丙型肝炎患者LDL-R等位基因的多态性
中国人民解放军302医院 传染病研究所 生物工程研究室 北京市 100039
项目负责人 王福生 中国人民解放军302医院 传染病研究所 生物工程研究室 北京市 100039
Email. fswang@public.bta.net.cn
收稿日期 2000-10-10 接受日期 2000-10-12
主题词 肝炎病毒，丙型；低密度脂蛋白受体；突变；胆固醇；基因表达；基因频率
刘明旭, 王福生, 金磊, 雷周云, 施红, 刑利和. 丙型肝炎患者LDL-R等位基因的多态性. 世界华人消化杂志，2001；9(2)：217-218
, http://www.100md.com
丙型肝炎病毒(HCV)感染呈全球分布[1]，而我国是丙型肝炎的高发区[2-4]. HCV感染者80%发展成为慢性肝炎[5-7]，而且发生肝硬变和肝细胞癌的危险性显著提高[8,9]. 最近证实低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor, LDL-R)可以识别和内化与低密度脂蛋白或极低密度脂蛋白结合的HCV[10-12]，从而确定LDL-R为HCV受体[13-15]. LDL-R主要分布于肝实质细胞，能够结合并内化低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)和极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)，利用其中的胆固醇，从而参与胆固醇代谢，并调节血液胆固醇水平[16,17]. LDL-R的基因突变和单碱基多态性(single nucloetide polyphorism, SNP)种类比较多，多数与脂代谢异常有关[18-20]. LDL-R基因突变和(或)SNP是否与HCV有关，目前国内外尚未见报道，因此是一个值得探讨的问题. 人LDL-R由839个氨基酸组成，其胞外区分为配体结合区、EGF前体同源区和糖基化区. 其中配体结合区含7个比较保守的重复序列，有6个半胱氨酸3形成个二硫键，以维持每个结构域的高级结构；C端含有SDE三连体，带有负电荷，从而与其配体apoB/apoE相结合[16,21]. 我们选择LDL-R第13外显子的AvaⅡSNP位点，调查其基因频率与HCV感染的关系，现将结果报道如下.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 选择HCV-RNA或(和)HCV抗体阳性，确诊为丙型肝炎的患者76例，年龄6～81(平均43.9)岁，男49例，女27例，采集其非抗凝血. 本院工作人员中HBV和HCV病毒指标和抗体全部阴性者抗凝血样88份，年龄17～60(平均30.9)岁，男42例，女46例.
1.2 方法 用QIAgen公司的基因组DNA提取试剂盒，自200μL全血中分离DNA，其中非抗凝血蛋白酶消化时间延长到45min. 以上述DNA作模板进行PCR扩增，引物设计、PCR条件参考文献[21-23]. PCR产物12μL用AvaⅡ 2U酶切1.5h～2.5h，用25g·L-1琼脂糖胶和0.5×TBE，100V电泳30min.
, 百拇医药
统计学处理 采用行列表χ2检验，检测健康人和丙型肝炎患者SNP是否有差别.
2 结果
LDL-R第13外显子PCR产物长度为219bp，野生型等位基因不被酶切，突变型等位基因由于形成AvaⅡ位点，产生136bp和83bp两条带. 电泳结果显示，纯合野生型仅219bp一条带，杂合型出现219, 136, 83三条带，纯合野生型136bp和83bp两条带(图1). 突变型等位基因频率为223%，其中丙型肝炎组23.7%，健康人对照组为21.0%,P>0.75，两组之间无差别(表1).
表1 13外显子的基因型构成
, 百拇医药
P>0.75，χ2=0.373.
图1 限制性内切酶酶切和电泳.
1，2，4，6：纯和野生型； 3，7：杂合型； 5：纯和突变型
3 讨论
血液中的HCV很少单独存在，而是与LDL和(或)VLDL结合在一起[12,15]，从而使HCV和其他黄病毒科病毒一样，能够由LDL-R介导进入肝细胞[14,24]，进而在细胞中复制. 这不仅导致了HCV在血清中持续存在，而且可能使HCV免受中和抗体的中和[25]，同时抑制或延迟中和抗体的产生，对HCV疫苗的研制也构成了挑战[26，27]. 由于HCV感染尚无特异性有效防治手段[28，29]，如能籍此阻断病毒附着和进入细胞，有可能成为防止HCV感染的有效途径.
, 百拇医药
人LDL-R由839个氨基酸组成，分为胞外区、跨膜区和胞内区，与胆固醇代谢关系密切，其基因异常可直接导致家族性高脂血症，所以有关LDL-R的基因多态性和基因突变研究很多. LDL-R已经确定为HCV的受体，其基因多态性和基因突变很可能与HCV的感染、发病和预后有密切关系，正象HIV协同受体基因多态性对HIV感染合AIDS发病有重要影响一样[30]. 丙型肝炎患者预后不同，可表现为急性自限性、慢性化并向肝硬变和肝细胞癌发展，这些结果是否与LDL-R有关值得研究. 我们选择已知的SNP位点，逐个调查丙型肝炎患者与健康人的差别，希望从中找出一些线索. 第1个位点，第13外显子的AvaⅡ位点，调查健康人和HC V患者各80例左右，未发现两者之间有差别. 我们将继续调查其他位点，以便为HCV的防治提供依据.
4 参考文献
1 Di Bisceglie AM. Hepatitis C—virology and future antiviral targets. Am J Med, 1999;107:45S-48S
, 百拇医药
2 颜学兵, 吴文漪, 魏来. 不同基因型丙型肝炎病毒感染临床研究. 华人消化杂志, 1998;6:653-655
3 王平忠, 周永兴. 西安地区丙型肝炎病毒基因分型研究. 世界华人消化杂志, 1999;7:757-759
4 宋志强, 郝飞, 王永刚, 闵峰, 王宇明. 丙型肝炎病毒HVR1抗血清体外阻断HCV的感染. 世界华人消化杂志， 2000;8:171-174
5 于建国, 张光曙, 杨德利, 周秀梅, 陈崇兴. 慢性丙型肝炎病理学的探讨. 新消化病学杂志, 1996;4(特刊5):41-42
6 陈士葆. 慢性丙型肝炎诊断和治疗现状. 新消化病学杂志, 1997;5:725-726
7 Cerny A, Chisari FV. Pathogenesis of chronic hepatitis C: immunological features of hepatic injury and viral
, 百拇医药
persistence. Hepatology, 1999;30:595-601
8 陈士葆. 丙型肝炎病毒感染与原发性肝癌. 新消化病学杂志， 1994;2:239-240
9 Flint M, McKeating JA. The role of the hepatitis C virus glycoproteins in infection. Rev Med Virol, 2000;10:101-117
10 Agnello V. Hepatitis C virus infection and type Ⅱ cryoglobulinemia: an immunological perspective. Hepatology,
1997;26:1375-1379
, 百拇医药
11 Agnello V, Abel G. Localization of hepatitis C virus in cutaneous vasculitic lesions in patients with type Ⅱ cryoglobulinemia.
Arthritis Rheum, 1997;40:2007-2015
12 Marson P, Boschetto R, De Silvestro G, Martini S, Gabelli C, Buoro S, Giordano R, Palu G. Changes in HCV viremia following
LDL apheresis in a HCV positive patient with familial hypercholesterolemia. Int J Artif Organs, 1999;22:640-644
, http://www.100md.com
13 Monazahian M, Bohme I, Bonk S, Koch A, Scholz C, Grethe S, Thomssen R. Low density lipoprotein receptor as a candidate
receptor for hepatitis C virus. J Med Virol, 1999;57:223-229
14 Agnello V, Abel G, Elfahal M, Knight GB, Zhang QX. Hepatitis C virus and other flaviviridae viruses enter cells via low density
lipoprotein receptor. Proc Natl Acad Sci USA, 1999;96:12766-12771
, http://www.100md.com
15 Prince AM, Huima-Byron T, Parker TS, Levine DM. Visualization of hepatitis C virions and putative defective interfering particles
isolated from low-density lipoproteins. J Viral Hepatol， 1996;3:11-17
16 康晓南，朱元慧. 低密度脂蛋白受体基因与家族性高胆固醇血症. 国外医学·遗传学分册， 1997;20:90-94
17 Cai HJ, Fan YM, Sun YM, Chen Q. LDL receptor research in China. Zhonghua Yixue Zazhi， 1995;108：177-182
, 百拇医药
18 Emi Y, Hirayama T, Wu LL, Hopkins PN, Williams RR, Emi M. Molecular genetic diagnosis of a family with hypercholesterolemia by
a mismatched PCR-RFLP method for genotyping single base substitution of the LDL receptor gene.
Jpn Heart J, 1998;39:681-687
19 周天鸿，李月琴，刘飞鹏，海戎，朱嘉明. LDL受体基因内含子15结构分析及其在家族性高胆固醇血症基因诊断中的应用.
遗传学报， 1999;26：1-7
, 百拇医药
20 Joan CV, Carles AV, Josep R, Francisco PJ, Lluis M. Exon 4, and in particular codon 152 of the LDL receptor gene, is a hot spot
for point mutations. Atherosclerosis, 1998;140:191-192
21 Kim HS, Bae JH, Chae JJ, Kim UK, Choe SJ, Koong YN, Kim HS, Park YB, Lee CC. Long distance PCR-based screening for
large rearrangement of the LDL receptor gene in Korean patients with familial hypercholesterolemia.
, 百拇医药
Clinic Chem, 1999;45:1424-1430
22 Leitersdorf E, Tobin EJ, Davignon J, Hobbs HH. Common low-density lipoprotein receptor mutations in the French
Canadian population. J Clin Invest, 1990;85:1014-1023
23 Leren TP, Solberg K, Rodningen OK, Ose L, Tonstad S, Berg K. Evaluation of running conditions for SSCP analysis: application of
SSCP for detection of point mutations in the LDL receptor gene. PCR Meth Applications,1993;3:159-162
, http://www.100md.com
24 Seipp S, Mueller HM, Pfaff E, Stremmel W, Theilmann L, Goeser T. Establishment of persistent hepatitis C virus infection
and replication in vitro. J Gen Virol, 1997;78(Pt 10):2467-2476
25 Rosa D, Campagnoli S, Moretto C, Guenzi E, Cousens L, Chin M, Dong C, Weiner AJ, Lau JY, Choo QL, Chien D, Pileri P, Houghton
M, Abrignani S. A quantitative test to estimate neutralizing antibodies to the hepatitis C virus: cytofluorimetric assessment
, 百拇医药
of envelope glycoprotein 2 binding to target cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1996;93:1759-1763
26 闵峰, 郝飞. 丙型肝炎病毒包膜糖蛋白与保护性免疫. 世界华人消化杂志, 1999;7:1065-1067
27 Gao JE, Tao QM, Guo JP, Ji HP, Lang ZW, Ji Y, Feng BF. Preparation and application of monoclonal antibodies against hepatitis C
virus nonstructural proteins. China Natl J New Gastroenterol, 1997;3:114-116
, 百拇医药
28 周永兴, 冯志华, 贾战生, 连建奇, 李谨革, 李文波. 丙型肝炎病毒核心基因免疫研究. 华人消化杂志, 1998;6:966-968
29 贾战生, 周永兴, 连建奇, 冯志华, 李光玉, 张文彬. 抗丙型肝炎病毒锤头结构核酶的计算机设计. 世界华人消化杂志,1999;7:300-302
30 Voevodin A, Samilchuk E, Dashti S. A survey for 32 nucleotide deletion in the CCR5 chemokine gene (ΔCCR5) conferring
resistance to human immunodeficiency virus type 1 in different ethnic groups and in chimpanzees.
J Med Virol, 1998;55:147-151, 百拇医药(刘明旭 王福生 金 磊 雷周云 施 红 刑利和)
项目负责人 王福生 中国人民解放军302医院 传染病研究所 生物工程研究室 北京市 100039
Email. fswang@public.bta.net.cn
收稿日期 2000-10-10 接受日期 2000-10-12
主题词 肝炎病毒，丙型；低密度脂蛋白受体；突变；胆固醇；基因表达；基因频率
刘明旭, 王福生, 金磊, 雷周云, 施红, 刑利和. 丙型肝炎患者LDL-R等位基因的多态性. 世界华人消化杂志，2001；9(2)：217-218
, http://www.100md.com
丙型肝炎病毒(HCV)感染呈全球分布[1]，而我国是丙型肝炎的高发区[2-4]. HCV感染者80%发展成为慢性肝炎[5-7]，而且发生肝硬变和肝细胞癌的危险性显著提高[8,9]. 最近证实低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor, LDL-R)可以识别和内化与低密度脂蛋白或极低密度脂蛋白结合的HCV[10-12]，从而确定LDL-R为HCV受体[13-15]. LDL-R主要分布于肝实质细胞，能够结合并内化低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)和极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)，利用其中的胆固醇，从而参与胆固醇代谢，并调节血液胆固醇水平[16,17]. LDL-R的基因突变和单碱基多态性(single nucloetide polyphorism, SNP)种类比较多，多数与脂代谢异常有关[18-20]. LDL-R基因突变和(或)SNP是否与HCV有关，目前国内外尚未见报道，因此是一个值得探讨的问题. 人LDL-R由839个氨基酸组成，其胞外区分为配体结合区、EGF前体同源区和糖基化区. 其中配体结合区含7个比较保守的重复序列，有6个半胱氨酸3形成个二硫键，以维持每个结构域的高级结构；C端含有SDE三连体，带有负电荷，从而与其配体apoB/apoE相结合[16,21]. 我们选择LDL-R第13外显子的AvaⅡSNP位点，调查其基因频率与HCV感染的关系，现将结果报道如下.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 选择HCV-RNA或(和)HCV抗体阳性，确诊为丙型肝炎的患者76例，年龄6～81(平均43.9)岁，男49例，女27例，采集其非抗凝血. 本院工作人员中HBV和HCV病毒指标和抗体全部阴性者抗凝血样88份，年龄17～60(平均30.9)岁，男42例，女46例.
1.2 方法 用QIAgen公司的基因组DNA提取试剂盒，自200μL全血中分离DNA，其中非抗凝血蛋白酶消化时间延长到45min. 以上述DNA作模板进行PCR扩增，引物设计、PCR条件参考文献[21-23]. PCR产物12μL用AvaⅡ 2U酶切1.5h～2.5h，用25g·L-1琼脂糖胶和0.5×TBE，100V电泳30min.
, 百拇医药
统计学处理 采用行列表χ2检验，检测健康人和丙型肝炎患者SNP是否有差别.
2 结果
LDL-R第13外显子PCR产物长度为219bp，野生型等位基因不被酶切，突变型等位基因由于形成AvaⅡ位点，产生136bp和83bp两条带. 电泳结果显示，纯合野生型仅219bp一条带，杂合型出现219, 136, 83三条带，纯合野生型136bp和83bp两条带(图1). 突变型等位基因频率为223%，其中丙型肝炎组23.7%，健康人对照组为21.0%,P>0.75，两组之间无差别(表1).
表1 13外显子的基因型构成
| 分组 | wt/wt | wt/mt | mt/mt | 突变基因频率(%) |
| 健康人 | 54 | 31 | 3 | 21.0 |
| 丙肝患者 | 43 | 30 | 3 | 23.7 |
| 合计 | 97 | 61 | 6 | 22.3 |
, 百拇医药
P>0.75，χ2=0.373.
图1 限制性内切酶酶切和电泳.
1，2，4，6：纯和野生型； 3，7：杂合型； 5：纯和突变型
3 讨论
血液中的HCV很少单独存在，而是与LDL和(或)VLDL结合在一起[12,15]，从而使HCV和其他黄病毒科病毒一样，能够由LDL-R介导进入肝细胞[14,24]，进而在细胞中复制. 这不仅导致了HCV在血清中持续存在，而且可能使HCV免受中和抗体的中和[25]，同时抑制或延迟中和抗体的产生，对HCV疫苗的研制也构成了挑战[26，27]. 由于HCV感染尚无特异性有效防治手段[28，29]，如能籍此阻断病毒附着和进入细胞，有可能成为防止HCV感染的有效途径.
, 百拇医药
人LDL-R由839个氨基酸组成，分为胞外区、跨膜区和胞内区，与胆固醇代谢关系密切，其基因异常可直接导致家族性高脂血症，所以有关LDL-R的基因多态性和基因突变研究很多. LDL-R已经确定为HCV的受体，其基因多态性和基因突变很可能与HCV的感染、发病和预后有密切关系，正象HIV协同受体基因多态性对HIV感染合AIDS发病有重要影响一样[30]. 丙型肝炎患者预后不同，可表现为急性自限性、慢性化并向肝硬变和肝细胞癌发展，这些结果是否与LDL-R有关值得研究. 我们选择已知的SNP位点，逐个调查丙型肝炎患者与健康人的差别，希望从中找出一些线索. 第1个位点，第13外显子的AvaⅡ位点，调查健康人和HC V患者各80例左右，未发现两者之间有差别. 我们将继续调查其他位点，以便为HCV的防治提供依据.
4 参考文献
1 Di Bisceglie AM. Hepatitis C—virology and future antiviral targets. Am J Med, 1999;107:45S-48S
, 百拇医药
2 颜学兵, 吴文漪, 魏来. 不同基因型丙型肝炎病毒感染临床研究. 华人消化杂志, 1998;6:653-655
3 王平忠, 周永兴. 西安地区丙型肝炎病毒基因分型研究. 世界华人消化杂志, 1999;7:757-759
4 宋志强, 郝飞, 王永刚, 闵峰, 王宇明. 丙型肝炎病毒HVR1抗血清体外阻断HCV的感染. 世界华人消化杂志， 2000;8:171-174
5 于建国, 张光曙, 杨德利, 周秀梅, 陈崇兴. 慢性丙型肝炎病理学的探讨. 新消化病学杂志, 1996;4(特刊5):41-42
6 陈士葆. 慢性丙型肝炎诊断和治疗现状. 新消化病学杂志, 1997;5:725-726
7 Cerny A, Chisari FV. Pathogenesis of chronic hepatitis C: immunological features of hepatic injury and viral
, 百拇医药
persistence. Hepatology, 1999;30:595-601
8 陈士葆. 丙型肝炎病毒感染与原发性肝癌. 新消化病学杂志， 1994;2:239-240
9 Flint M, McKeating JA. The role of the hepatitis C virus glycoproteins in infection. Rev Med Virol, 2000;10:101-117
10 Agnello V. Hepatitis C virus infection and type Ⅱ cryoglobulinemia: an immunological perspective. Hepatology,
1997;26:1375-1379
, 百拇医药
11 Agnello V, Abel G. Localization of hepatitis C virus in cutaneous vasculitic lesions in patients with type Ⅱ cryoglobulinemia.
Arthritis Rheum, 1997;40:2007-2015
12 Marson P, Boschetto R, De Silvestro G, Martini S, Gabelli C, Buoro S, Giordano R, Palu G. Changes in HCV viremia following
LDL apheresis in a HCV positive patient with familial hypercholesterolemia. Int J Artif Organs, 1999;22:640-644
, http://www.100md.com
13 Monazahian M, Bohme I, Bonk S, Koch A, Scholz C, Grethe S, Thomssen R. Low density lipoprotein receptor as a candidate
receptor for hepatitis C virus. J Med Virol, 1999;57:223-229
14 Agnello V, Abel G, Elfahal M, Knight GB, Zhang QX. Hepatitis C virus and other flaviviridae viruses enter cells via low density
lipoprotein receptor. Proc Natl Acad Sci USA, 1999;96:12766-12771
, http://www.100md.com
15 Prince AM, Huima-Byron T, Parker TS, Levine DM. Visualization of hepatitis C virions and putative defective interfering particles
isolated from low-density lipoproteins. J Viral Hepatol， 1996;3:11-17
16 康晓南，朱元慧. 低密度脂蛋白受体基因与家族性高胆固醇血症. 国外医学·遗传学分册， 1997;20:90-94
17 Cai HJ, Fan YM, Sun YM, Chen Q. LDL receptor research in China. Zhonghua Yixue Zazhi， 1995;108：177-182
, 百拇医药
18 Emi Y, Hirayama T, Wu LL, Hopkins PN, Williams RR, Emi M. Molecular genetic diagnosis of a family with hypercholesterolemia by
a mismatched PCR-RFLP method for genotyping single base substitution of the LDL receptor gene.
Jpn Heart J, 1998;39:681-687
19 周天鸿，李月琴，刘飞鹏，海戎，朱嘉明. LDL受体基因内含子15结构分析及其在家族性高胆固醇血症基因诊断中的应用.
遗传学报， 1999;26：1-7
, 百拇医药
20 Joan CV, Carles AV, Josep R, Francisco PJ, Lluis M. Exon 4, and in particular codon 152 of the LDL receptor gene, is a hot spot
for point mutations. Atherosclerosis, 1998;140:191-192
21 Kim HS, Bae JH, Chae JJ, Kim UK, Choe SJ, Koong YN, Kim HS, Park YB, Lee CC. Long distance PCR-based screening for
large rearrangement of the LDL receptor gene in Korean patients with familial hypercholesterolemia.
, 百拇医药
Clinic Chem, 1999;45:1424-1430
22 Leitersdorf E, Tobin EJ, Davignon J, Hobbs HH. Common low-density lipoprotein receptor mutations in the French
Canadian population. J Clin Invest, 1990;85:1014-1023
23 Leren TP, Solberg K, Rodningen OK, Ose L, Tonstad S, Berg K. Evaluation of running conditions for SSCP analysis: application of
SSCP for detection of point mutations in the LDL receptor gene. PCR Meth Applications,1993;3:159-162
, http://www.100md.com
24 Seipp S, Mueller HM, Pfaff E, Stremmel W, Theilmann L, Goeser T. Establishment of persistent hepatitis C virus infection
and replication in vitro. J Gen Virol, 1997;78(Pt 10):2467-2476
25 Rosa D, Campagnoli S, Moretto C, Guenzi E, Cousens L, Chin M, Dong C, Weiner AJ, Lau JY, Choo QL, Chien D, Pileri P, Houghton
M, Abrignani S. A quantitative test to estimate neutralizing antibodies to the hepatitis C virus: cytofluorimetric assessment
, 百拇医药
of envelope glycoprotein 2 binding to target cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1996;93:1759-1763
26 闵峰, 郝飞. 丙型肝炎病毒包膜糖蛋白与保护性免疫. 世界华人消化杂志, 1999;7:1065-1067
27 Gao JE, Tao QM, Guo JP, Ji HP, Lang ZW, Ji Y, Feng BF. Preparation and application of monoclonal antibodies against hepatitis C
virus nonstructural proteins. China Natl J New Gastroenterol, 1997;3:114-116
, 百拇医药
28 周永兴, 冯志华, 贾战生, 连建奇, 李谨革, 李文波. 丙型肝炎病毒核心基因免疫研究. 华人消化杂志, 1998;6:966-968
29 贾战生, 周永兴, 连建奇, 冯志华, 李光玉, 张文彬. 抗丙型肝炎病毒锤头结构核酶的计算机设计. 世界华人消化杂志,1999;7:300-302
30 Voevodin A, Samilchuk E, Dashti S. A survey for 32 nucleotide deletion in the CCR5 chemokine gene (ΔCCR5) conferring
resistance to human immunodeficiency virus type 1 in different ethnic groups and in chimpanzees.
J Med Virol, 1998;55:147-151, 百拇医药(刘明旭 王福生 金 磊 雷周云 施 红 刑利和)