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编号:10697022
肝硬变患者肠道菌丛潜生体及群集体
http://www.100md.com 2001年1月15日 《世界华人消化杂志》 2001年第1期
     中国人民解放军第三军医大学西南医院消化科 重庆市 400038

    本课题受国家自然科学基金资助, No.39870346

    项目负责人
梁后杰 中国人民解放军第三军医大学西南医院消化科 重庆市 400038

    Tel. 0086-23-68754128

    Email. liang houjie·sina.com

    收稿日期 2000-04-03 接收日期 2000-04-13

    

    主题词
肝硬化;潜生体;细菌;繁殖;肠杆菌属
, 百拇医药
    林进乾, 梁后杰, 徐启旺, 刘俊康, 刘为纹. 肝硬变患者肠道菌丛潜生体及群集体. 世界华人消化杂志,2001;9(1):107-109

    近年来,徐启旺et al[1,2]在生物波理论研究中,观察到细菌在一定条件下可以出现短小杆菌和纤细状菌两种形态交替而致的宏观波动生长. 纤细状菌体长约几十微米,是繁殖体短小杆菌的几十倍. 呈多个拟核,生理上表现为代谢降低,在有利于生长的环境中可断裂成多个繁殖体,表现为潜在增殖的能力,故称为潜生体(cryptic growth cell,CGC). 进一步研究表明,这种细菌潜生体迅速断裂,加上胞外多糖的包绕可形成细菌的群集,这些群集状的细菌群体少则有6~8个,多则有几十个细菌排列在一起. 群集形成是结构上的复杂化,必然会带来功能上的多样性,已证明,细菌群集体在肠壁上的定植,可导致明显的组织损伤. 肝硬变常并发门脉高压和腹水形成,导致胃肠道瘀血和组织水肿[3],加之临床上抗生素应用的普遍性和不规范性,必然导致肠道内环境的改变和微生态学的变化[4,5]. 我们对肝硬变患者肠道细菌潜生体和群集性及其特性进行初步报道.
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    1 材料和方法

    1.1 材料
肝炎后肝硬变患者86例,均经病史、临床表现、生化、B超或CT等检查. 参照1990-07全国肝硬变专题学术讨论会制订的标准[6]. 明确诊断. 其中男66例,女20例,年龄19-74(平均47.3)岁. 肝功能分级:A级27例,B级49例,C级11例. 入院前1mo内未使用抗生素和明显影响肠道菌群药物. 自发性腹膜炎(SBP)的诊断标准参照1988-04福州全国腹水学术讨论会制定的标准. 随机选择健康献血者20例为正常对照组. 男16例,女4例,年龄23~48(平均26)岁,均在1mo内未用过抗生素和无腹泻,腹痛, 腹胀等消化道症状.

    1.2 方法 将少许粪便标本混悬于稀释液中,振荡1min,以混悬液涂片作革蓝染色,相差显微镜下观察标本细菌群集块及潜生体的有无及数量. 如有潜生体,将上述混悬液进行10倍系列稀释,分别取10-3, 10-6, 10-9的稀释管中液涂布于营养琼脂平板上培养,在相差显微镜下定位后每隔30min观察1次,确定其是否能够生长以确定潜生体的死活. 取上述混悬稀释液涂布于营养琼脂平板上培养24h作药物敏感试验. 原标本作多糖负染检查: 取1小滴蛋清液放于玻片上,将待检菌少许涂于其中,摊平、干燥,用固定液覆于其上,约45s~1min,滤纸吸干. 加石炭酸复红液覆于其上,2min后用滤纸吸干. 加结晶紫染液,5s~10s后用自来水轻轻冲洗干净,显微镜下检查. 在Shapi的方法基础上加以改良作显微培养. 盖玻片中央铺上厚1mm,面积为1cm2的培养基,加10μL菌悬液(浓度为1×1010·L-1),反扣于特别凹型玻片的凹型槽上,凹型槽中预先加一层lg·L-1琼脂糖,37℃湿盒培养并在相差显微镜下动态观察细菌生长过程. 采用显微培养方法作潜生体传代及遗传稳定性试验,分离潜生体分别进行需氧、厌氧培养, 37℃, 24h后观察其生长情况. 子代个体的菌落进行定性鉴定. 鉴定方法采用需氧菌,厌氧菌常规鉴定法进行. 将显微培养所得的潜生体,用含透明质酸酶的营养肉汤37℃培养18h后, 制成1010cfu·L-1菌潜生体回复生长形成的繁殖体悬液.
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    在波动生长平板上取潜生体,接种于显微培养系统中,37℃保湿条件下用相差显微镜观察运动及自旋小体的形成及增殖过程. 用无菌滴管吸取溶化冷至50℃的含5g·L-1琼脂的LB培养基,加入凹玻片的凹孔中,加满为宜, 盖上盖玻片,注意不留气泡,待培养基冷却凝固后,移开盖玻片, 接种一环潜生体稀释液于培养基上,涂匀,随后盖上盖玻片. 37℃湿盒培养1h后取出,于相差显微镜下动态观察细菌发生过程. 观察过程中用白炽灯加热,使温度维持在30℃~35℃. MIC测定:分别配制羟氨苄青霉素、氟哌酸、先锋必、丁胺卡那霉素、妥布霉素、四环素、多粘菌素B原液(1000mg·L-1), 分别用MH液体培养基稀释至512mg·L-1, 经倍比稀释,分别得到含终浓度依次为512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1mg·L-1的液体培养基,同时设立不含抗生素的对照管. 加入0.05mL已校正浓度的波动潜生体、潜生体回复生长繁殖体和原代分离培养的繁殖体3种菌悬液, 混匀, 置37℃培养18h后观察结果, 以不出现生长的抗生素最高浓度作为MIC.
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    2 结果

    正常人粪便中可检测到少量散在的潜生体(5%), 但不能传代生长,即不具备遗传稳定性; 50%肝硬变患者粪便中可检测到菌群群体的CGC, 即CGC化,传代试验表明其子代个体中仍有大量的CGC生长, 由CGC长出的繁殖体形成群集. 经显微培养,对其子代个体菌落鉴定发现,形成CGC的细菌主要为大肠杆菌,乳酸杆菌,真杆菌等. CGC的形成群集采用显微培养技术, 于保温保湿条件下,用相差显微镜对CGC形成群集的过程进行连续动态观察. 结果显示,在培养2h后, 波动CGC断裂,断裂细菌开始大量繁殖, 培养8h后,完全断裂成多个短菌, 形成一个群集小体.

    2.1 CGC增殖方式 ①断裂增殖:CGC可沿长轴方向出现多部位断裂,生成多个子代个体,每个子代个体均可发育成为繁殖体;②出芽增殖: 这一增殖过程中可见CGC多个部位出芽,新生芽不断延长, 最后也可多处断裂, 以这种方式, 一个CGC往往增殖成一个微小的群体;③自旋脱落: 在相差显微镜下,可看到部分病例CGC能够进行特殊的运动,一端形成S型弯曲,其余部分围绕弯曲部分多圈缠绕,稳定地自旋运动. 这种结构我们称之为自旋小体,旋转过程,一端不断脱落下子代个体,离开自旋小体而成为独立的生活单位.
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    2.2 CGC体外抗药性 波动CGC对各种抗生素的MIC较其回复生长形成的繁殖体及原代培养繁殖体均高6~8倍(表1). 两种繁殖体MIC基本一致.

    1 细菌存在形式对抗生素的MIC的比较
抗生素MIC/(mg·L-1)
CGC回复生长繁殖体繁殖体
羟氨苄青霉素5126464
先锋必6442
丁胺苄那霉素6448
妥布霉素811
氟哌酸6421
四环素2563216
多抗生素B128816

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    3 讨论


    许多学者已从定量和定性资料证实,肝硬变患者结肠菌群中总厌氧菌数和某些G杆菌如拟杆菌、梭菌、双歧杆菌、肠球菌和大肠杆菌等数量显著增多,其中拟杆菌、梭菌、双歧杆菌和铜绿假芽胞菌逆行至回肠内生长繁衍[6,7]. 动物实验还表明,肝硬变大鼠肠道细菌发生肠系膜淋巴结细菌易位率显著高于健康鼠,细菌易位被认为是SBP发生的重要因素之一[8,9]. 但对肠道菌丛的生存形式或生存状态及其与致病性关系尚缺乏研究. 我们采用生物波理论研究的双机制波动实验模型和显微培养等技术,对肝硬变患者肠道菌丛的生存状态及其特性进行了较为详尽的研究. 结果发现,肝硬变患者存在有涉及菌群整体的CGC巨涨落,表现为以大肠杆菌为主的细菌潜生体生长,并可稳定传代,同时出现相同菌源的群集生长现象. CGC与繁殖体相比, 有其特殊的生物学性状: ①菌体可以是繁殖体的几倍到几十倍,电镜观察其胞壁结构完整, 多糖染色显示胞外糖较多; ②运动活泼,呈定向,自旋及群体耦合等特殊运动方式, 显示群集倾向及抛锚定植特征;③以发酵方式代谢,生长力旺盛,在恢复生长期,易出现自溶现象;④可以出芽、断裂、自旋脱落等快速繁殖方式形成群集,进而表现出抗生素群体耐受特征;⑤在不利环境中,繁殖体迅速转变为潜生体而存在,CGC对pH、渗透压改变及干燥等多种不利环境有适应抵抗能力.
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    自从抗生素问世以来,细菌耐药问题一直困扰着临床医生和临床微生物学家. Hobby et al发现除细菌自发性突变导致的细菌耐药外,还有其他一些因素可导致细菌的暂时性耐受抗生素. 导致细菌对抗生素暂时耐受的因素尚未阐明,本研究的波动潜生体导致的群集耐受可能是其主要原因之一. CGC时抗生素的MIC高于对照繁殖体的6~8倍,而经含透明质酸酶的肉汤培养后,得到的繁殖体与原代培养的繁殖体基本一致. 这一发现不仅为细菌耐药机制增加了新的认识,而且为解决这一临床难题提供了新的思路和方法. 肝硬变患者肠道细菌CGC化的形成机制尚难肯定. 实验发现,CGC发生率与肝功能损害程度呈正比. 我们推测,肝硬变患者的肝功异常,免疫功能下降以及门静脉压力升高,胃肠道瘀血,粘膜水肿,肠道内pH变化等所致的肠道内环境改变可能是CGC形成的重要原因之一. SBP是肝硬变常见的严重并发症之一,其病原菌多为革蓝阴性杆菌,据认为主要来源于肠道菌丛. 实验研究也发现肝硬变鼠确有肠道细菌的易位[9,10]. 目前对SBP发病过程的研究多集中于宿主因素, 如肝脏枯否细胞吞噬功能下降, 腹水调理活性低下,低蛋白及低C3水平等[11],而对细菌本身的毒力因子及特性在SBP发病中的作用却一直未引起重视. 我们的研究发现4例SBP患者均有肠道CGC形成和细菌群集,经传代鉴定均为大肠杆菌,与在腹水中分离培养出的细菌相同. 进一步对其生物学特性研究发现,其CGC均能以自旋方式高速旋转运动, 且在琼脂培养中可浸润至较远部位,具有较强的运动和侵袭能力. 提示肠道细菌CGC的形成及其高速自旋运动可能在SBP的形成中起着重要作用.
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    4 参考文献

    1 徐启旺, 张邦燮, 李惠荣. 绿脓杆菌群集生长效应. 中国微生态学杂志, 1990;2:1-4 

    2 刘俊康, 郭刚,张守印, 徐启旺. 生物波理论研究. 中国微生态学杂志, 1994;6:40-46

    3 谢友仁, 谢方侠, 曹爱红. 肝硬变门脉高压患者结肠粘膜改变. 华人消化杂志, 1998;6(特刊7):393-394

    4 陈仕珠, 步雪, 张路, 韩燕. 晚期肝炎后肝硬变并发自发细菌性胸膜炎. 新消化病学杂志, 1996;4:22-24

    5 索标, 吕临英, 郝旺胜. 氟哌酸对肝硬变伴发自发性细菌性腹膜炎者复发的预防疗效观察. 世界华人消化杂志,2000;8(特刊8):97
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    6 刘丽娜, 付永潜, 黄天卫,李春梅. 肝硬化患者肠道菌群状态之初步探讨. 中华流行病学杂志, 1989;10:287-290

    7 Marencos FC, Caslano GD, Ramoss LM, Arias ML, Ledesma F, Romero FD. Small bowel bacterial overgrowth in patients with

    alcoholic cirrhosis. Dig Dis Sci, 1995;40:1252-1256

    8 Carcia-Tsao G, Lee FY, Barden GE, Cartun R, West AB. Bacterial translocation to mesenteric lymph nods is increased in cirrholic
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    rats with ascites. Gastroenterology, 1995;108:1835-1841

    9 Guarner C, Runyon BA, Young S, Heck M, Sheikh MY. Intestinal bacterial overgrowth and bacterial translocation in cirrholic rats

    with ascites. J Hepatol, 1997;26:1372-1378

    10 Caly WR, Strauss E. Prospective study of bacterial infections in patients with cirrhosis. J Hepatol, 1993;18:353-358

    11 Soriano G, Coll P, Guarner C, Such J, Sanchez F, Prats G, Vilardell F.Escherichia Coli capsular polysaccharide and

    spontaneous bacterial peritonitis cirrhosis. Hepatology, 1995;21:668-673, 百拇医药(林进乾 梁后杰 徐启旺 刘俊康 刘为纹)