胃癌P16和APC基因突变的意义
天津市第三中心医院肝胆疾病研究所 天津市 300170
项目负责人 朱争艳天津市第三中心医院肝胆疾病研究所 天津市 300170
收稿日期 2000-05-03 接收日期 2000-06-18
Subject headings stomach neoplasms/pathology; genes, P16; genes, APC; gene expression
主题词 胃肿瘤/病理学；基因，P16；基因，APC；突变；基因表达
朱争艳, 田欣, 王星, 杨香玲. 胃癌P16和APC基因突变的意义. 世界华人消化杂志，2000；8(12)：1418-1419
, http://www.100md.com
我们收集80例内镜活检胃粘膜组织标本，分析其P16,APC基因突变情况，结果如下.
1 材料和方法
1.1 材料 免疫组化试剂购自北京中山生物技术有限公司；PCR引物由北京赛百盛生物技术公司合成；随机引物购自北京泰克金生物技术有限公司；α-32P-dCTP购自北京亚辉生物医学工程公司；含有P16 cDNA序列的质粒pBS由北京医科大学张波教授惠赠；鲑鱼精DNA，限制性内切酶购自华美生物技术公司.
1.2 方法 P16免疫组化染色按常规进行. 结果判定：阳性细胞数<25%为表达减少，无阳性细胞为表达缺失. P16斑点杂交及Southern杂交，按经典方法. P16 PCR-SSCP分析参见文献[1]. ①基因组DNA甲基化状态分析：基因组DNA 1μg～2μg在50μL的反应体系中加入20u的HindⅢ/SacⅡ酶切37℃ 24h；以EcoRⅠ酶切后的P16 cDNA质粒为模板，用随机引物标记制备成探针，进行Southern杂交. ②CDKN2基因甲基化状态的判定：HindⅢ,EcoRⅠ等内切酶对DNA甲基化不敏感，而另外一些酶如EagⅠ,SacⅡ,SmaⅠ等则对DNA的甲基化比较敏感. 由此我们可以通过内切酶来判断DNA是否存在甲基化. ③APC PCR-RFLP分析：PCR扩增，将2μL扩增产物加入含6.0u RsaⅠ的10μL酶切体系中，37℃过夜. 结果判定：APC基因经PCR及酶切后，出现133bp,85bp和48bp三条带者为杂合子. 若正常组织为杂合子，肿瘤组织只有133bp单一条带，或只有85bp和48bp两条酶切带，判为杂合型缺失；正常及肿瘤组织均只有133bp或只有85bp,48bp两条带者为纯合子.
, 百拇医药
2 结果
2.1 P16免疫组化分析 80例胃癌活检组织中，胃癌62例有8例表达缺失，12例表达减少；异型增生10例有1例表达缺失，3例表达下降；肠上皮化生8例1例有缺失，3例表达下降.
2.2 P16 PCR-SSCP分析 活检组织在P16基因第1，2外显子各有5例有异常电泳带，除1例在肠化外，余均发生在肿瘤组织内.
2.3 P16基因异常甲基化分析 活检组织在10例SSCP分析有基因突变的标本中，8例出现异常甲基化(即除出现3.9kb杂交带外还有6kb杂交带出现)，在SSCP分析未见异常的标本中，有5例出现异常甲基化.
, 百拇医药
2.4 APC PCR-RFLP分析 在所有的胃癌标本中55例为杂合子，仅2例发生缺失，其中1例同时存在P53第7外显子和P16第1外显子的突变. 组织学分型为低分化腺癌.
3 讨论
基因缺失是导致抑癌基因功能失活的主要原因之一. 我们检测了80例不同胃粘膜组织中p16蛋白表达的情况，结果表明：P16蛋白在不同胃粘膜组织中均有表达，但表达水平有所差异. 胃癌中P16蛋白表达水平低于其他胃疾病，差异有显著性. 提示胃癌的发生可能与P16蛋白的表达缺失有关. 在第1，2外显子的基因突变，最终可能引起所编码的蛋白质氨基酸的改变. 有研究表明，P16基因第1外显子的异常甲基化与mRNA失活呈正相关[2]. 我们的结果显示有13例出现异常甲基化. 可见P16基因异常甲基化也是胃癌较常见的分子生物学改变. 此外约2/3有CDK2基因突变的病例伴有该基因的异常甲基化，提示基因的异常甲基化与基因突变有着内在的联系. Tamura et al[3]应用PCR-SSCP分析结合序列测定检测了30例胃腺癌，发现APC基因突变率为20%(6/30)，6例突变中有3例存在另一等位基因的缺失，从直径为0.4cm的小腺癌到1cm以上的大腺癌，APC突变率保持恒定，并且与不典型增生程度无关. 这表明同大肠腺癌分子机制相似，APC基因突变在胃腺瘤向腺癌转变中可能起重要作用. Sano et al[4]研究了48例胃癌组织抑癌基因杂合缺失发现染色体5q缺失率在早期为60%，进展期为36%，也有人认为APC缺失只出现在胃癌中，提示APC在胃癌的发生发展过程中起作用. 我们的结果较前人报道为低，可能是因为我们仅检测了一个外显子，而APC第11外显子并非胃癌的突变热点.
, 百拇医药
4 参考文献
1 朱争艳，宫恩聪，吴秉铨. 肝细胞癌中ras,p53基因突变的研究. 临床肝胆病杂志，1997；13：31-33
2 Gonzalez-Zulueta M, Bender CM, Yang AS, Nguyen T, Beart RW, van Tornout JM, Jones PA. Methylation of the 5＇-CpG island of
the p16 CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing.
Cancer Res, 1995;55:4531-4535
, 百拇医药
3 Tamura G, Maesawa C, Suzuki Y, Tamada H, Satoh M, Ogasawara S, Kashiwaba M, Satodate R. Mutation of the APC gene occur
during early stages of gastric adenoma development. Cancer Res, 1994;54:1149-1151
4 Sano T, Tsujino T, Yoshidu K, Nakayama H, Hayuma K, Ito H, Nakamura Y, Kajiyama G, Tahara E. Frequent loss of heterozygosity
on chromosomes 1q, 5q, and 17p in human gastric carcinomas. Cancer Res, 1991;51:2926-2931, 百拇医药(朱争艳 田 欣 王 星 杨香玲)
项目负责人 朱争艳天津市第三中心医院肝胆疾病研究所 天津市 300170
收稿日期 2000-05-03 接收日期 2000-06-18
Subject headings stomach neoplasms/pathology; genes, P16; genes, APC; gene expression
主题词 胃肿瘤/病理学；基因，P16；基因，APC；突变；基因表达
朱争艳, 田欣, 王星, 杨香玲. 胃癌P16和APC基因突变的意义. 世界华人消化杂志，2000；8(12)：1418-1419
, http://www.100md.com
我们收集80例内镜活检胃粘膜组织标本，分析其P16,APC基因突变情况，结果如下.
1 材料和方法
1.1 材料 免疫组化试剂购自北京中山生物技术有限公司；PCR引物由北京赛百盛生物技术公司合成；随机引物购自北京泰克金生物技术有限公司；α-32P-dCTP购自北京亚辉生物医学工程公司；含有P16 cDNA序列的质粒pBS由北京医科大学张波教授惠赠；鲑鱼精DNA，限制性内切酶购自华美生物技术公司.
1.2 方法 P16免疫组化染色按常规进行. 结果判定：阳性细胞数<25%为表达减少，无阳性细胞为表达缺失. P16斑点杂交及Southern杂交，按经典方法. P16 PCR-SSCP分析参见文献[1]. ①基因组DNA甲基化状态分析：基因组DNA 1μg～2μg在50μL的反应体系中加入20u的HindⅢ/SacⅡ酶切37℃ 24h；以EcoRⅠ酶切后的P16 cDNA质粒为模板，用随机引物标记制备成探针，进行Southern杂交. ②CDKN2基因甲基化状态的判定：HindⅢ,EcoRⅠ等内切酶对DNA甲基化不敏感，而另外一些酶如EagⅠ,SacⅡ,SmaⅠ等则对DNA的甲基化比较敏感. 由此我们可以通过内切酶来判断DNA是否存在甲基化. ③APC PCR-RFLP分析：PCR扩增，将2μL扩增产物加入含6.0u RsaⅠ的10μL酶切体系中，37℃过夜. 结果判定：APC基因经PCR及酶切后，出现133bp,85bp和48bp三条带者为杂合子. 若正常组织为杂合子，肿瘤组织只有133bp单一条带，或只有85bp和48bp两条酶切带，判为杂合型缺失；正常及肿瘤组织均只有133bp或只有85bp,48bp两条带者为纯合子.
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2 结果
2.1 P16免疫组化分析 80例胃癌活检组织中，胃癌62例有8例表达缺失，12例表达减少；异型增生10例有1例表达缺失，3例表达下降；肠上皮化生8例1例有缺失，3例表达下降.
2.2 P16 PCR-SSCP分析 活检组织在P16基因第1，2外显子各有5例有异常电泳带，除1例在肠化外，余均发生在肿瘤组织内.
2.3 P16基因异常甲基化分析 活检组织在10例SSCP分析有基因突变的标本中，8例出现异常甲基化(即除出现3.9kb杂交带外还有6kb杂交带出现)，在SSCP分析未见异常的标本中，有5例出现异常甲基化.
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2.4 APC PCR-RFLP分析 在所有的胃癌标本中55例为杂合子，仅2例发生缺失，其中1例同时存在P53第7外显子和P16第1外显子的突变. 组织学分型为低分化腺癌.
3 讨论
基因缺失是导致抑癌基因功能失活的主要原因之一. 我们检测了80例不同胃粘膜组织中p16蛋白表达的情况，结果表明：P16蛋白在不同胃粘膜组织中均有表达，但表达水平有所差异. 胃癌中P16蛋白表达水平低于其他胃疾病，差异有显著性. 提示胃癌的发生可能与P16蛋白的表达缺失有关. 在第1，2外显子的基因突变，最终可能引起所编码的蛋白质氨基酸的改变. 有研究表明，P16基因第1外显子的异常甲基化与mRNA失活呈正相关[2]. 我们的结果显示有13例出现异常甲基化. 可见P16基因异常甲基化也是胃癌较常见的分子生物学改变. 此外约2/3有CDK2基因突变的病例伴有该基因的异常甲基化，提示基因的异常甲基化与基因突变有着内在的联系. Tamura et al[3]应用PCR-SSCP分析结合序列测定检测了30例胃腺癌，发现APC基因突变率为20%(6/30)，6例突变中有3例存在另一等位基因的缺失，从直径为0.4cm的小腺癌到1cm以上的大腺癌，APC突变率保持恒定，并且与不典型增生程度无关. 这表明同大肠腺癌分子机制相似，APC基因突变在胃腺瘤向腺癌转变中可能起重要作用. Sano et al[4]研究了48例胃癌组织抑癌基因杂合缺失发现染色体5q缺失率在早期为60%，进展期为36%，也有人认为APC缺失只出现在胃癌中，提示APC在胃癌的发生发展过程中起作用. 我们的结果较前人报道为低，可能是因为我们仅检测了一个外显子，而APC第11外显子并非胃癌的突变热点.
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4 参考文献
1 朱争艳，宫恩聪，吴秉铨. 肝细胞癌中ras,p53基因突变的研究. 临床肝胆病杂志，1997；13：31-33
2 Gonzalez-Zulueta M, Bender CM, Yang AS, Nguyen T, Beart RW, van Tornout JM, Jones PA. Methylation of the 5＇-CpG island of
the p16 CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing.
Cancer Res, 1995;55:4531-4535
, 百拇医药
3 Tamura G, Maesawa C, Suzuki Y, Tamada H, Satoh M, Ogasawara S, Kashiwaba M, Satodate R. Mutation of the APC gene occur
during early stages of gastric adenoma development. Cancer Res, 1994;54:1149-1151
4 Sano T, Tsujino T, Yoshidu K, Nakayama H, Hayuma K, Ito H, Nakamura Y, Kajiyama G, Tahara E. Frequent loss of heterozygosity
on chromosomes 1q, 5q, and 17p in human gastric carcinomas. Cancer Res, 1991;51:2926-2931, 百拇医药(朱争艳 田 欣 王 星 杨香玲)