大鼠肝纤维化形成过程中肝窦毛细血管化的动态变化
上海中医药大学肝病研究所 上海市 200032
上海市教委曙光计划资助课题，No. 99SG44
项目负责人 刘成海上海中医药大学肝病研究所 上海市 200032
Tel. 0086-21-54232067
Email. Xionglu65@yahoo.com
收稿日期 2000-07-05 接收日期 2000-07-12
Subject headings liver cirrhosis; hepatic sinusoid; capillarization; dimethylnitrosamine; extracellular matrix; microscopy, electron; rats
, http://www.100md.com
主题词 肝硬化；肝窦毛细血管化；二甲基亚硝胺； 细胞外基质；显微镜检查，电子；大鼠
陆雄, 徐光福, 陈文慧, 刘成海, 刘平. 大鼠肝纤维化形成过程中肝窦毛细血管化的动态变化. 世界华人消化杂志，2000；8(12)：1415-1416
肝窦毛细血管化是肝纤维化过程中一个重要的病理改变，但目前对肝窦毛细血管化在肝纤维化中的形成过程尚缺乏系统的研究，肝窦毛细血管化是否可逆也未见报道. 我们用二甲基亚硝胺复制大鼠肝纤维化模型，24wk动态观察肝窦毛细血管化的形成过程及其与肝纤维化的关系，探讨其是否可逆.
1 材料和方法
1.1 材料 Wistar雄性大鼠90只，体重约150g(上海中医药大学实验动物中心提供);二甲基亚硝胺(dimethylinittrosamine,DMN),瑞典威灵公司产品.
, 百拇医药
1.2 方法 Wistar雄性大鼠60只，体质量约150g，随机分成10组，每组6只实验鼠，造模前按每DMN 335μL加10.15mol·L-1 NaCl稀释至66.96mL的比例配成腹腔注射液备用,每周连续3d给大鼠ip上述DMN稀释液2mL·kg-1(wk1为此剂量的2/3),共4wk,4wk后继续常规喂养至24wk；每组另设对照3只，生理盐水ip，剂量和次数同上. 分别于造模2d，1，2，3，4，5，6，8，12，24wk处死取材. 所有大鼠用乙醚麻醉,断头处死. 取肝左叶经常规固定. 石蜡包埋,切片厚度为5μm,胶原染色(丽春红染色法)，在光镜下观察肝组织纤维化程度,并参照有关文献制定肝组织胶原增生半定量判断标准. 0级:正常肝脏，无明显胶原纤维增生;1级:胶原纤维增生，中央静脉和门脉区有少量星状胶原纤维束放散，但无间隔形成; 2级:胶原纤维增生，中央静脉和门脉区结缔组织变厚，由此向四周伸出纤维索，形成不完全间隔; 3级:胶原纤维大量增生，有个别菲薄的完全间隔形成；或较厚的不完全间隔即将形成假小叶; 4级:完全间隔较厚，假小叶大量形成. 另外每组取正常组2只，模型组3只，按电镜制样要求取材、固定、超薄切片和染色、H-600透射电镜观察并照相，观察肝窦窦壁结构.
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2 结果
2.1 胶原染色 正常组及造模2d，仅在汇管区和中央静脉壁见少量胶原纤维，从1wk末起胶原逐渐增生，4wk末胶原增生最为明显，绝大多数形成较厚的完全间隔，以后虽略有减轻，但未见明显自动消退，24wk时仍见较厚的不完全纤维间隔(图1).
图1 DMN致肝纤维化大鼠胶原增生动态变化.
图2 正常肝窦，内皮细胞远侧胞质可见大量窗孔(示)，狄氏间隙可见多量微绒毛.
图3 造模2d，肝窦内皮窗孔数减少，窗孔间可见薄膜连接(示).
, 百拇医药
图4 造模2wk，肝窦内皮细胞远侧胞质窗孔数减少或消失，但内皮下尚未有基底膜形成.
图5 造模4wk，肝窦内皮窗孔消失，内皮下有完整的基底膜(示)形成.
图6 造模24wk，可见肝窦内皮窗孔 ，内皮下基底膜不连续.
2.2 电镜观察 正常血窦和狄氏间隙大小正常，肝窦内皮细胞扁平，胞核处的细胞器较多，远侧胞质呈薄片状，有许多窗孔，内皮下缺乏基底膜；狄氏间隙中时见少量胶原纤维，星状细胞较少，含大量脂滴，均为静息状态(图2). 造模2d部分肝窦内皮细胞远侧胞质窗孔数减少，内皮下尚未见基底膜形成(图3)；1, 2wk模型可见肝窦腔隙明显缩小，汇管区轻度扩大，可见较多量的胶原纤维和絮状无定型物质沉积，细胞数增多，大多呈梭型，肝窦内皮细胞远侧胞质窗孔数减少或消失，但内皮下尚未有基底膜形成(图4)；wk3时汇管区纤维间隔开始向小叶内伸展，肝细胞间隙增宽，间隔内细胞数明显增多，部分细胞核为卵圆形，胞质少，细胞器不发达，形似卵圆细胞；部分细胞呈长梭型，胞质丰富，内质网扩张，呈功能活跃的纤维母细胞状态；狄氏间隙中星状细胞增多，胞质中脂滴明显减少，细胞拉长呈梭性，外形似纤维母细胞. 肝窦腔仍狭小，间隔近旁的肝窦内皮细胞远侧胞质窗孔减少或消失，内皮下已开始有不完全的基底膜形成；4, 5wk时，间隔内有大量的胶原纤维束，其间散布纤维细胞，部分视野仍可见大量增生的长梭形的间质细胞. 纤维间隔近旁肝窦内皮细胞远侧胞质窗孔数几近消失，内皮下已有完整的基底膜形成(图5)；6, 8wk时，肝组织内仍可见大量的胶原纤维束，但肝窦内皮细胞远侧胞质失窗孔及内皮下基底膜形成程度有所减轻. 12wk，肝组织内胶原纤维仍大量沉积，肝窦内皮细胞胞质失窗孔进一步缓解，内皮下基底膜较多呈不连续状；24wk时，仍可见胶原束，肝窦内皮失窗孔及内皮下基底膜形成明显减轻(图6).
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3 讨论
DMN大鼠肝纤维化模型由化学毒物DMN诱导所致，该模型的建立已有20+a的历史，本实验过程中大鼠未见1例死亡且肝纤维化模型均复制成功，24wk后仍未见消退，表明Wistar雄性大鼠对此4wk 12剂的DMN量耐受性较好，由于该模型造模周期短，大鼠死亡率低，肝纤维化形成较为稳定，值得在防治肝纤维化研究中应用. 在DMN大鼠肝纤维化形成机制的认识上既往多认为系毒物在微体中的代谢产物直接对肝细胞的损害作用造成了肝细胞的坏死及肝纤维化；90年代有学者对该模型的研究发现，肝星状细胞通过细胞突起从外侧包围肝窦内皮细胞，造成肝窦内皮细胞持续受损，引起纤维蛋白在肝窦内沉积，出现肝脏微循环障碍，从而导致广泛肝坏死. 由此可见，通过间接途径损害肝功能是否也是DMN诱导肝纤维化的重要机制，值得进一步探索.
肝窦毛细血管化是肝纤维化过程中一个重要的病理改变，其形态学特点主要指肝窦内皮细胞远侧胞质失窗孔和内皮下基底膜的形成. 本研究发现DMN所致大鼠肝纤维化过程中，肝窦毛细血管化是逐渐形成的，肝窦内皮失窗孔明显早于纤维间隔的形成，而肝窦内皮下基底膜出现在wk2纤维间隔形成以后，表明肝窦内皮窗孔数减少可能是DMN间接损伤肝细胞的前提，而肝窦内皮下基底膜的形成可能是纤维化形成过程中细胞外基质沉积的后果. 肝窦毛细血管化减弱了肝细胞和血液之间的氧和营养物质的交换，最终导致肝细胞萎缩和肝窦塌陷，而肝细胞的损伤会促使Disse间隙细胞外基质进一步沉积，加重肝纤维化向肝硬变转变，造成恶性循环. 由此可见肝窦毛细血管化是否可逆关系到肝硬变肝纤维化能否逆转的重大理论问题.
有关肝窦毛细血管化是否可逆目前很少报道，本实验观察结果表明，DMN大鼠肝纤维化模型24wk时，肝窦毛细血管化的超微结构显著改善，提示肝窦毛细血管化为一可逆性变化，积极防治肝窦毛细血管化，对逆转肝纤维化有重要的临床意义. 另外本研究还发现DMN模型24wk肝纤维化未见明显消退，提示肝窦毛细血管化与肝纤维化相关性不完全一致，近年有研究表明原发性肝癌中也有肝窦毛细血管化的改变，肝窦毛细血管化是否为一较为独立的病理改变以及其病理意义有待进一步研究., http://www.100md.com(陆 雄 徐光福 陈文慧 刘成海 刘 平)
上海市教委曙光计划资助课题，No. 99SG44
项目负责人 刘成海上海中医药大学肝病研究所 上海市 200032
Tel. 0086-21-54232067
Email. Xionglu65@yahoo.com
收稿日期 2000-07-05 接收日期 2000-07-12
Subject headings liver cirrhosis; hepatic sinusoid; capillarization; dimethylnitrosamine; extracellular matrix; microscopy, electron; rats
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主题词 肝硬化；肝窦毛细血管化；二甲基亚硝胺； 细胞外基质；显微镜检查，电子；大鼠
陆雄, 徐光福, 陈文慧, 刘成海, 刘平. 大鼠肝纤维化形成过程中肝窦毛细血管化的动态变化. 世界华人消化杂志，2000；8(12)：1415-1416
肝窦毛细血管化是肝纤维化过程中一个重要的病理改变，但目前对肝窦毛细血管化在肝纤维化中的形成过程尚缺乏系统的研究，肝窦毛细血管化是否可逆也未见报道. 我们用二甲基亚硝胺复制大鼠肝纤维化模型，24wk动态观察肝窦毛细血管化的形成过程及其与肝纤维化的关系，探讨其是否可逆.
1 材料和方法
1.1 材料 Wistar雄性大鼠90只，体重约150g(上海中医药大学实验动物中心提供);二甲基亚硝胺(dimethylinittrosamine,DMN),瑞典威灵公司产品.
, 百拇医药
1.2 方法 Wistar雄性大鼠60只，体质量约150g，随机分成10组，每组6只实验鼠，造模前按每DMN 335μL加10.15mol·L-1 NaCl稀释至66.96mL的比例配成腹腔注射液备用,每周连续3d给大鼠ip上述DMN稀释液2mL·kg-1(wk1为此剂量的2/3),共4wk,4wk后继续常规喂养至24wk；每组另设对照3只，生理盐水ip，剂量和次数同上. 分别于造模2d，1，2，3，4，5，6，8，12，24wk处死取材. 所有大鼠用乙醚麻醉,断头处死. 取肝左叶经常规固定. 石蜡包埋,切片厚度为5μm,胶原染色(丽春红染色法)，在光镜下观察肝组织纤维化程度,并参照有关文献制定肝组织胶原增生半定量判断标准. 0级:正常肝脏，无明显胶原纤维增生;1级:胶原纤维增生，中央静脉和门脉区有少量星状胶原纤维束放散，但无间隔形成; 2级:胶原纤维增生，中央静脉和门脉区结缔组织变厚，由此向四周伸出纤维索，形成不完全间隔; 3级:胶原纤维大量增生，有个别菲薄的完全间隔形成；或较厚的不完全间隔即将形成假小叶; 4级:完全间隔较厚，假小叶大量形成. 另外每组取正常组2只，模型组3只，按电镜制样要求取材、固定、超薄切片和染色、H-600透射电镜观察并照相，观察肝窦窦壁结构.
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2 结果
2.1 胶原染色 正常组及造模2d，仅在汇管区和中央静脉壁见少量胶原纤维，从1wk末起胶原逐渐增生，4wk末胶原增生最为明显，绝大多数形成较厚的完全间隔，以后虽略有减轻，但未见明显自动消退，24wk时仍见较厚的不完全纤维间隔(图1).
图1 DMN致肝纤维化大鼠胶原增生动态变化.
图2 正常肝窦，内皮细胞远侧胞质可见大量窗孔(示)，狄氏间隙可见多量微绒毛.
图3 造模2d，肝窦内皮窗孔数减少，窗孔间可见薄膜连接(示).
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图4 造模2wk，肝窦内皮细胞远侧胞质窗孔数减少或消失，但内皮下尚未有基底膜形成.
图5 造模4wk，肝窦内皮窗孔消失，内皮下有完整的基底膜(示)形成.
图6 造模24wk，可见肝窦内皮窗孔 ，内皮下基底膜不连续.
2.2 电镜观察 正常血窦和狄氏间隙大小正常，肝窦内皮细胞扁平，胞核处的细胞器较多，远侧胞质呈薄片状，有许多窗孔，内皮下缺乏基底膜；狄氏间隙中时见少量胶原纤维，星状细胞较少，含大量脂滴，均为静息状态(图2). 造模2d部分肝窦内皮细胞远侧胞质窗孔数减少，内皮下尚未见基底膜形成(图3)；1, 2wk模型可见肝窦腔隙明显缩小，汇管区轻度扩大，可见较多量的胶原纤维和絮状无定型物质沉积，细胞数增多，大多呈梭型，肝窦内皮细胞远侧胞质窗孔数减少或消失，但内皮下尚未有基底膜形成(图4)；wk3时汇管区纤维间隔开始向小叶内伸展，肝细胞间隙增宽，间隔内细胞数明显增多，部分细胞核为卵圆形，胞质少，细胞器不发达，形似卵圆细胞；部分细胞呈长梭型，胞质丰富，内质网扩张，呈功能活跃的纤维母细胞状态；狄氏间隙中星状细胞增多，胞质中脂滴明显减少，细胞拉长呈梭性，外形似纤维母细胞. 肝窦腔仍狭小，间隔近旁的肝窦内皮细胞远侧胞质窗孔减少或消失，内皮下已开始有不完全的基底膜形成；4, 5wk时，间隔内有大量的胶原纤维束，其间散布纤维细胞，部分视野仍可见大量增生的长梭形的间质细胞. 纤维间隔近旁肝窦内皮细胞远侧胞质窗孔数几近消失，内皮下已有完整的基底膜形成(图5)；6, 8wk时，肝组织内仍可见大量的胶原纤维束，但肝窦内皮细胞远侧胞质失窗孔及内皮下基底膜形成程度有所减轻. 12wk，肝组织内胶原纤维仍大量沉积，肝窦内皮细胞胞质失窗孔进一步缓解，内皮下基底膜较多呈不连续状；24wk时，仍可见胶原束，肝窦内皮失窗孔及内皮下基底膜形成明显减轻(图6).
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3 讨论
DMN大鼠肝纤维化模型由化学毒物DMN诱导所致，该模型的建立已有20+a的历史，本实验过程中大鼠未见1例死亡且肝纤维化模型均复制成功，24wk后仍未见消退，表明Wistar雄性大鼠对此4wk 12剂的DMN量耐受性较好，由于该模型造模周期短，大鼠死亡率低，肝纤维化形成较为稳定，值得在防治肝纤维化研究中应用. 在DMN大鼠肝纤维化形成机制的认识上既往多认为系毒物在微体中的代谢产物直接对肝细胞的损害作用造成了肝细胞的坏死及肝纤维化；90年代有学者对该模型的研究发现，肝星状细胞通过细胞突起从外侧包围肝窦内皮细胞，造成肝窦内皮细胞持续受损，引起纤维蛋白在肝窦内沉积，出现肝脏微循环障碍，从而导致广泛肝坏死. 由此可见，通过间接途径损害肝功能是否也是DMN诱导肝纤维化的重要机制，值得进一步探索.
肝窦毛细血管化是肝纤维化过程中一个重要的病理改变，其形态学特点主要指肝窦内皮细胞远侧胞质失窗孔和内皮下基底膜的形成. 本研究发现DMN所致大鼠肝纤维化过程中，肝窦毛细血管化是逐渐形成的，肝窦内皮失窗孔明显早于纤维间隔的形成，而肝窦内皮下基底膜出现在wk2纤维间隔形成以后，表明肝窦内皮窗孔数减少可能是DMN间接损伤肝细胞的前提，而肝窦内皮下基底膜的形成可能是纤维化形成过程中细胞外基质沉积的后果. 肝窦毛细血管化减弱了肝细胞和血液之间的氧和营养物质的交换，最终导致肝细胞萎缩和肝窦塌陷，而肝细胞的损伤会促使Disse间隙细胞外基质进一步沉积，加重肝纤维化向肝硬变转变，造成恶性循环. 由此可见肝窦毛细血管化是否可逆关系到肝硬变肝纤维化能否逆转的重大理论问题.
有关肝窦毛细血管化是否可逆目前很少报道，本实验观察结果表明，DMN大鼠肝纤维化模型24wk时，肝窦毛细血管化的超微结构显著改善，提示肝窦毛细血管化为一可逆性变化，积极防治肝窦毛细血管化，对逆转肝纤维化有重要的临床意义. 另外本研究还发现DMN模型24wk肝纤维化未见明显消退，提示肝窦毛细血管化与肝纤维化相关性不完全一致，近年有研究表明原发性肝癌中也有肝窦毛细血管化的改变，肝窦毛细血管化是否为一较为独立的病理改变以及其病理意义有待进一步研究., http://www.100md.com(陆 雄 徐光福 陈文慧 刘成海 刘 平)