食管癌癌旁粘膜微乳头状瘤病的研究
汕头大学医学院病理教研室 广东省汕头市 515031
项目负责人 沈健汕头大学医学院病理教研室 广东省汕头市 515031
收稿日期 2000-05-12 接受日期 2000-05-16
Subject headings micropapillomatosis; esophageal neoplasms; human papillomavirus; in situ hybridization; microscopy/electron/scanning; polymerase chain reaction
主题词 微乳头状瘤病；食管肿瘤；人乳头状瘤病毒；原位杂交；显微镜/电子/扫描；聚合酶链反应
, 百拇医药
沈健, 沈忠英, 郑瑞明, 吕丽春. 食管癌癌旁粘膜微乳头状瘤病的研究. 世界华人消化杂志，2000；8(11)：1289-1290
Plowight (1895)报告肯尼西部山谷中牛前胃鳞状细胞癌，并发现有食管多发性乳头状瘤病流行，认为乳头状瘤和鳞状上皮癌有关[1]. 国内20世纪70年代发现在食管癌高发区家禽和家畜咽或前胃乳头状瘤明显高于低发区，被认为乳头状瘤的发生率和食管癌有关[2]. 人外阴，阴道，呼吸道，外耳道常发生乳头状瘤病(papillomatosis)，而食管粘膜乳头状瘤很少见[3]. 对HPV和乳头状瘤的关系意见不一，有的认为有密切关系[4]，有的认为关系不明显[5]，有的却认为没有关系[6]. 我们过去检查食管癌旁组织却发现有乳头状瘤样增生，肉眼常未能发现瘤体，仅在显微镜下，立体显微镜和扫描电镜检查发现，称为微乳头状瘤病(micropapillomatosis， MP)[7]. 我们在195例食管癌标本用PCR方法检测HPV，同一标本检查癌旁粘膜病变，着重乳头状瘤增生病变的检查. 探索微乳头状瘤病的形态及其和HPV的关系.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 收集我院附属医院食管癌手术标本195例，用立体显微镜检查癌旁粘膜并照相. 取材： 癌、癌旁(距癌巢1cm内)和切缘正常粘膜组织. 做HPV PCR检查，切片作病理组织学检查，其中44例癌旁粘膜作扫描电镜和HPV DNA原位杂交. dNTP和Taq酶，购自Promega公司. PCR仪GTC-2(Ericomp, Co. USA).
1.2 方法 ①扫描电镜检查44例标本，食管癌旁粘膜取1cm×1cm组织，25mL·L-1戊二醛固定，酒精丙酮脱水，醋酸异戊酯置换，临界点干燥(日立HCP-2)，离子真空喷涂(日立IB-3)，在日立H300电镜扫描附件下观察. ②HPV PCR：癌、癌旁和切缘组织按常规提取DNA，做HPV共用引物HPV6，11，16，18，31，33 PCR检查. 共用引物序列参照文献[8]，由上海生工公司合成.
, 百拇医药
L1C1 5＇-CGTAAACGTTTTCCCTATTTTTTT-3＇
L1C2 3＇-GTTATGTCTCATAAATCCCAT-5＇
设阳性和阴性对照. PCR产物，20g·L-1琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察. ③HPV DNA原位杂交[9]：44例癌、癌旁和正常组织，切片贴在涂有APEG玻片. HPV18重组质粒由湖南医科大学肿瘤所提供，地高辛标记和检测试剂盒购自Boehringer Mannheim, HPV原位杂交方法按试剂盒说明进行.
2 结果癌旁粘膜由立体显微镜检查可见16例粘膜增生，呈颗粒状或乳头状隆起. 经组织切片证实为MP.
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2.1 光镜观察 195例癌旁粘膜组织学检查发现有28例MP病变(14.4%). 病变有4种类型：①乳头状瘤型12例，粘膜表面多数乳头状隆起，表层被以增生鳞状上皮，其下有纤维结缔组织和血管轴心(图1)；②棘状突起7例，粘膜表面有尖锐棘状突起，粘膜上皮增生，有角化和角化不全；③内生型乳头状瘤7例，基底细胞增生，有的向下粘膜固有层形成乳头状增生，细胞增生活跃；④乳头状瘤恶变2例. 部分病例为混合型，常见者为外生和内生型混合(图2). MP病灶附近粘膜上皮90%有增生，不典型增生等癌前病变，可看到鳞状上皮增生空泡化，表层上皮角化和角化不全，并有凹空细胞(koilocyte)，及异型细胞核(图3)；空泡化细胞多出现在粘膜中层细胞，呈灶性或大片分布.
2.2 扫描电镜观察 44例癌旁组织SEM检查，发现有MP 10例，其表面病变有三种形式：棘状或指状突起(图4)，细长突起，基底部小. 春笋状和花蕊状，基底部宽广，外被多层鳞状上皮(图5).
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2.3 HPV检测 195例癌旁粘膜HPV PCR检查阳性者占有110例(56.4%)，癌旁粘膜有MP病变28例，其中25例HPV阳性(89.3%)；无MP病变167例，85例(50.9%)HPV阳性. 有MP癌旁粘膜HPV感染率明显高于无MP粘膜感染率(表1)，经卡方测验有非常显著差异. 说明MP的发生和HPV感染有关. 44例癌旁粘膜切片中，HPV18 DNA原位杂交，2例阳性，可见增生细胞核有2～6个拷贝杂交信号(图6). 提示增生细胞有HPV DNA的复制.
表1 食管癌癌旁粘膜HPV PCR检测n(%)
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bP<0.001， vs 卡方检验，χ2=14.37.
3 讨论
以组织切片显微镜检查，在195例癌旁粘膜中发现MP 28例，占总数14.4%，说明MP病变并不少见. 因肉眼难以发现，故易被忽略. 如用立体显微镜检查取材，或经扫描电镜检查，可发现的微乳头状瘤病变增多. 食管乳头状瘤文献所用的名称有，鳞状细胞乳头状瘤[3]，多发性乳头状瘤，乳头状瘤病(papillomatosis)[10]，微乳头状病变(micropapillary lesion)[6]. 其形态有一共同特点即鳞状上皮增生，呈大小不一的乳头状突起，表面常有过度角化和角化不全，有的基底层增生. 根据病理形态学分为4型：乳头状瘤型，一般乳头状瘤结构；棘状乳头状瘤型，以角化和角化不全细胞为主，表面尖锐刺状；基底细胞增生，向间质呈内生乳头状生长；基底细胞向下增生有癌变等. 前两型向上生长，后两型也向下生长，也可见外生和内生同时存在. 基底细胞增生型乳头状瘤病，可发生癌变发展为鳞状细胞癌，可以融合到主癌内. 因此乳头状瘤病可认为一种癌前病变，和食管癌的发生有关. 我们以亚硝胺诱发小鼠前胃癌，其早期百分之百前胃先发生乳头状瘤，然后发展为鳞状细胞癌[11].
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乳头状瘤病产生的原因，可以是化学的，物理或生物的. 有报道胃消化液反流入食管可以产生反流性食管炎，引起食管上皮乳头状增生[12]，有人认为食管机械刺激可以产生食管鳞状上皮增生，形成乳头瘤病[13]. 多数报告认为乳头状瘤病和HPV感染有关[5]，但也有乳头状瘤未查到HPV[6]. 我们用HPV共用引物(包括高危，低危等多种HPV)L1C1，L1C2 PCR方法检查HPV，部分病例用原位杂交方法检查. 结果28例MP有25例感染HPV，HPV感染率远超过无MP癌旁粘膜，统计学上有非常显著意义(P<0.001). 因此可以认为HPV感染和MP发生有关. MP周围粘膜上皮出现凹空细胞和较多空泡样细胞，也是HPV感染的佐证.
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总之，本文结果支持MP的发生和HPV感染有关. MP是一种癌前病变，可以恶变为鳞状细胞癌，故MP是和一部分食管癌的发生、发展有密切的关系.
图1 食管癌癌旁粘膜上皮乳头状增生，外生型. HE×100
图2 食管癌癌旁粘膜上皮乳头状增生，混合型. HE×100
图3 食管癌癌旁粘膜上皮增生，有凹空细胞核异型性. HE×100
图4 食管癌癌旁粘膜表面棘状突起. SEM×2000
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图5 食管癌癌旁粘膜表面花芯状突起，外被多层鳞状上皮. SEM×3000
图6 癌旁粘膜上皮增生，凹空细胞核有HPV阳性杂交信号. ISH×400
4 参考文献
1 Campo MS. Papillomas and cancer in cattle. Cancer Surv, 1987;6:39-54
2 黎均耀. 食管癌研究进展. 见钱宇平主编《流行病学进展》. 第四卷. 北京：人民卫生出版社，1986：274-299
, 百拇医药
3 Carr NJ, Bratthauer GL, Lichy JH, Taubenberger JK, Monihan JM, Sobin LH. Squamous cell papillomas of the esophagus: a study
of 23 lesions for human papillomavirus by in situ hybridization and the polymerase chain reaction.
Hum Pathol, 1994;25:536-540
4 Poljak M, Cerar A, Orlowska J. P53 protein expression in esophageal squamous cell papillomas: a study of 36 lesions.
, 百拇医药
Scand J Gastroenterol, 1996;31:10-13
5 Ravakhah K, Midamba F, West BC. Esophageal papillomatosis from human papilloma virus proven by polymerase chain reaction.
Am J Med Sci, 1998;316:285-288
6 Garzettic GG, Giavattini A, Goteri G, De-Nictoles M, Brugia M, Romanini C. Vaginal micropapillary lesion are not related to
human papillomavirus infection: in situ hybridization and polymerase chain reaction detection techniques.
, 百拇医药
Gynecol Obstet Invest, 1994;38:134-139
7 沈忠英，李铧，沈健. 食管癌癌旁粘膜的改变及其意义. 汕头医专学报，1981；5：14-18
8 Yoshikawa H, Kawana T, Kitagawa K, Mizuno M, Yoshikura H, Iwamoto A. Detection and typing of multiple genital
human papillomaviruses by DNA amplification with consensus primers. Jpn J Cancer Res, 1991;82:524-531
9 黄培林, 陆伦根, 史志英, 尹克铮, 张晓明. 大肠肿瘤组织中人乳头状瘤病毒DNA的分子原位杂交研究. 华人消化杂志, 1998;6:771-773
, 百拇医药
10 Ushikai M, Fujiyoshi T, Kono M, Antrasena S, Oda H, Yoshida H, Fukuda K, Furuta S, Hakura A. Detection and cloning of
human papillomavirus DNA associated with recurrent respiratory papillomatosis in Thailand.
Jpn J Cancer Res, 1994;85:699-703
11 沈健，沈忠英. 亚硝胺诱发小鼠前胃鳞状细胞癌的实验研究. 汕头大学医学院学报，1999；12：20-22
12 Lanas A, Royo Y, Ortego J, Molina M, Sainz R. Experimental esophagitis induced by acid and pepsin in rabbits mimicking human
reflux esophagitis. Gastroenterology, 1999;116:97-107
13 Karras PJ, Barawi M, Webb B, Michalas A. Squamous cell papillomatosis of esophagus following placement of a self-expanding
metal stent. Dig Dis Sci, 1999;44:457-461, http://www.100md.com(沈 健 沈忠英 郑瑞明 吕丽春)
项目负责人 沈健汕头大学医学院病理教研室 广东省汕头市 515031
收稿日期 2000-05-12 接受日期 2000-05-16
Subject headings micropapillomatosis; esophageal neoplasms; human papillomavirus; in situ hybridization; microscopy/electron/scanning; polymerase chain reaction
主题词 微乳头状瘤病；食管肿瘤；人乳头状瘤病毒；原位杂交；显微镜/电子/扫描；聚合酶链反应
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沈健, 沈忠英, 郑瑞明, 吕丽春. 食管癌癌旁粘膜微乳头状瘤病的研究. 世界华人消化杂志，2000；8(11)：1289-1290
Plowight (1895)报告肯尼西部山谷中牛前胃鳞状细胞癌，并发现有食管多发性乳头状瘤病流行，认为乳头状瘤和鳞状上皮癌有关[1]. 国内20世纪70年代发现在食管癌高发区家禽和家畜咽或前胃乳头状瘤明显高于低发区，被认为乳头状瘤的发生率和食管癌有关[2]. 人外阴，阴道，呼吸道，外耳道常发生乳头状瘤病(papillomatosis)，而食管粘膜乳头状瘤很少见[3]. 对HPV和乳头状瘤的关系意见不一，有的认为有密切关系[4]，有的认为关系不明显[5]，有的却认为没有关系[6]. 我们过去检查食管癌旁组织却发现有乳头状瘤样增生，肉眼常未能发现瘤体，仅在显微镜下，立体显微镜和扫描电镜检查发现，称为微乳头状瘤病(micropapillomatosis， MP)[7]. 我们在195例食管癌标本用PCR方法检测HPV，同一标本检查癌旁粘膜病变，着重乳头状瘤增生病变的检查. 探索微乳头状瘤病的形态及其和HPV的关系.
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1 材料和方法
1.1 材料 收集我院附属医院食管癌手术标本195例，用立体显微镜检查癌旁粘膜并照相. 取材： 癌、癌旁(距癌巢1cm内)和切缘正常粘膜组织. 做HPV PCR检查，切片作病理组织学检查，其中44例癌旁粘膜作扫描电镜和HPV DNA原位杂交. dNTP和Taq酶，购自Promega公司. PCR仪GTC-2(Ericomp, Co. USA).
1.2 方法 ①扫描电镜检查44例标本，食管癌旁粘膜取1cm×1cm组织，25mL·L-1戊二醛固定，酒精丙酮脱水，醋酸异戊酯置换，临界点干燥(日立HCP-2)，离子真空喷涂(日立IB-3)，在日立H300电镜扫描附件下观察. ②HPV PCR：癌、癌旁和切缘组织按常规提取DNA，做HPV共用引物HPV6，11，16，18，31，33 PCR检查. 共用引物序列参照文献[8]，由上海生工公司合成.
, 百拇医药
L1C1 5＇-CGTAAACGTTTTCCCTATTTTTTT-3＇
L1C2 3＇-GTTATGTCTCATAAATCCCAT-5＇
设阳性和阴性对照. PCR产物，20g·L-1琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察. ③HPV DNA原位杂交[9]：44例癌、癌旁和正常组织，切片贴在涂有APEG玻片. HPV18重组质粒由湖南医科大学肿瘤所提供，地高辛标记和检测试剂盒购自Boehringer Mannheim, HPV原位杂交方法按试剂盒说明进行.
2 结果癌旁粘膜由立体显微镜检查可见16例粘膜增生，呈颗粒状或乳头状隆起. 经组织切片证实为MP.
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2.1 光镜观察 195例癌旁粘膜组织学检查发现有28例MP病变(14.4%). 病变有4种类型：①乳头状瘤型12例，粘膜表面多数乳头状隆起，表层被以增生鳞状上皮，其下有纤维结缔组织和血管轴心(图1)；②棘状突起7例，粘膜表面有尖锐棘状突起，粘膜上皮增生，有角化和角化不全；③内生型乳头状瘤7例，基底细胞增生，有的向下粘膜固有层形成乳头状增生，细胞增生活跃；④乳头状瘤恶变2例. 部分病例为混合型，常见者为外生和内生型混合(图2). MP病灶附近粘膜上皮90%有增生，不典型增生等癌前病变，可看到鳞状上皮增生空泡化，表层上皮角化和角化不全，并有凹空细胞(koilocyte)，及异型细胞核(图3)；空泡化细胞多出现在粘膜中层细胞，呈灶性或大片分布.
2.2 扫描电镜观察 44例癌旁组织SEM检查，发现有MP 10例，其表面病变有三种形式：棘状或指状突起(图4)，细长突起，基底部小. 春笋状和花蕊状，基底部宽广，外被多层鳞状上皮(图5).
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2.3 HPV检测 195例癌旁粘膜HPV PCR检查阳性者占有110例(56.4%)，癌旁粘膜有MP病变28例，其中25例HPV阳性(89.3%)；无MP病变167例，85例(50.9%)HPV阳性. 有MP癌旁粘膜HPV感染率明显高于无MP粘膜感染率(表1)，经卡方测验有非常显著差异. 说明MP的发生和HPV感染有关. 44例癌旁粘膜切片中，HPV18 DNA原位杂交，2例阳性，可见增生细胞核有2～6个拷贝杂交信号(图6). 提示增生细胞有HPV DNA的复制.
表1 食管癌癌旁粘膜HPV PCR检测n(%)
| 乳头状瘤病 | n | HPV | |
| + | - | ||
| 有b | 28 | 25(89.2) | 3(10.7) |
| 无 | 167 | 85(50.9) | 82(49.1) |
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bP<0.001， vs 卡方检验，χ2=14.37.
3 讨论
以组织切片显微镜检查，在195例癌旁粘膜中发现MP 28例，占总数14.4%，说明MP病变并不少见. 因肉眼难以发现，故易被忽略. 如用立体显微镜检查取材，或经扫描电镜检查，可发现的微乳头状瘤病变增多. 食管乳头状瘤文献所用的名称有，鳞状细胞乳头状瘤[3]，多发性乳头状瘤，乳头状瘤病(papillomatosis)[10]，微乳头状病变(micropapillary lesion)[6]. 其形态有一共同特点即鳞状上皮增生，呈大小不一的乳头状突起，表面常有过度角化和角化不全，有的基底层增生. 根据病理形态学分为4型：乳头状瘤型，一般乳头状瘤结构；棘状乳头状瘤型，以角化和角化不全细胞为主，表面尖锐刺状；基底细胞增生，向间质呈内生乳头状生长；基底细胞向下增生有癌变等. 前两型向上生长，后两型也向下生长，也可见外生和内生同时存在. 基底细胞增生型乳头状瘤病，可发生癌变发展为鳞状细胞癌，可以融合到主癌内. 因此乳头状瘤病可认为一种癌前病变，和食管癌的发生有关. 我们以亚硝胺诱发小鼠前胃癌，其早期百分之百前胃先发生乳头状瘤，然后发展为鳞状细胞癌[11].
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乳头状瘤病产生的原因，可以是化学的，物理或生物的. 有报道胃消化液反流入食管可以产生反流性食管炎，引起食管上皮乳头状增生[12]，有人认为食管机械刺激可以产生食管鳞状上皮增生，形成乳头瘤病[13]. 多数报告认为乳头状瘤病和HPV感染有关[5]，但也有乳头状瘤未查到HPV[6]. 我们用HPV共用引物(包括高危，低危等多种HPV)L1C1，L1C2 PCR方法检查HPV，部分病例用原位杂交方法检查. 结果28例MP有25例感染HPV，HPV感染率远超过无MP癌旁粘膜，统计学上有非常显著意义(P<0.001). 因此可以认为HPV感染和MP发生有关. MP周围粘膜上皮出现凹空细胞和较多空泡样细胞，也是HPV感染的佐证.
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总之，本文结果支持MP的发生和HPV感染有关. MP是一种癌前病变，可以恶变为鳞状细胞癌，故MP是和一部分食管癌的发生、发展有密切的关系.
图1 食管癌癌旁粘膜上皮乳头状增生，外生型. HE×100
图2 食管癌癌旁粘膜上皮乳头状增生，混合型. HE×100
图3 食管癌癌旁粘膜上皮增生，有凹空细胞核异型性. HE×100
图4 食管癌癌旁粘膜表面棘状突起. SEM×2000
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图5 食管癌癌旁粘膜表面花芯状突起，外被多层鳞状上皮. SEM×3000
图6 癌旁粘膜上皮增生，凹空细胞核有HPV阳性杂交信号. ISH×400
4 参考文献
1 Campo MS. Papillomas and cancer in cattle. Cancer Surv, 1987;6:39-54
2 黎均耀. 食管癌研究进展. 见钱宇平主编《流行病学进展》. 第四卷. 北京：人民卫生出版社，1986：274-299
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3 Carr NJ, Bratthauer GL, Lichy JH, Taubenberger JK, Monihan JM, Sobin LH. Squamous cell papillomas of the esophagus: a study
of 23 lesions for human papillomavirus by in situ hybridization and the polymerase chain reaction.
Hum Pathol, 1994;25:536-540
4 Poljak M, Cerar A, Orlowska J. P53 protein expression in esophageal squamous cell papillomas: a study of 36 lesions.
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Scand J Gastroenterol, 1996;31:10-13
5 Ravakhah K, Midamba F, West BC. Esophageal papillomatosis from human papilloma virus proven by polymerase chain reaction.
Am J Med Sci, 1998;316:285-288
6 Garzettic GG, Giavattini A, Goteri G, De-Nictoles M, Brugia M, Romanini C. Vaginal micropapillary lesion are not related to
human papillomavirus infection: in situ hybridization and polymerase chain reaction detection techniques.
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Gynecol Obstet Invest, 1994;38:134-139
7 沈忠英，李铧，沈健. 食管癌癌旁粘膜的改变及其意义. 汕头医专学报，1981；5：14-18
8 Yoshikawa H, Kawana T, Kitagawa K, Mizuno M, Yoshikura H, Iwamoto A. Detection and typing of multiple genital
human papillomaviruses by DNA amplification with consensus primers. Jpn J Cancer Res, 1991;82:524-531
9 黄培林, 陆伦根, 史志英, 尹克铮, 张晓明. 大肠肿瘤组织中人乳头状瘤病毒DNA的分子原位杂交研究. 华人消化杂志, 1998;6:771-773
, 百拇医药
10 Ushikai M, Fujiyoshi T, Kono M, Antrasena S, Oda H, Yoshida H, Fukuda K, Furuta S, Hakura A. Detection and cloning of
human papillomavirus DNA associated with recurrent respiratory papillomatosis in Thailand.
Jpn J Cancer Res, 1994;85:699-703
11 沈健，沈忠英. 亚硝胺诱发小鼠前胃鳞状细胞癌的实验研究. 汕头大学医学院学报，1999；12：20-22
12 Lanas A, Royo Y, Ortego J, Molina M, Sainz R. Experimental esophagitis induced by acid and pepsin in rabbits mimicking human
reflux esophagitis. Gastroenterology, 1999;116:97-107
13 Karras PJ, Barawi M, Webb B, Michalas A. Squamous cell papillomatosis of esophagus following placement of a self-expanding
metal stent. Dig Dis Sci, 1999;44:457-461, http://www.100md.com(沈 健 沈忠英 郑瑞明 吕丽春)