抗VEGF抗体及抗KDR抗体对人大肠癌细胞系 及脐静脉内皮细胞系的生长抑制作用
1 中国人民解放军第一军医大学珠江医院普通外科 广东省广州市 510282
2 华西医科大学附二院妇产科 四川省成都市
项目负责人 陈治中国人民解放军第一军医大学珠江医院普通外科 广东省广州市 510282
收稿日期 2000-01-14 接收日期 2000-02-02
Subject headings colorectal neoplasms; endothelial, vascular; angiogenesis factor; umbilical veins; cells, cultured; antibodies
, 百拇医药
主题词 结肠直肠肿瘤；内皮，血管；血管生成因子；脐静脉；细胞，培养；抗体
陈治,王晓莉,张莉,黄宗海,潘玉先,曹长安. 抗VEGF抗体及抗KDR抗体对人大肠癌细胞系及脐静脉内皮细胞系的生长抑制作用.
世界华人消化杂志，2000；8(5)：588-589
1 材料和方法
1.1 材料 ①细胞：LoVo人大肠癌细胞由第一军医大学消化研究所中心实验室提供；人脐静脉内皮细胞由本室按杨小平法[1]传代培养；②抗体：小鼠抗人VEGF(IgGl)为美国Neuwork公司产品；小鼠抗人KDR抗体(IgGl)为美国Sigma公司产品.
, 百拇医药
1.2 方法 细胞培养及细胞毒性实验：将冻存的LoVo细胞进行复苏及传代，并制成细胞悬液，加入96孔培养板中，1×104/孔. 同法加入传代培养的人脐静脉内皮细胞. 将培养板移入CO2孵箱中于37℃，50mL/L CO2及饱和湿度条件下培养. 培养1d后按表1及表2分别加入不同浓度的抗VEGF抗体及抗KDR抗体，每个浓度设6个复孔，并设对照孔(未加药物，代以PBS)和空白孔(未加细胞). 培养3d后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL) 20μL 37℃反应4h，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μL二甲亚砜(DMSO)，充分溶解后测490nm吸光度(OD)值，按下列公式计算细胞生长抑制率：
生长抑制率=1-(实验组平均OD-空白对照组平均OD / 细胞对照组平均OD-空白对照组平均OD)×100%
统计学处理 用Spess 8.0统计分析软件，对所获得的数据进行显著性方差分析.
, 百拇医药
2 结果
抗VEGF抗体及抗KDR抗体对LoVo细胞和人脐静脉内皮细胞的作用结果(表1，表2)：①抗VEGF抗体的浓度从100μg/mL至0.1μg/mL时，对脐静脉内皮细胞的生长有一定抑制作用，但无显著性差异(P>0.05)；抗KDR抗体浓度从100μg/mL至0.1μg/mL时，均有显著抑制作用(P<0.01). ②抗VEGF抗体的浓度从100μg/mL至1μg/mL时，对LoVo细胞的生长均具有显著的抑制作用(P<0.01)，低于1μg/mL时，无明显抑制作用(P>0.05)；抗KDR抗体浓度从100μg/mL至0.1μg/mL时，均有显著抑制作用(P<0.01). ③相同浓度条件下，抗KDR抗体的抑制作用较抗VEGF抗体更为明显(P<0.05).
表1 不同浓度的抗体对人脐静脉内皮细胞的作用结果(x±s)
, 百拇医药
表2 不同浓度的抗体对人大肠癌LoVo细胞的作用结果(x±s)
, 百拇医药
3 讨论
VEGF作为一种分泌性糖蛋白与肿瘤血管形成密切相关，其作用的发挥是通过作用于内皮细胞上的两个受体Flt和Flk-1/KDR来实现的，与肿瘤血管形成相关的受体主要是Flk-1/KDR，KDR是人体内的VEGF受体形式，KDR在鼠类中的同源产物是Flk-1[2].
我们选用人脐静脉内皮细胞系及人大肠癌LoVo细胞系，将不同浓度的抗VEGF抗体及抗KDR抗体分别加入人脐静脉内皮细胞及LoVo细胞的培养液中，通过MTT法检测培养细胞的活力并计算杀伤率，结果说明：①LoVo细胞可以合成和分泌VEGF，抗VEGF抗体可以通过中和VEGF的作用明显抑制LoVo细胞的生长；脐静脉内皮细胞也可合成和分泌少量VEGF，抗VEGF抗体对其生长有一定的抑制作用. 我们在以前的实验中并未发现血管内皮细胞有VEGF染色阳性，可能与血管内皮细胞合成VEGF的量甚少有关[3]. ②LoVo细胞及脐静脉内皮细胞均存在VEGF受体KDR，抗KDR抗体可以通过封闭KDR明显抑制这两种细胞的生长. ③与抗VEGF抗体相比，较小剂量的抗KDR抗体就能达到明显的抑制作用.
, 百拇医药
通过本实验进一步证实，①VEGF不但可通过旁分泌途径诱导肿瘤血管形成，从而促进肿瘤细胞的生长，而且可以作为一种自分泌调节因子直接刺激肿瘤细胞的生长，抗VEGF抗体及抗KDR抗体作用的发挥是通过阻断这两种途径来实现的. ②体外培养条件下，以VEGF为靶点及以VEGF的受体KDR为靶点均有显著的抑制肿瘤细胞及血管内皮细胞生长的作用，但以KDR为靶点所用的药物剂量较以VEGF为靶点明显为小，更能达到高效、低毒的作用效果.
4 参考文献
1 杨小平，陈国芬，张英珊. 人脐静脉内皮细胞培养及形态观察. 中华心血管病杂志，1988；16：298-300
2 Witte L, Hicklin DJ, Zhu ZP, Pytowski B, Kotanides H, Rockwell P, Bhlen P. Monoclonal antibodies targeting the VEGF
receptor-2 (Flk-1/KDR) as an anti-angiogenic therapeutic strategy. Cancer And Metastasis Reviews, 1998;17:155-161
3 陈治，王晓莉，张莉，黄宗海，潘玉先，曹长安. 血管内皮生长因子及其受体在人大肠癌组织中的分布、定量和意义.
世界华人消化杂志，2000;8:472-473, 百拇医药(陈 治1 王晓莉2 张 莉2 黄宗海1 潘玉先1 曹长安1 )
2 华西医科大学附二院妇产科 四川省成都市
项目负责人 陈治中国人民解放军第一军医大学珠江医院普通外科 广东省广州市 510282
收稿日期 2000-01-14 接收日期 2000-02-02
Subject headings colorectal neoplasms; endothelial, vascular; angiogenesis factor; umbilical veins; cells, cultured; antibodies
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主题词 结肠直肠肿瘤；内皮，血管；血管生成因子；脐静脉；细胞，培养；抗体
陈治,王晓莉,张莉,黄宗海,潘玉先,曹长安. 抗VEGF抗体及抗KDR抗体对人大肠癌细胞系及脐静脉内皮细胞系的生长抑制作用.
世界华人消化杂志，2000；8(5)：588-589
1 材料和方法
1.1 材料 ①细胞：LoVo人大肠癌细胞由第一军医大学消化研究所中心实验室提供；人脐静脉内皮细胞由本室按杨小平法[1]传代培养；②抗体：小鼠抗人VEGF(IgGl)为美国Neuwork公司产品；小鼠抗人KDR抗体(IgGl)为美国Sigma公司产品.
, 百拇医药
1.2 方法 细胞培养及细胞毒性实验：将冻存的LoVo细胞进行复苏及传代，并制成细胞悬液，加入96孔培养板中，1×104/孔. 同法加入传代培养的人脐静脉内皮细胞. 将培养板移入CO2孵箱中于37℃，50mL/L CO2及饱和湿度条件下培养. 培养1d后按表1及表2分别加入不同浓度的抗VEGF抗体及抗KDR抗体，每个浓度设6个复孔，并设对照孔(未加药物，代以PBS)和空白孔(未加细胞). 培养3d后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL) 20μL 37℃反应4h，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μL二甲亚砜(DMSO)，充分溶解后测490nm吸光度(OD)值，按下列公式计算细胞生长抑制率：
生长抑制率=1-(实验组平均OD-空白对照组平均OD / 细胞对照组平均OD-空白对照组平均OD)×100%
统计学处理 用Spess 8.0统计分析软件，对所获得的数据进行显著性方差分析.
, 百拇医药
2 结果
抗VEGF抗体及抗KDR抗体对LoVo细胞和人脐静脉内皮细胞的作用结果(表1，表2)：①抗VEGF抗体的浓度从100μg/mL至0.1μg/mL时，对脐静脉内皮细胞的生长有一定抑制作用，但无显著性差异(P>0.05)；抗KDR抗体浓度从100μg/mL至0.1μg/mL时，均有显著抑制作用(P<0.01). ②抗VEGF抗体的浓度从100μg/mL至1μg/mL时，对LoVo细胞的生长均具有显著的抑制作用(P<0.01)，低于1μg/mL时，无明显抑制作用(P>0.05)；抗KDR抗体浓度从100μg/mL至0.1μg/mL时，均有显著抑制作用(P<0.01). ③相同浓度条件下，抗KDR抗体的抑制作用较抗VEGF抗体更为明显(P<0.05).
表1 不同浓度的抗体对人脐静脉内皮细胞的作用结果(x±s)
| 抗体浓度(μg/mL) | VEGF | KDR | ||
| OD值 | 抑制率% | OD值 | 抑制率% | |
| 100 | 1.057±0.268 | 0.8 | 0.286±0.020 | 71.2 |
| 10 | 1.057±0.202 | 0.8 | 0.545±0.030 | 48.8 |
| 1.0 | 1.059±0.322 | 0.6 | 0.796±0.012 | 25.3 |
| 0.1 | 1.060±0.260 | 0.5 | 0.975±0.153 | 8.5 |
| PBS对照 | 1.065±0.009 | 0 | 1.065±0.009 | 0 |
, 百拇医药
表2 不同浓度的抗体对人大肠癌LoVo细胞的作用结果(x±s)
| 抗体浓度(μg/mL) | VEGF | KDR | ||
| OD值 | 抑制率% | OD值 | 抑制率% | |
| 100 | 0.220±0.021 | 79.5 | 0.102±0.026 | 90.5 |
| 10 | 0.585±0.017 | 45.4 | 0.357±0.012 | 66.7 |
| 1.0 | 0.796±0.025 | 25.8 | 0.623±0.023 | 41.9 |
| 0.1 | 1.069±0.036 | 0.3 | 0.896±0.017 | 16.4 |
| PBS对照 | 1.072±0.043 | 0 | 1.072±0.043 | 0 |
, 百拇医药
3 讨论
VEGF作为一种分泌性糖蛋白与肿瘤血管形成密切相关，其作用的发挥是通过作用于内皮细胞上的两个受体Flt和Flk-1/KDR来实现的，与肿瘤血管形成相关的受体主要是Flk-1/KDR，KDR是人体内的VEGF受体形式，KDR在鼠类中的同源产物是Flk-1[2].
我们选用人脐静脉内皮细胞系及人大肠癌LoVo细胞系，将不同浓度的抗VEGF抗体及抗KDR抗体分别加入人脐静脉内皮细胞及LoVo细胞的培养液中，通过MTT法检测培养细胞的活力并计算杀伤率，结果说明：①LoVo细胞可以合成和分泌VEGF，抗VEGF抗体可以通过中和VEGF的作用明显抑制LoVo细胞的生长；脐静脉内皮细胞也可合成和分泌少量VEGF，抗VEGF抗体对其生长有一定的抑制作用. 我们在以前的实验中并未发现血管内皮细胞有VEGF染色阳性，可能与血管内皮细胞合成VEGF的量甚少有关[3]. ②LoVo细胞及脐静脉内皮细胞均存在VEGF受体KDR，抗KDR抗体可以通过封闭KDR明显抑制这两种细胞的生长. ③与抗VEGF抗体相比，较小剂量的抗KDR抗体就能达到明显的抑制作用.
, 百拇医药
通过本实验进一步证实，①VEGF不但可通过旁分泌途径诱导肿瘤血管形成，从而促进肿瘤细胞的生长，而且可以作为一种自分泌调节因子直接刺激肿瘤细胞的生长，抗VEGF抗体及抗KDR抗体作用的发挥是通过阻断这两种途径来实现的. ②体外培养条件下，以VEGF为靶点及以VEGF的受体KDR为靶点均有显著的抑制肿瘤细胞及血管内皮细胞生长的作用，但以KDR为靶点所用的药物剂量较以VEGF为靶点明显为小，更能达到高效、低毒的作用效果.
4 参考文献
1 杨小平，陈国芬，张英珊. 人脐静脉内皮细胞培养及形态观察. 中华心血管病杂志，1988；16：298-300
2 Witte L, Hicklin DJ, Zhu ZP, Pytowski B, Kotanides H, Rockwell P, Bhlen P. Monoclonal antibodies targeting the VEGF
receptor-2 (Flk-1/KDR) as an anti-angiogenic therapeutic strategy. Cancer And Metastasis Reviews, 1998;17:155-161
3 陈治，王晓莉，张莉，黄宗海，潘玉先，曹长安. 血管内皮生长因子及其受体在人大肠癌组织中的分布、定量和意义.
世界华人消化杂志，2000;8:472-473, 百拇医药(陈 治1 王晓莉2 张 莉2 黄宗海1 潘玉先1 曹长安1 )