降低等凋亡征象 | 胞膜完整，早期可见溶酶体增多，核及核仁变形，中晚期核仁崩解，边集，并可见凋亡小体 |
| 1 | 细胞数略显增多，间隙缩小，形态尚规整 | 细胞与阴性对照比较无变化 |
| 2 | 细胞数明显增多，部分区域间隙消失 | 同阴性对照 |
| 3 | 因细胞数过多，部分区域出现叠层生长 | 同阴性对照 |
| 4 | 细胞形态无明显变化，无凋亡征象 | 同阴性对照 |
| 5 | 出现与阳性对照相同的凋亡征象 | 同阴性对照 |
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2.2 MTT法及流式细胞仪测定 阴性对照细胞存活率按100%计算，其他各组存活率以此标准计算(表4).
表4 各处理方法细胞存活率及凋亡率比较
| 实验分组 | MTT法存活率(%) | 抑制率(%) | 增殖率(%) | FCM凋亡率(%) | 凋亡起始时间(h) |
| 阴性对照 | 100 | — | — | <5 | — |
| 阳性对照 | 93 | 7 | — | 25 | |
| 1 | 108 | — | 8 | <5 | — |
| 2 | 119 | — | 19 | <5 | — |
| 3 | 122 | — | 22 | <5 | — |
| 4 | 106 | — | 6 | <5 | — |
| 5 | 104 | — | 4 | 10.4 | 24a |
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aP<0.05 vs 阳性对照组.
3 讨论
当归为多年生草本植物，根含多种化学成分，其中的阿魏酸可促进ConA诱导的小鼠淋巴细胞DNA和蛋白质的合成，促进脾淋巴细胞的增殖，减少超氧自由基(·O2-)和过氧化氢(H2O2)对细胞的损伤作用[1]. 有人报道H2O2能诱导白血病细胞凋亡[2]，而抗氧化剂可防止H2O2诱导的胸腺细胞凋亡[3]，陆怡 et al[4]研究发现阿魏酸可防止H2O2诱导的淋巴细胞凋亡. 本实验发现当归具有促进大肠癌HCT-8细胞增殖的作用，在本实验的用药浓度和时间点用光镜观察发现细胞数增多，MTT法测得的增殖率分别为8%，19%，22%，随给药浓度的增加，增殖率有上升的趋势(P<0.05)；同时可抑制5-氟尿嘧啶对细胞的杀伤作用，致使5-Fu诱导的凋亡起始时间由18h延长至24h(P<0.05)，凋亡率为10.4%，较阳性对照的25%明显降低. 提示当归在促进HCT-8细胞增殖的同时可拮抗5-氟尿嘧啶对其的杀伤作用，降低细胞对5-Fu的敏感性.
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大肠癌临床化疗尚未开展药敏试验，目前有关肿瘤细胞对药物敏感性的判定均以MTT法为主. 细胞凋亡(apoptosis)这一概念是Kerr et al在1972年首先提出的，从此将原先统归为坏死范畴的细胞死亡明确区分为严格意义上的被动性死亡-坏死和主动性死亡-凋亡两个不同性质的类型[5]. 细胞凋亡属于程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)，其形态学及生物化学改变具有自身的特点，其中值得特别指出的是在凋亡过程中线粒体的结构保持完整[6]，也就是说MTT检测过程中凋亡细胞的线粒体酶仍能降解MTT使其变色，所以MTT法在计算存活率时将凋亡细胞按活细胞计算[7]，不能准确反映药敏结果. 本实验结果亦反映出这一问题. 从定性的角度分析，MTT法测得当归(40mL/L)预处理24h细胞增殖8%，再加5-氟尿嘧啶处理24h仍增殖4%，与阴性对照比较说明5-Fu对当归预处理过的细胞已无杀伤作用，但此时FCM测得的凋亡率为10.4%，显然二者结论相悖；从定量的角度来看，5-Fu处理细胞18h MTT法测得存活率为93%，FCM测得凋亡率为25%，如果以MTT法结果为准，其抑制率仅为7%，将凋亡细胞划归无效范围，结论也与事实不符. 如何克服MTT法的这一局限性，是一个值得探讨的
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问题.
根据实验结果可得出如下结论：①当归可促进大肠癌HCT-8细胞的增殖并降低其对5-Fu的敏感性. ②利用本实验方法可检测化疗方案中各药物之间以及治疗其他疾病的辅助用药与化疗药物之间的相互协同或拮抗作用，从而对临床用药的选择提供参考.
4 参考文献
1 谢宗万. 全国中草药汇编. 上册. 第2版. 北京：人民卫生出版社，1996：362-363
2 Lennen SV, Martin SJ, Cotter JG. Dose-dependent induction of apoptosis in human tumour cell lines by widely diverging stimuli.
, 百拇医药
Cell Prolif, 1991;24:203-214
3 Forrest VJ, Kang YH, McClain DE. Oxidative stress-induced apoptosis prevented by trolox. Free Radical Biology and
Medicine, 1994;16:675-684
4 陆怡，许彩民，杨洋，潘华珍. 阿魏酸钠对氧化诱导人淋巴细胞凋亡的抑制作用. 中国医学科学院学报，1998；20：44-48
5 王安福，樊代明，张学庸. 生物大分子的内化. 第1版. 北京：科学出版社，1995：237
6 成军. 程序性细胞死亡与疾病. 第1版. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997：191
7 钟晓松，童善庆，张希衡，朱佑明，胡宝瑜，丁建青，陆德源. 细胞凋亡荧光染色法检测肿瘤化疗药物敏感性并与MTT法的比较.
中国肿瘤生物治疗杂志，1997；4：125-129, 百拇医药(邹 明 韩 英 纪 欣)