HBsAg,HCV-Ag和AFP在肝硬变和肝细胞癌组织中的表达
1 中国人民解放军264医院传染科 山西省太原市 030001
2 中国人民解放军第四军医大学西京医院临床免疫科 陕西省西安市 710032
翟守恒,男,1962-07-11生,山西省浑源县人,汉族. 1985年第四军医大学本科毕业,学士,1999年第四军医大学研究生毕业,硕士,主治医师,主要从事肝病免疫发病机制和免疫治疗的研究，发表论文5篇.
项目负责人 翟守恒，030001，山西省太原市，中国人民解放军264医院传染科.
1 Department of Infectious Diseases, Chinese PLA 264 Hospital, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
2 Department of Clinical Immunology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi＇an 710032, Shannxi Province, China
Correspondence to Shou-Heng Zhai, Department of Infectious Diseases, Chinese PLA 264 Hospital, Taiyuan 030001,Shanxi Province, China
Tel. 0086-351-4926111 Ext.88607(H)
收稿日期 1999-11-29 接收日期 2000-02-01
Expression of HBsAg, HCV-Ag and AFP in liver cirrhosis and hepatocarcinoma
Shou-Heng Zhai1, Jun-Bin Liu2, Yun-Mei Liu1, Ling-Li Zhang1 and Zhi-Ping Du1
Abstract
AIM To probe into the significance of expression of HBsAg, HCV-Ag and AFP in anti-tumor immune response to hepatocarcinoma.
METHODS Immunohistochemical APA technique was used to study the expression, location and distribution of these antigens.
RESULTS In liver cirrhosis the positive rate of HBsAg, HCV-Ag and AFP was 53.3%(16/30), 63.3%(19/30) and 26.7%(8/30), respectively. In human hepatocarcinoma, the positive rate of HBsAg, HCV-Ag and AFP was 17.5%(7/40), 52.5%(21/40) and 45.0%(18/40), respectively. In pericancerous tissue (PCT), the positive rate of HBsAg, HCV-Ag and AFP was 65.6%(21/32), 50.0%(16/32) and 3.1%(1/32), respectively. Statistical analysis suggested that the positive rate of HBsAg was significantly lower in hepatocarcinoma than that in liver cirrhosis (χ2=9.977, P<0.01) and in PCT (χ2=17.325, P<0.01). No significant difference was found in the positive rate of HCV-Ag between HCC and LC and PCT. The positive rate of AFP in HCC was significantly higher than that in PCT (χ2=16.048, P<0.01), but no significant difference was found between HCC and LC.
CONCLUSION HBsAg, HCV-Ag and AFP were closely related to the occurrence of hepatocarcinoma. AFP might be the main target antigen for CTL, but high level serum AFP might repress the function of CTL to tumor cells. Therefore, sufficient anti-AFP antibody may be a hopeful therapy for hepatocarcinoma patients whose serum AFP was positive.
Subject headings hepatitis B virus; hepatitis C virus; liver cirrhosis; liver neoplasms; immunohistochemistry; antigens;
serology; therapeutics; alpha fetoproteins
Zhai SH, Liu JB, Liu YM, Zhang LL, Du ZP. Expression of HBsAg, HCV-Ag and AFP in liver cirrhosis and hepatocarcinoma.
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 2000;8(5):524-527
摘要
目的 探讨HBsAg,HCV-Ag和AFP在抗肝癌免疫应答中的意义.
方法 用免疫组织化学APA法检测HBsAg,HCV-Ag和AFP在肝硬变和肝细胞癌中的表达、定位和分布.
结果 在LC组织中,HBsAg为53.3%(16/30),HCV-Ag为63.3%(19/30),AFP为26.7%(8/30);在HCC组织中, HBsAg为17.5%(7/40),HCV-Ag为 52.5%(21/40),AFP为45.0%(18/40);在癌周围组织(PCT)中, HBsAg5.6%(21/32),HCV-Ag为50.0%(16/32),AFP为3.1%(1/32);统计学处理显示,在HCC组织中,HBsAg阳性率显著低于LC(χ2 =9.977,P<0.01)和PCT(χ2 =17.325,P<0.01);HCV-Ag阳性率与LC和PCT无显著差异; AFP阳性率显著高于PCT(χ 2 =16.048,P<0.01),与LC无显著差异.
结论 HBsAg,HCV-Ag和AFP与肝癌的发生有密切的关系,AFP可能是CTL攻击的主要靶抗原. 但血清中高浓度的AFP可能阻断了CTL的作用. 因此,用足量的抗AFP抗体来治疗AFP阳性肝癌可能是一条有希望的途径.
主题词 肝炎病毒,乙型; 肝炎病毒,丙型; 肝硬化; 肝肿瘤; 免疫组织化学; 抗原; 血清学; 治疗学; 甲胎蛋白类
翟守恒,刘俊彬,刘云梅,张玲莉,杜志平. HBsAg, HCV-Ag和AFP在肝硬变和肝细胞癌组织中的表达. 世界华人消化杂志，2000；8(5)：524-527
0 引言
慢性病毒性肝炎、肝硬变(LC)和肝细胞癌(HCC)三者关系密切.T细胞免疫应答在清除感染细胞内的病毒、引起肝细胞免疫损伤和抗肿瘤免疫应答中都起着关键作用[1-3]. 病毒抗原HBsAg, HCV-Ag和肿瘤相关抗原AFP在诱导肝炎、肝硬变和肝细胞癌的免疫应答中起着重要作用. 近年来,有关HBsAg, HCV-Ag和AFP在慢性肝炎、肝硬变和肝细胞癌组织中的表达,国内外均已有不少报道[4-24],但有关这些抗原在抗肝癌免疫应答中作用的研究却为数不多. 本研究通过检测LC,HCC和癌周组织(PCT)中这三种抗原的表达、定位和分布,从不同角度来探讨其在抗肝癌免疫应答中的意义,为进一步研究肝癌的免疫治疗打下基础.
1 材料和方法
1.1 材料 HCC 40例和LC 30例标本均来自西京医院并经病理检查证实. HCC 40例中32例含有PCT. 所有标本经100mL/L福尔马林固定,常规脱水,石蜡包埋,制备5μm切片备用. 主要试剂：鼠抗人HBsAg (A34060259p)单克隆抗体IgG2b(即用型)为Biogenex公司产品,鼠抗人HCV-Ag多克隆抗体(1∶100稀释) 和APA免疫组化染色试剂盒为武汉博士德公司产品. 鼠抗人AFP(C3)单克隆抗体IgG2a(即用型)为Sigma公司产品.
1.2 方法 切片常规脱蜡至水,30mL/L H2O2 10min灭活内源性酶,0.01mol/L枸橼酸缓冲液修复抗原. 染色步骤按武汉博士德公司APA免疫组化染色试剂盒说明书进行.DAB液显色,苏木素复染,脱水透明后封片,光镜观察. 阳性反应呈棕黄色颗粒状,阴性为无阳性反应. 取已知血清HBsAg, HCV-Ag和AFP阳性肝硬变和肝癌组织为阳性对照,健康人肝破裂手术切除肝组织作阴性对照. 以10g/L小牛血清清蛋白-PBS液替代一抗作空白对照.χ2 检验.
2 结果
2.1 HBsAg在LC,HCC和PCT组织中的表达 (表1)HBsAg在LC, PCT和HCC组织中均以胞质表达为主,阳性形式有全胞质型、包涵体型、胞质周边型和核周型,全胞质型和包涵体型较多见. 虽然也有核阳性和膜阳性,但较少见. HBsAg胞质阳性细胞的分布多呈片状,也有弥漫型、局灶型和散在型,而核阳性多为弥漫分布. 同一例标本中,可见到不同的阳性反应形式和分布形式(图1,2). HBsAg在HCC组织中表达的阳性反应强度比LC和PCT弱,其阳性率也显著低于LC(χ2 =9.977,P<0.01)和PCT(χ2 =17.325,P<0.01).
2.2 HCV-Ag在LC,HCC和PCT组织中的表达(表2) HCV-Ag在LC,PCT和HCC组织中有胞核和胞质两种表达形式,在不同病例,有的以胞质阳性为主,有的以胞核阳性为主,也有两者同时存在的,但以胞质表达为多见. 胞质表达多为全胞质型,呈灶状或片状分布; 核表达多为弥漫分布; 未见典型的膜表达(图3,4). 在HCC,LC 和PCT组织中HCV-Ag的阳性反应强度和阳性率均无显著差异. HCV和HBV重叠感染率在LC为46.7%(14/30),在HCC(含PCT)为40.0%(16/40).
2.3 AFP抗原在LC,HCC和PCT组织中的表达(表3) AFP在LC组织中多为核表达,呈弥漫分布,阳性细胞较稀少,表达强度较低,多伴有不典型增生. 在HCC组织中以胞质表达为主,可见个别细胞核和细胞膜表达;表达强度高于在LC中的表达;有以癌巢分布的趋势,在有些坏死周边区也可见到阳性细胞(图5,6).在32例PCT组织中仅1例细胞核阳性. AFP在HCC组织中的阳性率显著高于PCT(χ2 =16.048,P<0.01),但和LC无显著差异; 而HCC和LC胞质阳性率差异非常显著(χ2 =10.210,P<0.01).
图1 HBsAg在LC组织中的表达(APA×400)
图2 HBsAg在HCC组织中的表达(APA×400)
图3 HCV-Ag在PCT组织中的表达(APA×400)
图4 HCV-Ag在HCC组织中的表达(APA×400)
图5 AFP在LC组织中的表达(APA×400)
图6 AFP在HCC组织中的表达(APA×400)
表1 HBsAg在LC,HCC及PCT组织中的免疫组化结果(n,%)
表2 HCV-Ag在LC,HCC及PCT组织中的免疫组化结果(n,%)
表3 AFP在LC,HCC及PCT组织中的免疫组化结果(n,%)
3 讨论
HBsAg是乙型肝炎病毒包膜蛋白中的主要蛋白,其上有多个MHC限制的表位,是CTL清除感染细胞内的HBV和造成免疫损伤的主要靶抗原[1]. 以前的报道认为，HBsAg在LC组织中检出率为70%～80%,其中86%伴有肝细胞不典型增生. 部分病例也见于库氏细胞内及肝内胆管上皮细胞内. 在HCC组织的癌细胞内, HBsAg阳性率一般比较低,大多数报道其阳性率在10%～15%,少数报道阳性率可高达25%～44%. 一般来说,PCT中HBsAg阳性率明显高于癌组织,大约在60%～80%,还有少数报道在90%以上. 癌周肝组织HBsAg阳性反应强度和阳性细胞检出率也比癌组织高. HBsAg阳性细胞主要见于癌周肝硬变,特别是大结节肝硬变中. 说明HBV感染与HCC发生有密切关系. HBsAg阳性形式有全胞质型、包涵体型、胞质周边型、核周型、核内型和胞膜型. 但核内型和胞膜型少见,绝大多数都是胞质型,而且以全胞质型和包涵体型较为多见. HBsAg阳性细胞的分布有弥漫型、局灶型和散在型[4-6]. HBV包膜蛋白在
肝细胞内质网中的适度积累并不影响肝细胞的功能,但提高了其对IFN-γ的敏感性. 若过度积累则足以损害内质网的功能,导致肝细胞的自然死亡,引起继发性炎症和再生反应,进而引起基因突变和有丝分裂,导致肝细胞癌的发生[1,7,8]. 我们的研究结果表明, HBsAg在HCC,LC和PCT中的阳性率分别为17.5%,53.3%和65.6%, 前者较后两者显著降低,这与文献报道基本一致[4-6]. 但这种降低究竟是HBsAg的基因整合到了肝细胞的基因中还是由于癌细胞丧失了HBV感染的表位,或者是癌细胞内已不适合HBV生存还不清楚. 但HBsAg阳性率降低势必导致针对癌细胞上HBsAg的细胞免疫应答比LC和PCT上的少. 这说明HBsAg虽然在肝硬变的免疫损伤和肝细胞癌的发生中可能有着重要意义, 却并不是抗肝癌免疫应答中的主要靶抗原. 由HBsAg引起的细胞免疫应答,更多的是造成癌周组织的损伤,使癌周组织向肝细胞癌转化,而不是对癌细胞的清除.
HCV感染的慢性化率高,与LC和HCC的发生关系密切. 有报道称输血后的HCV感染者的慢性化率高达40%～60%,长潜伏期型、轻型、无黄疸型患者更易发展为慢性,且大多为慢性活动型肝炎. 其中有10%～20%可发展为肝硬变. 而散发性HCV感染较输血后感染更易发展为慢性活动型肝炎和肝硬变[9-14]. HCC的发生涉及多因素的作用,但HCV核心抗原C33C抗原和其他标志物在HCC的高检出率表明,HCV感染与HCC的发生关系密切. 至于HCV与HCC的确切关系目前仍不清楚. 有人曾发现在核心蛋白的99～102氨基酸之间可能存在一个DNA结合结构域.此外,在核心蛋白中还存在几个核定位信号及几个蛋白激酶A和C的识别位点. 说明核心蛋白可能是一种基因调节蛋白. HCV RNA作为一种正链RNA通过其负链形式进行复制,尚未发现在宿主细胞内有整合形式存在. 目前一般认为,HCV可能是通过其表达产物间接致癌,而不是将其基因整合于宿主细胞,通过影响细胞基因表达来致癌[15-20,25]. 我们的结果表明: HCV-Ag的阳性率在 LC，PCT和HCC三者之间无显著差异,与HBsAg明显不同.说明HCV感染与HCC发生的关系可能更为密切. 目前认为免疫损伤仍是丙型肝炎的主要发病机制[2,13]. 但在我们的实验中, HCV-Ag阳性癌细胞周围并无明显的淋巴细胞浸润. 这似乎说明,HCC组织中发生的免疫应答可能与肝炎时有所不同[18]. 在抗HCC免疫中HCV-Ag可能也不是CTL攻击的主要靶抗原,不足以引起有效抗肝癌免疫应答,清除癌细胞. 其原因尚待进一步研究. 在LC,HCC和PCT中, HBsAg和HCV-Ag的重叠率较高,说明HBV和HCV的重叠感染在LC和HCC的发病中具有重要意义,应引起高度重视.
AFP是哺乳动物胚胎期由肝及卵黄囊合成的胚胎性血清蛋白,在成年期,主要来源于内胚层恶性肿瘤,如肝癌、胃癌和性腺肿瘤等. 10%～35%的非恶性肝疾病,如肝硬变和肝炎,也可有轻、中度的AFP升高. AFP在HCC组织中的阳性率在44%～70%之间,常呈灶状分布. 在细胞内的分布以核周型为主,也可表现为胞质型、胞膜型和局限型. 其阳性细胞数和免疫组化反应强度大多与AFP血浓度、肝细胞癌的分化程度相关[21-24]. Niwa et al[21]报道,AFP mRNA水平在30例HCC的癌肿区比非癌区增加大约10～105倍,并且与血清AFP水平和肿瘤的大小均相关. Ohguchi et al[22]也报道,AFP的血清水平越高,表达它的HCC细胞群越大. 在PCT中AFP仅有弱表达,而正常肝组织中为阴性. 我们的结果表明,AFP在HCC组织中的表达有以癌巢分布的趋势. 虽然在LC和PCT的部分细胞也可见AFP表达,但其阳性率和表达强度均低于HCC,且多为核阳性,伴不典型增生. 提示这些细胞可能是癌前期细胞,它们可能已开始拥有肿瘤样生长能力,但还缺乏恶性转化的表型. AFP的表达可能和肝细胞的恶性转化有关[21]. AFP在细胞核阳性的意义还不清楚,是否可作为转录因子而激活癌基因还有待进一步研究. 在PCT中仅有1例细胞核AFP阳性,可能和所选标本的增生程度较低有关. 在有些坏死周边区可以见到MHC抗原、共刺激分子和AFP均有表达,周围可见较明显的淋巴细胞浸润[26],提示其有可能是CTL攻击的主要靶抗原,在抗肝癌免疫中发挥重要作用. AFP的一个重要功能,可能是在个体发育初期控制自身反应性T细胞的增殖,抑制T,B淋巴细胞的作用和IgG, IgA的产生. 曾有人报道用抗AFP血清可抑制大鼠AH66肝癌细胞生长. 大多数经抗AFP血清治疗的肝癌细胞移植小鼠可见癌组织的纤维素性包裹、渗出、出血和坏死. 在肝癌组织周围有较多单核细胞,且向癌组织浸润,甚至以炎症组织代替了肝癌组织. 其作用机制可能是抗AFP血清结合AFP并解除了AFP的免疫抑制作用. 也有人认为抗AFP血清对肝癌细胞有直接杀伤作用. 因此, AFP在HCC中的表达无论是在免疫逃避还是在抗HCC免疫中都有重要意义,有可能成为抗肿瘤免疫治疗和抗体导向治疗的一个重要工具.
总之,HBsAg,HCV-Ag和AFP与肝硬变和肝癌的发生和发展有密切的关系,而AFP则可能是抗肝癌免疫中CTL攻击的主要靶抗原. 但血清中高浓度的AFP可能阻断了CTL的作用. 因此,用足量的抗AFP抗体来治疗AFP阳性肝癌可能是一条有希望的途径.
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26 Zhai SH, Liu JB, Zhu P, Wang YH. CD54, CD80, CD86 and HLA-ABC expressions in liver cirrhosis and hepatocarcinoma.
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 2000;8:292-295, 百拇医药(翟守恒1 刘俊彬2 刘云梅1 张玲莉1 杜志平1 )
2 中国人民解放军第四军医大学西京医院临床免疫科 陕西省西安市 710032
翟守恒,男,1962-07-11生,山西省浑源县人,汉族. 1985年第四军医大学本科毕业,学士,1999年第四军医大学研究生毕业,硕士,主治医师,主要从事肝病免疫发病机制和免疫治疗的研究，发表论文5篇.
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Expression of HBsAg, HCV-Ag and AFP in liver cirrhosis and hepatocarcinoma
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Abstract
AIM To probe into the significance of expression of HBsAg, HCV-Ag and AFP in anti-tumor immune response to hepatocarcinoma.
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RESULTS In liver cirrhosis the positive rate of HBsAg, HCV-Ag and AFP was 53.3%(16/30), 63.3%(19/30) and 26.7%(8/30), respectively. In human hepatocarcinoma, the positive rate of HBsAg, HCV-Ag and AFP was 17.5%(7/40), 52.5%(21/40) and 45.0%(18/40), respectively. In pericancerous tissue (PCT), the positive rate of HBsAg, HCV-Ag and AFP was 65.6%(21/32), 50.0%(16/32) and 3.1%(1/32), respectively. Statistical analysis suggested that the positive rate of HBsAg was significantly lower in hepatocarcinoma than that in liver cirrhosis (χ2=9.977, P<0.01) and in PCT (χ2=17.325, P<0.01). No significant difference was found in the positive rate of HCV-Ag between HCC and LC and PCT. The positive rate of AFP in HCC was significantly higher than that in PCT (χ2=16.048, P<0.01), but no significant difference was found between HCC and LC.
CONCLUSION HBsAg, HCV-Ag and AFP were closely related to the occurrence of hepatocarcinoma. AFP might be the main target antigen for CTL, but high level serum AFP might repress the function of CTL to tumor cells. Therefore, sufficient anti-AFP antibody may be a hopeful therapy for hepatocarcinoma patients whose serum AFP was positive.
Subject headings hepatitis B virus; hepatitis C virus; liver cirrhosis; liver neoplasms; immunohistochemistry; antigens;
serology; therapeutics; alpha fetoproteins
Zhai SH, Liu JB, Liu YM, Zhang LL, Du ZP. Expression of HBsAg, HCV-Ag and AFP in liver cirrhosis and hepatocarcinoma.
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 2000;8(5):524-527
摘要
目的 探讨HBsAg,HCV-Ag和AFP在抗肝癌免疫应答中的意义.
方法 用免疫组织化学APA法检测HBsAg,HCV-Ag和AFP在肝硬变和肝细胞癌中的表达、定位和分布.
结果 在LC组织中,HBsAg为53.3%(16/30),HCV-Ag为63.3%(19/30),AFP为26.7%(8/30);在HCC组织中, HBsAg为17.5%(7/40),HCV-Ag为 52.5%(21/40),AFP为45.0%(18/40);在癌周围组织(PCT)中, HBsAg5.6%(21/32),HCV-Ag为50.0%(16/32),AFP为3.1%(1/32);统计学处理显示,在HCC组织中,HBsAg阳性率显著低于LC(χ2 =9.977,P<0.01)和PCT(χ2 =17.325,P<0.01);HCV-Ag阳性率与LC和PCT无显著差异; AFP阳性率显著高于PCT(χ 2 =16.048,P<0.01),与LC无显著差异.
结论 HBsAg,HCV-Ag和AFP与肝癌的发生有密切的关系,AFP可能是CTL攻击的主要靶抗原. 但血清中高浓度的AFP可能阻断了CTL的作用. 因此,用足量的抗AFP抗体来治疗AFP阳性肝癌可能是一条有希望的途径.
主题词 肝炎病毒,乙型; 肝炎病毒,丙型; 肝硬化; 肝肿瘤; 免疫组织化学; 抗原; 血清学; 治疗学; 甲胎蛋白类
翟守恒,刘俊彬,刘云梅,张玲莉,杜志平. HBsAg, HCV-Ag和AFP在肝硬变和肝细胞癌组织中的表达. 世界华人消化杂志，2000；8(5)：524-527
0 引言
慢性病毒性肝炎、肝硬变(LC)和肝细胞癌(HCC)三者关系密切.T细胞免疫应答在清除感染细胞内的病毒、引起肝细胞免疫损伤和抗肿瘤免疫应答中都起着关键作用[1-3]. 病毒抗原HBsAg, HCV-Ag和肿瘤相关抗原AFP在诱导肝炎、肝硬变和肝细胞癌的免疫应答中起着重要作用. 近年来,有关HBsAg, HCV-Ag和AFP在慢性肝炎、肝硬变和肝细胞癌组织中的表达,国内外均已有不少报道[4-24],但有关这些抗原在抗肝癌免疫应答中作用的研究却为数不多. 本研究通过检测LC,HCC和癌周组织(PCT)中这三种抗原的表达、定位和分布,从不同角度来探讨其在抗肝癌免疫应答中的意义,为进一步研究肝癌的免疫治疗打下基础.
1 材料和方法
1.1 材料 HCC 40例和LC 30例标本均来自西京医院并经病理检查证实. HCC 40例中32例含有PCT. 所有标本经100mL/L福尔马林固定,常规脱水,石蜡包埋,制备5μm切片备用. 主要试剂：鼠抗人HBsAg (A34060259p)单克隆抗体IgG2b(即用型)为Biogenex公司产品,鼠抗人HCV-Ag多克隆抗体(1∶100稀释) 和APA免疫组化染色试剂盒为武汉博士德公司产品. 鼠抗人AFP(C3)单克隆抗体IgG2a(即用型)为Sigma公司产品.
1.2 方法 切片常规脱蜡至水,30mL/L H2O2 10min灭活内源性酶,0.01mol/L枸橼酸缓冲液修复抗原. 染色步骤按武汉博士德公司APA免疫组化染色试剂盒说明书进行.DAB液显色,苏木素复染,脱水透明后封片,光镜观察. 阳性反应呈棕黄色颗粒状,阴性为无阳性反应. 取已知血清HBsAg, HCV-Ag和AFP阳性肝硬变和肝癌组织为阳性对照,健康人肝破裂手术切除肝组织作阴性对照. 以10g/L小牛血清清蛋白-PBS液替代一抗作空白对照.χ2 检验.
2 结果
2.1 HBsAg在LC,HCC和PCT组织中的表达 (表1)HBsAg在LC, PCT和HCC组织中均以胞质表达为主,阳性形式有全胞质型、包涵体型、胞质周边型和核周型,全胞质型和包涵体型较多见. 虽然也有核阳性和膜阳性,但较少见. HBsAg胞质阳性细胞的分布多呈片状,也有弥漫型、局灶型和散在型,而核阳性多为弥漫分布. 同一例标本中,可见到不同的阳性反应形式和分布形式(图1,2). HBsAg在HCC组织中表达的阳性反应强度比LC和PCT弱,其阳性率也显著低于LC(χ2 =9.977,P<0.01)和PCT(χ2 =17.325,P<0.01).
2.2 HCV-Ag在LC,HCC和PCT组织中的表达(表2) HCV-Ag在LC,PCT和HCC组织中有胞核和胞质两种表达形式,在不同病例,有的以胞质阳性为主,有的以胞核阳性为主,也有两者同时存在的,但以胞质表达为多见. 胞质表达多为全胞质型,呈灶状或片状分布; 核表达多为弥漫分布; 未见典型的膜表达(图3,4). 在HCC,LC 和PCT组织中HCV-Ag的阳性反应强度和阳性率均无显著差异. HCV和HBV重叠感染率在LC为46.7%(14/30),在HCC(含PCT)为40.0%(16/40).
2.3 AFP抗原在LC,HCC和PCT组织中的表达(表3) AFP在LC组织中多为核表达,呈弥漫分布,阳性细胞较稀少,表达强度较低,多伴有不典型增生. 在HCC组织中以胞质表达为主,可见个别细胞核和细胞膜表达;表达强度高于在LC中的表达;有以癌巢分布的趋势,在有些坏死周边区也可见到阳性细胞(图5,6).在32例PCT组织中仅1例细胞核阳性. AFP在HCC组织中的阳性率显著高于PCT(χ2 =16.048,P<0.01),但和LC无显著差异; 而HCC和LC胞质阳性率差异非常显著(χ2 =10.210,P<0.01).
图1 HBsAg在LC组织中的表达(APA×400)
图2 HBsAg在HCC组织中的表达(APA×400)
图3 HCV-Ag在PCT组织中的表达(APA×400)
图4 HCV-Ag在HCC组织中的表达(APA×400)
图5 AFP在LC组织中的表达(APA×400)
图6 AFP在HCC组织中的表达(APA×400)
表1 HBsAg在LC,HCC及PCT组织中的免疫组化结果(n,%)
| 分组 | n | 胞核阳性 | 胞质阳性 | 胞膜阳性 | 总阳性 |
| LC | 30 | 2(6.7) | 13(43.3) | 1(3.3) | 16(53.3) |
| HCC | 40 | 0(0.0) | 7(17.5) | 0(0.0) | 7(17.5) |
| PCT | 32 | 1(3.1) | 20(62.5) | 0(0.0) | 21(65.6) |
表2 HCV-Ag在LC,HCC及PCT组织中的免疫组化结果(n,%)
| 分组 | n | 胞核阳性 | 胞质阳性 | 胞核+胞质阳性 | 总阳性 |
| LC | 30 | 5(16.7) | 10(33.3) | 4(13.3) | 19(63.3) |
| HCC | 40 | 1(2.5) | 16(40.0) | 4(10.0) | 21(52.5) |
| PCT | 32 | 0(0.0) | 12(37.5) | 4(12.5) | 16(50.0) |
表3 AFP在LC,HCC及PCT组织中的免疫组化结果(n,%)
| 分组 | n | 胞核阳性 | 胞质阳性 | 胞膜阳性 | 总阳性 |
| LC | 30 | 7(23.3) | 1(3.3) | 0(0.0) | 8(26.7) |
| HCC | 40 | 2(5.0) | 14(35.0) | 2(5.0) | 18(45.0) |
| PCT | 32 | 1(3.1) | 0(0.0) | 0(0.0) | 1(3.1) |
3 讨论
HBsAg是乙型肝炎病毒包膜蛋白中的主要蛋白,其上有多个MHC限制的表位,是CTL清除感染细胞内的HBV和造成免疫损伤的主要靶抗原[1]. 以前的报道认为，HBsAg在LC组织中检出率为70%～80%,其中86%伴有肝细胞不典型增生. 部分病例也见于库氏细胞内及肝内胆管上皮细胞内. 在HCC组织的癌细胞内, HBsAg阳性率一般比较低,大多数报道其阳性率在10%～15%,少数报道阳性率可高达25%～44%. 一般来说,PCT中HBsAg阳性率明显高于癌组织,大约在60%～80%,还有少数报道在90%以上. 癌周肝组织HBsAg阳性反应强度和阳性细胞检出率也比癌组织高. HBsAg阳性细胞主要见于癌周肝硬变,特别是大结节肝硬变中. 说明HBV感染与HCC发生有密切关系. HBsAg阳性形式有全胞质型、包涵体型、胞质周边型、核周型、核内型和胞膜型. 但核内型和胞膜型少见,绝大多数都是胞质型,而且以全胞质型和包涵体型较为多见. HBsAg阳性细胞的分布有弥漫型、局灶型和散在型[4-6]. HBV包膜蛋白在
肝细胞内质网中的适度积累并不影响肝细胞的功能,但提高了其对IFN-γ的敏感性. 若过度积累则足以损害内质网的功能,导致肝细胞的自然死亡,引起继发性炎症和再生反应,进而引起基因突变和有丝分裂,导致肝细胞癌的发生[1,7,8]. 我们的研究结果表明, HBsAg在HCC,LC和PCT中的阳性率分别为17.5%,53.3%和65.6%, 前者较后两者显著降低,这与文献报道基本一致[4-6]. 但这种降低究竟是HBsAg的基因整合到了肝细胞的基因中还是由于癌细胞丧失了HBV感染的表位,或者是癌细胞内已不适合HBV生存还不清楚. 但HBsAg阳性率降低势必导致针对癌细胞上HBsAg的细胞免疫应答比LC和PCT上的少. 这说明HBsAg虽然在肝硬变的免疫损伤和肝细胞癌的发生中可能有着重要意义, 却并不是抗肝癌免疫应答中的主要靶抗原. 由HBsAg引起的细胞免疫应答,更多的是造成癌周组织的损伤,使癌周组织向肝细胞癌转化,而不是对癌细胞的清除.
HCV感染的慢性化率高,与LC和HCC的发生关系密切. 有报道称输血后的HCV感染者的慢性化率高达40%～60%,长潜伏期型、轻型、无黄疸型患者更易发展为慢性,且大多为慢性活动型肝炎. 其中有10%～20%可发展为肝硬变. 而散发性HCV感染较输血后感染更易发展为慢性活动型肝炎和肝硬变[9-14]. HCC的发生涉及多因素的作用,但HCV核心抗原C33C抗原和其他标志物在HCC的高检出率表明,HCV感染与HCC的发生关系密切. 至于HCV与HCC的确切关系目前仍不清楚. 有人曾发现在核心蛋白的99～102氨基酸之间可能存在一个DNA结合结构域.此外,在核心蛋白中还存在几个核定位信号及几个蛋白激酶A和C的识别位点. 说明核心蛋白可能是一种基因调节蛋白. HCV RNA作为一种正链RNA通过其负链形式进行复制,尚未发现在宿主细胞内有整合形式存在. 目前一般认为,HCV可能是通过其表达产物间接致癌,而不是将其基因整合于宿主细胞,通过影响细胞基因表达来致癌[15-20,25]. 我们的结果表明: HCV-Ag的阳性率在 LC，PCT和HCC三者之间无显著差异,与HBsAg明显不同.说明HCV感染与HCC发生的关系可能更为密切. 目前认为免疫损伤仍是丙型肝炎的主要发病机制[2,13]. 但在我们的实验中, HCV-Ag阳性癌细胞周围并无明显的淋巴细胞浸润. 这似乎说明,HCC组织中发生的免疫应答可能与肝炎时有所不同[18]. 在抗HCC免疫中HCV-Ag可能也不是CTL攻击的主要靶抗原,不足以引起有效抗肝癌免疫应答,清除癌细胞. 其原因尚待进一步研究. 在LC,HCC和PCT中, HBsAg和HCV-Ag的重叠率较高,说明HBV和HCV的重叠感染在LC和HCC的发病中具有重要意义,应引起高度重视.
AFP是哺乳动物胚胎期由肝及卵黄囊合成的胚胎性血清蛋白,在成年期,主要来源于内胚层恶性肿瘤,如肝癌、胃癌和性腺肿瘤等. 10%～35%的非恶性肝疾病,如肝硬变和肝炎,也可有轻、中度的AFP升高. AFP在HCC组织中的阳性率在44%～70%之间,常呈灶状分布. 在细胞内的分布以核周型为主,也可表现为胞质型、胞膜型和局限型. 其阳性细胞数和免疫组化反应强度大多与AFP血浓度、肝细胞癌的分化程度相关[21-24]. Niwa et al[21]报道,AFP mRNA水平在30例HCC的癌肿区比非癌区增加大约10～105倍,并且与血清AFP水平和肿瘤的大小均相关. Ohguchi et al[22]也报道,AFP的血清水平越高,表达它的HCC细胞群越大. 在PCT中AFP仅有弱表达,而正常肝组织中为阴性. 我们的结果表明,AFP在HCC组织中的表达有以癌巢分布的趋势. 虽然在LC和PCT的部分细胞也可见AFP表达,但其阳性率和表达强度均低于HCC,且多为核阳性,伴不典型增生. 提示这些细胞可能是癌前期细胞,它们可能已开始拥有肿瘤样生长能力,但还缺乏恶性转化的表型. AFP的表达可能和肝细胞的恶性转化有关[21]. AFP在细胞核阳性的意义还不清楚,是否可作为转录因子而激活癌基因还有待进一步研究. 在PCT中仅有1例细胞核AFP阳性,可能和所选标本的增生程度较低有关. 在有些坏死周边区可以见到MHC抗原、共刺激分子和AFP均有表达,周围可见较明显的淋巴细胞浸润[26],提示其有可能是CTL攻击的主要靶抗原,在抗肝癌免疫中发挥重要作用. AFP的一个重要功能,可能是在个体发育初期控制自身反应性T细胞的增殖,抑制T,B淋巴细胞的作用和IgG, IgA的产生. 曾有人报道用抗AFP血清可抑制大鼠AH66肝癌细胞生长. 大多数经抗AFP血清治疗的肝癌细胞移植小鼠可见癌组织的纤维素性包裹、渗出、出血和坏死. 在肝癌组织周围有较多单核细胞,且向癌组织浸润,甚至以炎症组织代替了肝癌组织. 其作用机制可能是抗AFP血清结合AFP并解除了AFP的免疫抑制作用. 也有人认为抗AFP血清对肝癌细胞有直接杀伤作用. 因此, AFP在HCC中的表达无论是在免疫逃避还是在抗HCC免疫中都有重要意义,有可能成为抗肿瘤免疫治疗和抗体导向治疗的一个重要工具.
总之,HBsAg,HCV-Ag和AFP与肝硬变和肝癌的发生和发展有密切的关系,而AFP则可能是抗肝癌免疫中CTL攻击的主要靶抗原. 但血清中高浓度的AFP可能阻断了CTL的作用. 因此,用足量的抗AFP抗体来治疗AFP阳性肝癌可能是一条有希望的途径.
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