幽门螺杆菌对胃上皮细胞形态与生长的影响
1 湖北医科大学附属第二医院消化内科 湖北省武汉市 430071
2 湖北医科大学病毒研究所
杨艺，女，1973-09-13生，湖北省武汉市人，汉族. 1995年湖北医科大学临床医疗系毕业，1997年湖北医科大学医学博士，主要从事消化系统疾病的病因研究.
项目负责人 邓长生，杨艺，430071，湖北省武汉市，湖北医科大学附属第二医院消化内科.
1 Department of Gastroenterology of the 2nd Affiliated Hospital, and 2Virus Research Institute, Hubei Medical University,Wuhan 430071, Hubei Province, China
Correspondence to Chang-Sheng Deng, Yi Yang, Department of Gastroenterology, 2nd Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430071, Hubei Province, China
Tel. 0086-27-86813391
收稿日期 1999-10-25 接收日期 1999-12-28
Effect of Helicobacter pylori on morphology and growth of gastric epithelial cells
Yi Yang1, Chang-Sheng Deng1, Xue-Jun Yao2， Han-Yan Liu2 and Mo Chen2
Abstract
AIM To investigate the effect of Helicobacter pylori (Hp) on the cell morphology, growth and proliferation of human gastric epithelial cells in vitro.
METHODS The Hp was coincubated with human gastric cancer cell line SGC-7901 for up to 72 hours and its effect on cell number, MTT test and expression of Ki-67 antigen were assessed.
RESULTS The detection of cytopathic effect of Hp showed that Hp 3.26×106 CFU/mL may induce vacuolation of 50% gastric epithelial cells. The cell counting, MTT test and immunohistochemical analysis of Ki-67 antigen presented a similar result: at a low concentration of Hp (≤1.6×105 CFU/mL), the cell growth and proliferation of the gastric epithelial cells increased; but at a high concentration of the Hp (≥8×105 CFU/mL) the cell proliferation was inhibited in a dosage-dependent manner.
CONCLUSION Hp could either increase the cell growth and proliferation or inhibit the cell proliferation, based on the Hp concentration in the system.
Subject headings Helicobacter pylori; gastric epithelial cell; cell culture; cell growth and proliferation; vacuolation
Yang Y, Deng CS, Yao XJ, Liu HY, Chen M. Effect of Helicobacter pylori on morphology and growth of gastric epithelial cells. Shijie HuarenXiaohua Zazhi, 2000;8(5):500-504
摘要
目的 研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)活菌对体外培养的胃上皮细胞形态与生长的影响.
方法 采用Hp与细胞体外共培养技术，结合细胞计数、MTT检测及Ki-67抗原的免疫组化分析，观察Hp活菌对人胃腺癌细胞系SGC-7901生长增殖的影响，同时参照病毒的致细胞病变效应实验计算Hp引起50%细胞空泡变性所需的最低浓度.
结果 ①细胞毒效应实验表明，3.26×106 CFU/mL的Hp能使50%的细胞出现空泡变性；②细胞计数结果显示，在培养的细胞中加入3.2×104 CFU/mL Hp时，72h内SGC-7901细胞的数量与未加Hp的对照组基本一样；当Hp浓度增加到1.6×105CFU/mL时，细胞数量较对照组显著增多；但是Hp浓度继续增加5倍后，细胞增殖受到抑制，且随Hp浓度进一步加大，抑制效应愈大，差异有显著性(P<0.01). ③MTT检测结果与细胞计数结果十分相似，当终浓度为1.6×105CFU/mL的Hp与细胞共培养时，可显著促进细胞生长(P<0.01)；但是Hp浓度5倍增加(8×105 CFU/mL)以后，细胞的增殖减少(P<0.05)；当Hp浓度达2×107 CFU/mL和1×108 CFU/mL时，细胞的生长明显被抑制(P<0.01). ④Ki-67抗原的免疫组化分析显示，阳性细胞的胞核呈棕黄色着色，低浓度的Hp(3.2×104 CFU/mL和1.6×105 CFU/mL)作用后,SGC-7901细胞内Ki-67抗原阳性率较对照明显增高(P<0.01)；相反，较高浓度Hp(4×106 CFU/mL和2×107 CFU/mL)作用后，细胞内Ki-67抗原阳性率较对照显著减少(P值分别为0.05与0.01).
结论 较低浓度的Hp不仅对细胞未显示明显的毒性，反而对细胞的生长增殖有一定的促进作用；而较高浓度的Hp却明显抑制细胞增殖，且浓度越大，抑制作用越显著. Hp对细胞增殖的双向效应可能与其同时具有促进和抑制细胞增殖两类因素有关. 本实验结果可用以部分解释人体感染Hp后所表现的不同结局.
主题词 幽门螺杆菌；胃上皮细胞；细胞培养；细胞生长与增殖 ；空泡毒作用
杨艺,邓长生,姚学军,刘汉燕,陈默. 幽门螺杆菌对胃上皮细胞形态与生长的影响. 世界华人消化杂志，2000；8(5)：500-504
0 引言
研究证明,幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是引起慢性B型胃炎的病因[1-4],是消化性溃疡的重要致病因子[5,6]，且与胃癌发生有关[7-16].关于Hp引起胃粘膜病变的确切机制，尚未完全明了. 各国学者有关Hp毒素致病机制的报道[17-20]较为多见. 至于Hp活菌体直接对胃粘膜上皮细胞作用的研究，仅见国外有少数报道，但其结果各不相同，甚至彼此矛盾. 为了进一步认识活体条件下Hp的致病机制，本研究用体外细胞培养技术，观察了Hp活菌对胃上皮细胞系生长与增殖的影响，以及它的致细胞空泡病变作用.
1 材料和方法
1.1 Hp活菌悬液的制备 Hp国际标准菌株NCTC 11637接种于含50mL/L羊血的厌氧菌分离培养基平板,置于37℃微需氧环境中(50mL/L O2，100mL/L CO2，50mL/L H2，800mL/L N2)培养,3d后收集细菌,用PBS制成细菌悬液,在分光光度计上确定Hp的浓度(1 OD660=1×108CFU/mL),然后用含20mL/L胎牛血清的RPMI1640作稀释液,将Hp菌液作连续5倍稀释(1×108CFU/mL～3.2×104CFU/mL).
1.2 人胃腺癌细胞系SGC-7901的培养 人胃腺癌细胞系SGC-7901购自上海细胞生物学研究所. 细胞培养在含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于37℃含50mL/L CO2的培养箱内培养，每2d传代一次.
1.3 Hp与细胞的共同孵育 细胞以5×104/孔密度接种于40孔细胞培养板，置于37℃含50mL/L CO2环境中培养,24h后，弃去原有细胞培养液，加入用RPMI1640(含20mL/L胎牛血清)稀释的不同浓度的细菌菌液，每个浓度重复四孔. 对照孔不加细菌，只加含20mL/L胎牛血清的RPMI1640.
1.4 Hp致细胞空泡变性作用 参照杜平et al[21]介绍的病毒致细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)实验进行. 于Hp与细胞共同孵育后的不同时间，在倒置显微镜下观察细胞空泡变性的情况. 每孔中有≥50%的细胞出现空泡病变时，计为空泡变性作用阳性. Hp引起细胞空泡变性的浓度以TCID50(50 percent tissue culture infection dose)表示，意即使50%细胞培养孔出现空泡变性的细菌浓度. Hp接种后48h，按Reed-Muench公式[21]计算TCID50.
1.5 细胞计数 分别于Hp活菌加入细胞前(0h)及加入后的24，48和72h计数细胞，按常规绘制细胞生长曲线.
1.6 MTT检测 在Hp与细胞共同孵育后的48h，弃去培养液，每孔加入5mg/mL MTT 100μL，于37℃ 50mL/L CO2中孵育4h后去掉MTT，加二甲基亚砜100μL，30min后在酶标仪上测570nm处光密度值(OD).
1.7 Ki-67抗原的免疫组织化学检测 Ki-67的单抗及S-P试剂盒均购自福州迈新公司. 细胞以5×104/孔接种在含小盖玻片的24孔培养板中，24h后加入不同浓度的Hp，每种浓度重复四孔. 在加入Hp后48h取出小盖玻片，丙酮固定，按试剂盒说明书进行Ki-67抗原染色，然后用DAB显色，苏木素复染，常规脱水封片. 用PBS代替第一抗体，作阴性对照，以已知的阳性标本切片作阳性对照. 胞核中出现棕黄色颗粒的细胞为Ki-67阳性细胞. 每张玻片任取五个视野进行细胞计数，至少计数1千个细胞. Ki-67抗原阳性率用阳性细胞数占同一视野细胞总数的百分比表示，每张玻片的阳性率取不同视野阳性率的平均值.
统计学处理 多个样本均数的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),多个实验组与一个对照组的两两比较采用最小显著差法(the least significant difference,LSD)分析.
2 结果
2.1 Hp致细胞空泡变性作用 在倒置显微镜下连续观察接种Hp后的SGC-7901细胞形态，发现在较低浓度活菌(3.2×104CFU/mL～1.6×105CFU/mL)作用下，细胞形态与对照相比无明显异常，核分裂相多见；但在较高浓度时(≥8×105CFU/mL)，培养细胞的胞质内出现空泡，而呈现空泡病变细胞的多少及空泡大小，有明显的量效关系；随着Hp浓度的加大和作用时间的延长，空泡细胞越来越多，细胞内空泡逐渐融合、扩大. 到48h时，细胞病变已十分明显，对照组细胞形态仍保持完好(见图1与图2). TCID50的计算按表1进行[21], 由表可见Hp致细胞空泡变性作用的TCID50介于4×106CFU/mL～8×105CFU/mL两个浓度之间. 两浓度间的距离比例为(高于50%感染百分数-50)÷(高于50%感染百分数-低于50%感染百分数)=(60-50)÷(60-16.7)=0.23. 因此，Hp致细胞空泡变性作用的TCID50=[40-(40-8)×0.23]×105=3.26×106 CFU/mL. 这一结果表明，以3.26×106 CFU/mL的活Hp感染SGC-7901细胞时,约50%细胞会出现空泡变性.
2.2 接种Hp后的SGC-7901细胞增殖 接种Hp活菌前后细胞计数和生长曲线见图3所示，在细胞培养中加入3.2×104 CFU/mL浓度Hp时，72h内SGC-7901的细胞计数与未加Hp的对照基本一样；当Hp浓度增加到1.6×105 CFU/mL，细胞数量较对照组显著增多(P<0.01)；但是Hp浓度继续5倍增加(8×105 CFU/mL)以后，细胞的增殖受到抑制；且随着Hp浓度加大，对细胞的抑制愈益明显. Hp接种48h后细胞培养的MTT检测结果见表2. 方差分析其OD值，差异有显著意义(P<0.05). MTT检测结果与细胞计数结果十分相似，提示当SGC-7901细胞与浓度为1.6×105 CFU/mL的Hp共培养时，可显著促进细胞生长(P<0.01)；但是Hp浓度5倍增加(8×105 CFU/mL)以后，细胞的增殖减少(P<0.05)；当Hp浓度达2×107 CFU/mL和1×108 CFU/mL时，细胞的生长明显被抑制(P<0.01).
2.3 Ki-67抗原的免疫组化 Ki-67抗原是与细胞增殖密切相关的抗原，其阳性率能反映细胞增殖情况，高阳性率意味细胞增殖迅速. Ki-67抗原的免疫组化染色为胞核棕黄色着色(图4)，而未加一抗的阴性对照为苏木精复染的颜色(图5).不同浓度的Hp作用细胞48h后细胞Ki-67抗原阳性率如表3所示，低浓度的Hp(3.2×104 CFU/mL和1.6×105 CFU/mL)作用后,SGC-7901细胞内Ki-67抗原阳性率较对照明显增高(P<0.01)；相反，较高浓度Hp(4×106 CFU/mL和2×107 CFU/mL)作用后，细胞内Ki-67抗原阳性率较对照显著减少(P值分别为0.05与0.01). 这一结果与细胞计数和MTT检测结果亦十分相似，说明不同浓度Hp对培养SGC-7901细胞增殖具有不同的影响.
图1 ×200 未经Hp作用的生长良好的SGC-7901细胞.
图2 ×400 与Hp共培养48h后的SGC-7901细胞，细胞多呈空泡样变.
图3 不同浓度Hp活菌对SGC-7901细胞生长的影响.
图4 ×100 Ki-67抗原阳性着色的细胞，核呈棕黄色.
图5 ×400 免疫组织化学染色的阴性对照，细胞核呈兰色(未加第一抗体).
表1 Hp致细胞病变作用百分率计算
表2 Hp与SGC-7901细胞共培养48h后的MTT检测结果(x±s,OD570)
aP<0.05, bP<0.01, vs 对照组.
表3 SGC-7901细胞与不同浓度Hp共培养48h后的Ki-67抗原阳性率(x±s,%)
aP<0.05, bP<0.01, vs 对照组.
3 讨论
本实验观察了不同浓度Hp产毒株NCTC11637活菌对体外培养人胃腺癌细胞系(SGC-7901细胞)形态与生长的影响. 在本实验条件下(37℃，50mL/L CO2、含20mL/L胎牛血清RPMI1640培养液)，Hp仍能保持生长繁殖，与SGC-7901细胞处于共生状态而又互有影响(部分工作另文报道)，成功地建立了Hp活菌感染胃上皮细胞的体外模型.
实验结果表明，高浓度的Hp使体外培养胃上皮细胞产生空泡病变，随着作用时间的延长，浓度的加大，空泡样变的细胞增多，细胞内空泡数目亦越来越多，且相互融合，逐渐扩大. 具有空泡病变的胃上皮细胞，短期内仍能贴壁生长，超过4d则逐渐漂浮死亡，说明Hp的空泡毒作用暂时是非致死性、可逆转的，但随着时间延长，细胞最终不可避免的死亡. 另外，本实验运用细胞计数、MTT试验、Ki-67抗原检测三种不同的指标同时测定了细胞的生长与增殖情况，结果非常一致：较低浓度的Hp不仅对细胞无明显毒性，反而促进细胞生长繁殖；而在较高浓度时，Hp却明显抑制细胞生长，且浓度越大，抑制作用越显著.
Fan et al用Hp菌体的超声粉碎物作用于人胃癌细胞系AGS[22]，结果表明Hp能促进胃上皮细胞的增殖，与本实验所见低浓度Hp活菌促进胃上皮细胞增殖的结果相似. Hp的这种促胃上皮细胞增殖作用，提示Hp可能是潜在的致胃癌病因. 究竟Hp的哪一种蛋白质或因子促进了胃上皮细胞增殖，尚待进一步研究. 有意义的是Rosperi et al的实验表明，一种新发现的细胞增殖相关基因(pag)与Hp的26KDa抗原基因有50%同源性.
本实验发现，较高浓度的Hp活菌对胃上皮细胞的生长繁殖，与低浓度相反，具有抑制作用. Wagner et al[23]， Knipp et al[24]也观察到类似的结果. Wagner et al使用的也是Hp活菌直接感染胃上皮细胞模型，但他们的结果是较低浓度的Hp也抑制细胞生长繁殖. 导致这种不同结果的原因可能与所用的细胞系和菌株不同有关.
关于Hp抑制细胞生长繁殖的原因，Chen et al发现Hp能诱导胃上皮细胞凋亡，且伴随着BAK基因表达增加[25]. Wagner et al的实验也获得同样的结果，认为Hp抑制细胞增殖与其诱导细胞凋亡增加有关. 本实验结果表明仅在大量Hp作用于细胞时，才引起明显的细胞毒作用，导致细胞空泡变，但空泡细胞在短期内并不立即死亡，这说明Hp抑制细胞增殖的主要原因并不是其细胞毒作用，诱导细胞凋亡可能是其主要原因(此工作正进行中).
在同一细胞系统，缘何低浓度Hp与高浓度Hp作用后所出现的结果完全喾矗馊肥个值得深入研究的问题. Wagner et al的实验也观察到类似互相矛盾的结果[23]. 他们发现低浓度的Hp即可诱导细胞凋亡、细胞增殖减少，但同时DNA合成却趋向增加.究其原因，Hp可能同时具备与细胞增殖和细胞凋亡相关的两类因子. 当低浓度Hp作用于细胞时，Hp的促细胞增殖因子发挥作用，而促细胞凋亡相关因子的作用被细胞的代偿机制所对抗，表现为细胞的DNA合成增加、细胞生长加速；但在高浓度时，Hp的促细胞凋亡作用和致细胞空泡毒作用则占优势，表现为细胞增殖受到抑制.
Hp活菌作用于胃上皮细胞的这种矛盾的“剂量-效应”关系，也可用以部分地解释人体感染Hp后所表现出的不同结果：当机体短期内大量Hp感染时，其细胞毒作用及诱导细胞凋亡作用，可能使胃粘膜出现损伤，导致胃炎或溃疡发生；相反，在小剂量Hp感染时，其促细胞增殖因子可能使胃上皮细胞生长增殖，若如此长期反复作用，可能导致肿瘤发生. 诚然，人体感染Hp后，机体与Hp之间的相互作用非常复杂，除前述因素外，还涉及炎症、免疫等多方面因素. 但是Hp感染剂量的不同，在这一系列事件中可能起着非常重要的作用.
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收稿日期 1999-10-25 接收日期 1999-12-28
Effect of Helicobacter pylori on morphology and growth of gastric epithelial cells
Yi Yang1, Chang-Sheng Deng1, Xue-Jun Yao2， Han-Yan Liu2 and Mo Chen2
Abstract
AIM To investigate the effect of Helicobacter pylori (Hp) on the cell morphology, growth and proliferation of human gastric epithelial cells in vitro.
METHODS The Hp was coincubated with human gastric cancer cell line SGC-7901 for up to 72 hours and its effect on cell number, MTT test and expression of Ki-67 antigen were assessed.
RESULTS The detection of cytopathic effect of Hp showed that Hp 3.26×106 CFU/mL may induce vacuolation of 50% gastric epithelial cells. The cell counting, MTT test and immunohistochemical analysis of Ki-67 antigen presented a similar result: at a low concentration of Hp (≤1.6×105 CFU/mL), the cell growth and proliferation of the gastric epithelial cells increased; but at a high concentration of the Hp (≥8×105 CFU/mL) the cell proliferation was inhibited in a dosage-dependent manner.
CONCLUSION Hp could either increase the cell growth and proliferation or inhibit the cell proliferation, based on the Hp concentration in the system.
Subject headings Helicobacter pylori; gastric epithelial cell; cell culture; cell growth and proliferation; vacuolation
Yang Y, Deng CS, Yao XJ, Liu HY, Chen M. Effect of Helicobacter pylori on morphology and growth of gastric epithelial cells. Shijie HuarenXiaohua Zazhi, 2000;8(5):500-504
摘要
目的 研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)活菌对体外培养的胃上皮细胞形态与生长的影响.
方法 采用Hp与细胞体外共培养技术，结合细胞计数、MTT检测及Ki-67抗原的免疫组化分析，观察Hp活菌对人胃腺癌细胞系SGC-7901生长增殖的影响，同时参照病毒的致细胞病变效应实验计算Hp引起50%细胞空泡变性所需的最低浓度.
结果 ①细胞毒效应实验表明，3.26×106 CFU/mL的Hp能使50%的细胞出现空泡变性；②细胞计数结果显示，在培养的细胞中加入3.2×104 CFU/mL Hp时，72h内SGC-7901细胞的数量与未加Hp的对照组基本一样；当Hp浓度增加到1.6×105CFU/mL时，细胞数量较对照组显著增多；但是Hp浓度继续增加5倍后，细胞增殖受到抑制，且随Hp浓度进一步加大，抑制效应愈大，差异有显著性(P<0.01). ③MTT检测结果与细胞计数结果十分相似，当终浓度为1.6×105CFU/mL的Hp与细胞共培养时，可显著促进细胞生长(P<0.01)；但是Hp浓度5倍增加(8×105 CFU/mL)以后，细胞的增殖减少(P<0.05)；当Hp浓度达2×107 CFU/mL和1×108 CFU/mL时，细胞的生长明显被抑制(P<0.01). ④Ki-67抗原的免疫组化分析显示，阳性细胞的胞核呈棕黄色着色，低浓度的Hp(3.2×104 CFU/mL和1.6×105 CFU/mL)作用后,SGC-7901细胞内Ki-67抗原阳性率较对照明显增高(P<0.01)；相反，较高浓度Hp(4×106 CFU/mL和2×107 CFU/mL)作用后，细胞内Ki-67抗原阳性率较对照显著减少(P值分别为0.05与0.01).
结论 较低浓度的Hp不仅对细胞未显示明显的毒性，反而对细胞的生长增殖有一定的促进作用；而较高浓度的Hp却明显抑制细胞增殖，且浓度越大，抑制作用越显著. Hp对细胞增殖的双向效应可能与其同时具有促进和抑制细胞增殖两类因素有关. 本实验结果可用以部分解释人体感染Hp后所表现的不同结局.
主题词 幽门螺杆菌；胃上皮细胞；细胞培养；细胞生长与增殖 ；空泡毒作用
杨艺,邓长生,姚学军,刘汉燕,陈默. 幽门螺杆菌对胃上皮细胞形态与生长的影响. 世界华人消化杂志，2000；8(5)：500-504
0 引言
研究证明,幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是引起慢性B型胃炎的病因[1-4],是消化性溃疡的重要致病因子[5,6]，且与胃癌发生有关[7-16].关于Hp引起胃粘膜病变的确切机制，尚未完全明了. 各国学者有关Hp毒素致病机制的报道[17-20]较为多见. 至于Hp活菌体直接对胃粘膜上皮细胞作用的研究，仅见国外有少数报道，但其结果各不相同，甚至彼此矛盾. 为了进一步认识活体条件下Hp的致病机制，本研究用体外细胞培养技术，观察了Hp活菌对胃上皮细胞系生长与增殖的影响，以及它的致细胞空泡病变作用.
1 材料和方法
1.1 Hp活菌悬液的制备 Hp国际标准菌株NCTC 11637接种于含50mL/L羊血的厌氧菌分离培养基平板,置于37℃微需氧环境中(50mL/L O2，100mL/L CO2，50mL/L H2，800mL/L N2)培养,3d后收集细菌,用PBS制成细菌悬液,在分光光度计上确定Hp的浓度(1 OD660=1×108CFU/mL),然后用含20mL/L胎牛血清的RPMI1640作稀释液,将Hp菌液作连续5倍稀释(1×108CFU/mL～3.2×104CFU/mL).
1.2 人胃腺癌细胞系SGC-7901的培养 人胃腺癌细胞系SGC-7901购自上海细胞生物学研究所. 细胞培养在含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于37℃含50mL/L CO2的培养箱内培养，每2d传代一次.
1.3 Hp与细胞的共同孵育 细胞以5×104/孔密度接种于40孔细胞培养板，置于37℃含50mL/L CO2环境中培养,24h后，弃去原有细胞培养液，加入用RPMI1640(含20mL/L胎牛血清)稀释的不同浓度的细菌菌液，每个浓度重复四孔. 对照孔不加细菌，只加含20mL/L胎牛血清的RPMI1640.
1.4 Hp致细胞空泡变性作用 参照杜平et al[21]介绍的病毒致细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)实验进行. 于Hp与细胞共同孵育后的不同时间，在倒置显微镜下观察细胞空泡变性的情况. 每孔中有≥50%的细胞出现空泡病变时，计为空泡变性作用阳性. Hp引起细胞空泡变性的浓度以TCID50(50 percent tissue culture infection dose)表示，意即使50%细胞培养孔出现空泡变性的细菌浓度. Hp接种后48h，按Reed-Muench公式[21]计算TCID50.
1.5 细胞计数 分别于Hp活菌加入细胞前(0h)及加入后的24，48和72h计数细胞，按常规绘制细胞生长曲线.
1.6 MTT检测 在Hp与细胞共同孵育后的48h，弃去培养液，每孔加入5mg/mL MTT 100μL，于37℃ 50mL/L CO2中孵育4h后去掉MTT，加二甲基亚砜100μL，30min后在酶标仪上测570nm处光密度值(OD).
1.7 Ki-67抗原的免疫组织化学检测 Ki-67的单抗及S-P试剂盒均购自福州迈新公司. 细胞以5×104/孔接种在含小盖玻片的24孔培养板中，24h后加入不同浓度的Hp，每种浓度重复四孔. 在加入Hp后48h取出小盖玻片，丙酮固定，按试剂盒说明书进行Ki-67抗原染色，然后用DAB显色，苏木素复染，常规脱水封片. 用PBS代替第一抗体，作阴性对照，以已知的阳性标本切片作阳性对照. 胞核中出现棕黄色颗粒的细胞为Ki-67阳性细胞. 每张玻片任取五个视野进行细胞计数，至少计数1千个细胞. Ki-67抗原阳性率用阳性细胞数占同一视野细胞总数的百分比表示，每张玻片的阳性率取不同视野阳性率的平均值.
统计学处理 多个样本均数的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),多个实验组与一个对照组的两两比较采用最小显著差法(the least significant difference,LSD)分析.
2 结果
2.1 Hp致细胞空泡变性作用 在倒置显微镜下连续观察接种Hp后的SGC-7901细胞形态，发现在较低浓度活菌(3.2×104CFU/mL～1.6×105CFU/mL)作用下，细胞形态与对照相比无明显异常，核分裂相多见；但在较高浓度时(≥8×105CFU/mL)，培养细胞的胞质内出现空泡，而呈现空泡病变细胞的多少及空泡大小，有明显的量效关系；随着Hp浓度的加大和作用时间的延长，空泡细胞越来越多，细胞内空泡逐渐融合、扩大. 到48h时，细胞病变已十分明显，对照组细胞形态仍保持完好(见图1与图2). TCID50的计算按表1进行[21], 由表可见Hp致细胞空泡变性作用的TCID50介于4×106CFU/mL～8×105CFU/mL两个浓度之间. 两浓度间的距离比例为(高于50%感染百分数-50)÷(高于50%感染百分数-低于50%感染百分数)=(60-50)÷(60-16.7)=0.23. 因此，Hp致细胞空泡变性作用的TCID50=[40-(40-8)×0.23]×105=3.26×106 CFU/mL. 这一结果表明，以3.26×106 CFU/mL的活Hp感染SGC-7901细胞时,约50%细胞会出现空泡变性.
2.2 接种Hp后的SGC-7901细胞增殖 接种Hp活菌前后细胞计数和生长曲线见图3所示，在细胞培养中加入3.2×104 CFU/mL浓度Hp时，72h内SGC-7901的细胞计数与未加Hp的对照基本一样；当Hp浓度增加到1.6×105 CFU/mL，细胞数量较对照组显著增多(P<0.01)；但是Hp浓度继续5倍增加(8×105 CFU/mL)以后，细胞的增殖受到抑制；且随着Hp浓度加大，对细胞的抑制愈益明显. Hp接种48h后细胞培养的MTT检测结果见表2. 方差分析其OD值，差异有显著意义(P<0.05). MTT检测结果与细胞计数结果十分相似，提示当SGC-7901细胞与浓度为1.6×105 CFU/mL的Hp共培养时，可显著促进细胞生长(P<0.01)；但是Hp浓度5倍增加(8×105 CFU/mL)以后，细胞的增殖减少(P<0.05)；当Hp浓度达2×107 CFU/mL和1×108 CFU/mL时，细胞的生长明显被抑制(P<0.01).
2.3 Ki-67抗原的免疫组化 Ki-67抗原是与细胞增殖密切相关的抗原，其阳性率能反映细胞增殖情况，高阳性率意味细胞增殖迅速. Ki-67抗原的免疫组化染色为胞核棕黄色着色(图4)，而未加一抗的阴性对照为苏木精复染的颜色(图5).不同浓度的Hp作用细胞48h后细胞Ki-67抗原阳性率如表3所示，低浓度的Hp(3.2×104 CFU/mL和1.6×105 CFU/mL)作用后,SGC-7901细胞内Ki-67抗原阳性率较对照明显增高(P<0.01)；相反，较高浓度Hp(4×106 CFU/mL和2×107 CFU/mL)作用后，细胞内Ki-67抗原阳性率较对照显著减少(P值分别为0.05与0.01). 这一结果与细胞计数和MTT检测结果亦十分相似，说明不同浓度Hp对培养SGC-7901细胞增殖具有不同的影响.
图1 ×200 未经Hp作用的生长良好的SGC-7901细胞.
图2 ×400 与Hp共培养48h后的SGC-7901细胞，细胞多呈空泡样变.
图3 不同浓度Hp活菌对SGC-7901细胞生长的影响.
图4 ×100 Ki-67抗原阳性着色的细胞，核呈棕黄色.
图5 ×400 免疫组织化学染色的阴性对照，细胞核呈兰色(未加第一抗体).
表1 Hp致细胞病变作用百分率计算
| 活菌浓度(CFU/mL) | 细胞培养 (病变孔数/接种孔数) | 累计孔数 | 病变细胞 | ||
| 有病变 | 无病变 | 比例 | 百分比 | ||
| 108 | 4/4 | 11 | 0 | 11/11 | 100 |
| 2×107 | 4/4 | 7 | 0 | 7/7 | 100 |
| 4×106 | 2/4 | 3 | 2 | 3/5 | 60 |
| 8×105 | 1/4 | 1 | 5 | 1/6 | 16.7 |
| 1.6×105 | 0/4 | 0 | 5 | 0/5 | 0 |
| 3.2×104 | 0/4 | 0 | 5 | 0/5 | 0 |
表2 Hp与SGC-7901细胞共培养48h后的MTT检测结果(x±s,OD570)
| 对照组 | Hp组(CFU/mL): | 3.2×104 | 1.6×105 | 8×105 | 4×106 | 2×107 | 1×108 |
| 0.31±0.02 | 0.33±0.02 | 0.37±0.05b | 0.29±0.03 | 0.26±0.04a | 0.23±0.04b | 0.21±0.02b |
aP<0.05, bP<0.01, vs 对照组.
表3 SGC-7901细胞与不同浓度Hp共培养48h后的Ki-67抗原阳性率(x±s,%)
| 对照组 | Hp组(CFU/mL): | 3.2×104 | 1.6×105 | 8×105 | 4×106 | 2×107 |
| 55.25±6.80 | 73.75±7.14b | 90.00±6.80b | 50.75±6.61 | 42.25±6.75a | 21.25±3.30b |
aP<0.05, bP<0.01, vs 对照组.
3 讨论
本实验观察了不同浓度Hp产毒株NCTC11637活菌对体外培养人胃腺癌细胞系(SGC-7901细胞)形态与生长的影响. 在本实验条件下(37℃，50mL/L CO2、含20mL/L胎牛血清RPMI1640培养液)，Hp仍能保持生长繁殖，与SGC-7901细胞处于共生状态而又互有影响(部分工作另文报道)，成功地建立了Hp活菌感染胃上皮细胞的体外模型.
实验结果表明，高浓度的Hp使体外培养胃上皮细胞产生空泡病变，随着作用时间的延长，浓度的加大，空泡样变的细胞增多，细胞内空泡数目亦越来越多，且相互融合，逐渐扩大. 具有空泡病变的胃上皮细胞，短期内仍能贴壁生长，超过4d则逐渐漂浮死亡，说明Hp的空泡毒作用暂时是非致死性、可逆转的，但随着时间延长，细胞最终不可避免的死亡. 另外，本实验运用细胞计数、MTT试验、Ki-67抗原检测三种不同的指标同时测定了细胞的生长与增殖情况，结果非常一致：较低浓度的Hp不仅对细胞无明显毒性，反而促进细胞生长繁殖；而在较高浓度时，Hp却明显抑制细胞生长，且浓度越大，抑制作用越显著.
Fan et al用Hp菌体的超声粉碎物作用于人胃癌细胞系AGS[22]，结果表明Hp能促进胃上皮细胞的增殖，与本实验所见低浓度Hp活菌促进胃上皮细胞增殖的结果相似. Hp的这种促胃上皮细胞增殖作用，提示Hp可能是潜在的致胃癌病因. 究竟Hp的哪一种蛋白质或因子促进了胃上皮细胞增殖，尚待进一步研究. 有意义的是Rosperi et al的实验表明，一种新发现的细胞增殖相关基因(pag)与Hp的26KDa抗原基因有50%同源性.
本实验发现，较高浓度的Hp活菌对胃上皮细胞的生长繁殖，与低浓度相反，具有抑制作用. Wagner et al[23]， Knipp et al[24]也观察到类似的结果. Wagner et al使用的也是Hp活菌直接感染胃上皮细胞模型，但他们的结果是较低浓度的Hp也抑制细胞生长繁殖. 导致这种不同结果的原因可能与所用的细胞系和菌株不同有关.
关于Hp抑制细胞生长繁殖的原因，Chen et al发现Hp能诱导胃上皮细胞凋亡，且伴随着BAK基因表达增加[25]. Wagner et al的实验也获得同样的结果，认为Hp抑制细胞增殖与其诱导细胞凋亡增加有关. 本实验结果表明仅在大量Hp作用于细胞时，才引起明显的细胞毒作用，导致细胞空泡变，但空泡细胞在短期内并不立即死亡，这说明Hp抑制细胞增殖的主要原因并不是其细胞毒作用，诱导细胞凋亡可能是其主要原因(此工作正进行中).
在同一细胞系统，缘何低浓度Hp与高浓度Hp作用后所出现的结果完全喾矗馊肥个值得深入研究的问题. Wagner et al的实验也观察到类似互相矛盾的结果[23]. 他们发现低浓度的Hp即可诱导细胞凋亡、细胞增殖减少，但同时DNA合成却趋向增加.究其原因，Hp可能同时具备与细胞增殖和细胞凋亡相关的两类因子. 当低浓度Hp作用于细胞时，Hp的促细胞增殖因子发挥作用，而促细胞凋亡相关因子的作用被细胞的代偿机制所对抗，表现为细胞的DNA合成增加、细胞生长加速；但在高浓度时，Hp的促细胞凋亡作用和致细胞空泡毒作用则占优势，表现为细胞增殖受到抑制.
Hp活菌作用于胃上皮细胞的这种矛盾的“剂量-效应”关系，也可用以部分地解释人体感染Hp后所表现出的不同结果：当机体短期内大量Hp感染时，其细胞毒作用及诱导细胞凋亡作用，可能使胃粘膜出现损伤，导致胃炎或溃疡发生；相反，在小剂量Hp感染时，其促细胞增殖因子可能使胃上皮细胞生长增殖，若如此长期反复作用，可能导致肿瘤发生. 诚然，人体感染Hp后，机体与Hp之间的相互作用非常复杂，除前述因素外，还涉及炎症、免疫等多方面因素. 但是Hp感染剂量的不同，在这一系列事件中可能起着非常重要的作用.
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