大肠癌化疗药物敏感性与癌细胞DNA含量的关系
华西医科大学附属第一医院 1普外科 2肿瘤生物治疗中心 四川省成都市 610041
项目负责人 胡建昆华西医科大学附属第一医院普外科 四川省成都市 610041
收稿日期 2001-02-06 接受日期 2001-02-12
主题词 结肠直肠肿瘤/药物疗法；结肠直肠肿瘤/病理学；抗药性，肿瘤；DNA，肿瘤/分析；抗肿瘤药
胡建昆, 陈志新, 陈佳平, 严律南, 毛咏秋, 邹立群, 王朝华. 大肠癌化疗药物敏感性与癌细胞DNA含量的关系.
世界华人消化杂志，2001；9(6)：713-714
, http://www.100md.com
大肠癌常见，不能手术者常做化疗，但其对化疗药物敏感性个体差异大，仅凭经验用药常不能取得满意的效果[1,2]. 体外测定人大肠癌细胞的化疗敏感性是指导肿瘤化疗的基础，近年来，微量细胞培养——四氮法(Tetrazolium salt,简称MTT法)已开始应用于实体癌的药物敏感性检测[3-7]. 我院1997-01/1997-12对162例新鲜人大肠癌组织用MTT法进行化疗药物敏感性测定，以指导临床化疗.
1 材料和方法
1.1 材料 全部标本取自我科1997-01/1997-12手术切除的新鲜大肠癌标本，均经病理证实. 所有患者术前均未接受抗癌药物. 其中男106例，女56例；直肠癌108例，结肠癌54例；年龄21岁～84岁，平均55岁±14岁. 在无菌条件下自肿瘤生长良好处取0.5g～1.0g组织，放入含青链霉素的D-Hanks液中，常规采用机械法制成单细胞悬液. 将104·L-1细胞悬液加入24孔培养板中，每孔0.2mL，于各孔中分别加入0.01mL不同抗癌药后，置37℃，50mL·L-1 CO2温箱中培养24h.
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1.2 方法 采用MTT法检测， 每孔中加入MTT液0.01mL,继续培养4h后去上清，使用流式细胞仪检测癌细胞凋亡率，同时检测癌细胞DNA含量. 选取5种常用的大肠癌化疗药物进行，分别为5-FU、顺氯氨铂(DDP)、阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC)及环磷酰胺(CTX). 试验所用药物浓度为2倍血药浓度(Cmax×2).
统计学处理 所有数据用均数±标准差表示，采用t检验进行分析.
2 结果
2.1 癌细胞凋亡率 检测5种药物大肠癌细胞凋亡率(%)分别为：5-FU 12±11(0～74), DDP 11±11(0～46), ADM 11±12(0～64), MMC 11±10(0～56)和CTX 12±11(0～62),经两两比较均无显著差异(P>0.05). 癌细胞凋亡率从大到小依次为：5-FU，CTX，DDP，MMC和ADM. 不同个体对药物敏感性不同，本组中17例患者至少有一种药物的癌细胞凋亡率>40%, 60例患者至少有一种药物的癌细胞凋亡率>20%,而<40%，20例患者所有药物的癌细胞凋亡率均<10%.
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2.2 癌细胞凋亡率与癌细胞DNA含量 同时检测101例标本大肠癌细胞DNA含量及药物敏感性，其中异倍体62例，二倍体39例(表1)，可知MMC, ADM二种药物对异倍体癌的癌细胞凋亡率大于二倍体癌(P<0.05).
表1 药物致癌细胞凋亡率与癌细胞DNA含量的关系(x±s,%)
, 百拇医药
aP<0.05 vs 二倍体癌.
2.3 癌细胞凋亡率与病理类型 在101例标本中，分化较好组(高-中分化腺癌)79例，分化不良组22例(表2). 仅ADM对低分化腺癌的癌细胞凋亡率大于分化较好组(P<0.05).
表2 药物致癌细胞凋亡率与病理类型的关系(x±s,%)
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aP<0.05 vs 分化较好组.
3 讨论
MTT法目前被广泛应用于体外人肿瘤细胞化疗敏感性测定，为临床化疗选择用药提供了实验依据[3-5]. 大肠癌细胞对药物敏感性个体差异大，凭临床经验选药与临床符合率较低，而经药物敏感性试验选药与临床符合率可达80%以上[8]. Pieters et al[9]对急性白血病患者进行长期临床观察，证实MTT法进行药物敏感性检测的准确性. 多药耐药(mutidrug resistance, MDR)的产生是大肠癌化疗失败的重要原因[1]，肿瘤细胞多药耐药的机制与mdrl(mutidrug resistance gene)基因的过度表达有关，该基因产物是Mr170000 P-糖蛋白(P-gp). 有研究表明P-gp阳性检出率与药物敏感性之间概率有显著性差异，与临床肿瘤耐药性呈正相关，而与肿瘤对化疗药物的敏感性呈负相关[2]. 我们对162例新鲜大肠癌手术切除标本进行药物敏感性检测，提示5种常用的化疗药物对癌细胞凋亡率无明显差异，但其癌细胞凋亡率从大到小依次为5-FU, CTX, DDP, MMC和ADM，显示5-FU, CTX和DDP对大肠癌较敏感.
, 百拇医药
正常体细胞DNA含量为二倍体，仅在细胞增殖分裂过程中有所改变，因此正常体细胞DNA含量相对稳定，DI=1±0.1范围，DNA含量分布集中在二倍体或近二倍体区域，单一的G0/G1峰. 恶性肿瘤细胞DNA含量的分布及倍体类型发生变化，癌前病变在癌变过程中常伴有异倍体的出现[10]. 目前流式细胞术检测DNA含量已较多应用于临床科研[11-14]. 徐亮et al[11]用流式细胞术对35例大肠癌DNA含量进行分析，提示正常大肠粘膜DNA含量为二倍体，癌组织DNA含量异倍体率为74%. DNA含量与Dukes分期无关. 朱武凌et al[15]分析35例青年大肠癌，在DNA水平上青年人大肠癌的非二倍体发生率及细胞增殖指数均显著高于老年大肠癌. 本文对癌细胞DNA含量与药物敏感性进行分析，MMC，ADM二种药物对异倍体癌的癌细胞凋亡率大于二倍体癌，其余3种药物则无此差异. 而将低分化型大肠癌与分化良好型的药物敏感性相比，仅有ADM对低分化型大肠癌较敏感(P<0.05)，其余4种药物则无差异. 与熊茂明et al[16]结果相似. 说明大肠癌对化疗药物的个体差异性，同时亦应对影响预后的异倍体癌、低分化型癌加强化疗药物敏感性测定，选用2～3种敏感的化疗药物，提供个体化治疗方案，以期改善大肠癌患者的预后.
, 百拇医药
4 参考文献
1 刘忠民, 寿楠海, 姜希宏. 多药耐药相关蛋白在大肠癌中的表达及其临床意义. 世界华人消化杂志, 1999;7:1000-1001
2 赵行远, 夏传生, 吴建平, 侯炜, 刘运芳. MDRI产物P-gp在结肠肿瘤中表达的意义. 世界华人消化杂志, 1999;7:991
3 Yamaue H, Tanimura H, Noguchi K, Hotta T, Tani M, Tsunoda T, Iwahashi M, Tamai M, Iwakura S. Chemosensitivity testing of
fresh human gastric cancer with highly purified tumour cells using the MTT assay. Br J Cancer, 1992;66:794-799
, 百拇医药
4 王少东, 张杏泉, 莫简, 王多宁, 樊代明. 二乙基二硫代氨基甲酸钠对耐长春新碱胃癌细胞的逆转作用. 世界华人消化杂志,1999;7:999-1000
5 陈飞松, 任蜀兵, 李春梅, 刘晋生, 郭培元, 危北海, 施波, 傅招娣, 雷小虹. 中药芪龙方抑制实验性胃肿瘤的作用.
世界华人消化杂志, 1999;7:898-899
6 项明, 林言箴, 朱上林, 纪玉宝. MTT比色法检测肝细胞再生刺激因子的生物活性. 新消化病学杂志, 1996;4:430-431
7 司维柯, 潘静, 陆华, 李招权. 苦参碱抑制HepG2细胞增殖及其剂量与抑制方式关系的研究. 世界华人消化杂志，2001；9：185-189
8 Goertter K, Bastert G, Pfleiderer A, Albrecht M, Kaufmann M, Kreienberg R, Neunhoeffer J, Geier G, Hohorst HJ, Segeth G,Drings P. In vitro short-term test to determine the resistance of human tumors to chemotherapy.
, 百拇医药
Cancer, 1981;48:2127-2135
9 Pieters R, Huismans DR, Loonen AH, Hhlen K, Van der Does-van den Berg A, Van Wering ER, Veerman AJP. Relation of cellular
drug resistance to long-term clinical outcome in childhood acute lymphoblastic leukaemia. Lancet, 1991;338:399-403
10 钱立平, 林庚金, 徐元鼎, 凌玉琴. 细胞核DNA含量检测在消化道疾病中的应用. 新消化病学杂志， 1994;2:40-42
11 徐亮, 卢光宇. 结直肠癌ras P21表达和DNA含量分析. 世界华人消化杂志, 1999;7:706-707
, 百拇医药
12 Peng ZH, Xing TH, Qiu GQ, Tang HM. Relationship between Fas/FasL expression and apoptosis of colon adenocarcinoma cell
lines. World J Gastroenterol, 2001;7:88-92
13 黄宗海, 钱伟峰, 迟德彪, 蒋泽生. HSVtk/GCV体外诱导人大肠癌LoVo细胞凋亡. 世界华人消化杂志，2001；9：194-197
14 杨建青, 杨连粤, 祝和成. 丝裂霉素诱导人肝癌细胞凋亡. 世界华人消化杂志，2001；9：268-272
15 朱武凌, 王正晓, 张祥宏, 王凤荣. 青年人大肠癌的临床与实验研究. 华人消化杂志, 1998;6(特刊7):378
16 熊茂明，权循凤，江积瑞，徐阿曼，金小干，彭程，张长乐，朱化刚. 用MTT法预测胃癌化疗药物敏感性试验研究.
安徽医科大学学报，1995;30：26-28, 百拇医药(胡建昆1 陈志新1 陈佳平1 严律南1 毛咏秋2 邹立群2 王朝华1 )
项目负责人 胡建昆华西医科大学附属第一医院普外科 四川省成都市 610041
收稿日期 2001-02-06 接受日期 2001-02-12
主题词 结肠直肠肿瘤/药物疗法；结肠直肠肿瘤/病理学；抗药性，肿瘤；DNA，肿瘤/分析；抗肿瘤药
胡建昆, 陈志新, 陈佳平, 严律南, 毛咏秋, 邹立群, 王朝华. 大肠癌化疗药物敏感性与癌细胞DNA含量的关系.
世界华人消化杂志，2001；9(6)：713-714
, http://www.100md.com
大肠癌常见，不能手术者常做化疗，但其对化疗药物敏感性个体差异大，仅凭经验用药常不能取得满意的效果[1,2]. 体外测定人大肠癌细胞的化疗敏感性是指导肿瘤化疗的基础，近年来，微量细胞培养——四氮法(Tetrazolium salt,简称MTT法)已开始应用于实体癌的药物敏感性检测[3-7]. 我院1997-01/1997-12对162例新鲜人大肠癌组织用MTT法进行化疗药物敏感性测定，以指导临床化疗.
1 材料和方法
1.1 材料 全部标本取自我科1997-01/1997-12手术切除的新鲜大肠癌标本，均经病理证实. 所有患者术前均未接受抗癌药物. 其中男106例，女56例；直肠癌108例，结肠癌54例；年龄21岁～84岁，平均55岁±14岁. 在无菌条件下自肿瘤生长良好处取0.5g～1.0g组织，放入含青链霉素的D-Hanks液中，常规采用机械法制成单细胞悬液. 将104·L-1细胞悬液加入24孔培养板中，每孔0.2mL，于各孔中分别加入0.01mL不同抗癌药后，置37℃，50mL·L-1 CO2温箱中培养24h.
, 百拇医药
1.2 方法 采用MTT法检测， 每孔中加入MTT液0.01mL,继续培养4h后去上清，使用流式细胞仪检测癌细胞凋亡率，同时检测癌细胞DNA含量. 选取5种常用的大肠癌化疗药物进行，分别为5-FU、顺氯氨铂(DDP)、阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC)及环磷酰胺(CTX). 试验所用药物浓度为2倍血药浓度(Cmax×2).
统计学处理 所有数据用均数±标准差表示，采用t检验进行分析.
2 结果
2.1 癌细胞凋亡率 检测5种药物大肠癌细胞凋亡率(%)分别为：5-FU 12±11(0～74), DDP 11±11(0～46), ADM 11±12(0～64), MMC 11±10(0～56)和CTX 12±11(0～62),经两两比较均无显著差异(P>0.05). 癌细胞凋亡率从大到小依次为：5-FU，CTX，DDP，MMC和ADM. 不同个体对药物敏感性不同，本组中17例患者至少有一种药物的癌细胞凋亡率>40%, 60例患者至少有一种药物的癌细胞凋亡率>20%,而<40%，20例患者所有药物的癌细胞凋亡率均<10%.
, http://www.100md.com
2.2 癌细胞凋亡率与癌细胞DNA含量 同时检测101例标本大肠癌细胞DNA含量及药物敏感性，其中异倍体62例，二倍体39例(表1)，可知MMC, ADM二种药物对异倍体癌的癌细胞凋亡率大于二倍体癌(P<0.05).
表1 药物致癌细胞凋亡率与癌细胞DNA含量的关系(x±s,%)
| 分组 | 5-FU | DDP | ADM | MMC | CTX |
| 异倍体癌 | 13±14 | 11±11 | 10±11a | 12±9a | 11±11 |
| 二倍体癌 | 12±7 | 9±7 | 5±8 | 9±6 | 10±8 |
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aP<0.05 vs 二倍体癌.
2.3 癌细胞凋亡率与病理类型 在101例标本中，分化较好组(高-中分化腺癌)79例，分化不良组22例(表2). 仅ADM对低分化腺癌的癌细胞凋亡率大于分化较好组(P<0.05).
表2 药物致癌细胞凋亡率与病理类型的关系(x±s,%)
| 分组 | 5-FU | DDP | ADM | MMC | CTX |
| 不良组 | 13±13 | 11±12 | 14±16a | 11±11 | 9±11 |
| 较好组 | 13±11 | 10±9 | 7±10 | 11±7 | 11±10 |
, 百拇医药
aP<0.05 vs 分化较好组.
3 讨论
MTT法目前被广泛应用于体外人肿瘤细胞化疗敏感性测定，为临床化疗选择用药提供了实验依据[3-5]. 大肠癌细胞对药物敏感性个体差异大，凭临床经验选药与临床符合率较低，而经药物敏感性试验选药与临床符合率可达80%以上[8]. Pieters et al[9]对急性白血病患者进行长期临床观察，证实MTT法进行药物敏感性检测的准确性. 多药耐药(mutidrug resistance, MDR)的产生是大肠癌化疗失败的重要原因[1]，肿瘤细胞多药耐药的机制与mdrl(mutidrug resistance gene)基因的过度表达有关，该基因产物是Mr170000 P-糖蛋白(P-gp). 有研究表明P-gp阳性检出率与药物敏感性之间概率有显著性差异，与临床肿瘤耐药性呈正相关，而与肿瘤对化疗药物的敏感性呈负相关[2]. 我们对162例新鲜大肠癌手术切除标本进行药物敏感性检测，提示5种常用的化疗药物对癌细胞凋亡率无明显差异，但其癌细胞凋亡率从大到小依次为5-FU, CTX, DDP, MMC和ADM，显示5-FU, CTX和DDP对大肠癌较敏感.
, 百拇医药
正常体细胞DNA含量为二倍体，仅在细胞增殖分裂过程中有所改变，因此正常体细胞DNA含量相对稳定，DI=1±0.1范围，DNA含量分布集中在二倍体或近二倍体区域，单一的G0/G1峰. 恶性肿瘤细胞DNA含量的分布及倍体类型发生变化，癌前病变在癌变过程中常伴有异倍体的出现[10]. 目前流式细胞术检测DNA含量已较多应用于临床科研[11-14]. 徐亮et al[11]用流式细胞术对35例大肠癌DNA含量进行分析，提示正常大肠粘膜DNA含量为二倍体，癌组织DNA含量异倍体率为74%. DNA含量与Dukes分期无关. 朱武凌et al[15]分析35例青年大肠癌，在DNA水平上青年人大肠癌的非二倍体发生率及细胞增殖指数均显著高于老年大肠癌. 本文对癌细胞DNA含量与药物敏感性进行分析，MMC，ADM二种药物对异倍体癌的癌细胞凋亡率大于二倍体癌，其余3种药物则无此差异. 而将低分化型大肠癌与分化良好型的药物敏感性相比，仅有ADM对低分化型大肠癌较敏感(P<0.05)，其余4种药物则无差异. 与熊茂明et al[16]结果相似. 说明大肠癌对化疗药物的个体差异性，同时亦应对影响预后的异倍体癌、低分化型癌加强化疗药物敏感性测定，选用2～3种敏感的化疗药物，提供个体化治疗方案，以期改善大肠癌患者的预后.
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4 参考文献
1 刘忠民, 寿楠海, 姜希宏. 多药耐药相关蛋白在大肠癌中的表达及其临床意义. 世界华人消化杂志, 1999;7:1000-1001
2 赵行远, 夏传生, 吴建平, 侯炜, 刘运芳. MDRI产物P-gp在结肠肿瘤中表达的意义. 世界华人消化杂志, 1999;7:991
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fresh human gastric cancer with highly purified tumour cells using the MTT assay. Br J Cancer, 1992;66:794-799
, 百拇医药
4 王少东, 张杏泉, 莫简, 王多宁, 樊代明. 二乙基二硫代氨基甲酸钠对耐长春新碱胃癌细胞的逆转作用. 世界华人消化杂志,1999;7:999-1000
5 陈飞松, 任蜀兵, 李春梅, 刘晋生, 郭培元, 危北海, 施波, 傅招娣, 雷小虹. 中药芪龙方抑制实验性胃肿瘤的作用.
世界华人消化杂志, 1999;7:898-899
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7 司维柯, 潘静, 陆华, 李招权. 苦参碱抑制HepG2细胞增殖及其剂量与抑制方式关系的研究. 世界华人消化杂志，2001；9：185-189
8 Goertter K, Bastert G, Pfleiderer A, Albrecht M, Kaufmann M, Kreienberg R, Neunhoeffer J, Geier G, Hohorst HJ, Segeth G,Drings P. In vitro short-term test to determine the resistance of human tumors to chemotherapy.
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9 Pieters R, Huismans DR, Loonen AH, Hhlen K, Van der Does-van den Berg A, Van Wering ER, Veerman AJP. Relation of cellular
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10 钱立平, 林庚金, 徐元鼎, 凌玉琴. 细胞核DNA含量检测在消化道疾病中的应用. 新消化病学杂志， 1994;2:40-42
11 徐亮, 卢光宇. 结直肠癌ras P21表达和DNA含量分析. 世界华人消化杂志, 1999;7:706-707
, 百拇医药
12 Peng ZH, Xing TH, Qiu GQ, Tang HM. Relationship between Fas/FasL expression and apoptosis of colon adenocarcinoma cell
lines. World J Gastroenterol, 2001;7:88-92
13 黄宗海, 钱伟峰, 迟德彪, 蒋泽生. HSVtk/GCV体外诱导人大肠癌LoVo细胞凋亡. 世界华人消化杂志，2001；9：194-197
14 杨建青, 杨连粤, 祝和成. 丝裂霉素诱导人肝癌细胞凋亡. 世界华人消化杂志，2001；9：268-272
15 朱武凌, 王正晓, 张祥宏, 王凤荣. 青年人大肠癌的临床与实验研究. 华人消化杂志, 1998;6(特刊7):378
16 熊茂明，权循凤，江积瑞，徐阿曼，金小干，彭程，张长乐，朱化刚. 用MTT法预测胃癌化疗药物敏感性试验研究.
安徽医科大学学报，1995;30：26-28, 百拇医药(胡建昆1 陈志新1 陈佳平1 严律南1 毛咏秋2 邹立群2 王朝华1 )