nm23-H1基因突变与大肠癌转移的相关性
1东南大学基础医学院病理学教研室 江苏省南京市 210009
2江苏省肿瘤研究所分子生物研究室 江苏省南京市 210008
3广西壮族自治区柳州铁路中心医院病理科 545007
广西壮族自治区科学研究与技术开发项目(桂科基0023024)，东南大学科研基金项目(XJ002665)
项目负责人 黄培林，210009，江苏省南京市丁家桥87号，东南大学基础医学院病理学教研室. E-mail: huang.peilin@163.net
收稿日期 2001-03-05 接受日期 2001-03-13
, http://www.100md.com
主题词 结肠直肠肿瘤/病理学；基因，抑制，肿瘤；突变；肿瘤转移
金月玲, 黄培林, 王亚平, 黄照权, 王建东, 孟明. nm23-H1基因突 变与大肠癌转移的相关性. 世界华人消化杂志，2001；9(8)：965-966
0 引言
侵袭和转移是恶性肿瘤的生物学特性之一，大肠癌致死的原因之一是癌细胞的转移[1 -3]，其转移的机制一直是分子生物学研究的热点[4-14]. 诸多证据表明，在恶性肿瘤转移的过程中有许多基因在不同层次上参与调控[15-17]. 这些基因就 其作用的性质可分为正向作用的转移基因和反向作用的抑制肿瘤转移基因，例如移动因子、 粘附因子或酶蛋白因子[9,18-22]. 目前已分离出的几个能抑制肿瘤转移的基因， 如：nm23基因、多种肿瘤抑制基因-I(multiple tumor suppressor gene I, MTSI), WDNM1，WDNM2，以nm23基因研究较多[8,23-25]. 为了进一步探讨nm23-H1基因突变在大肠肿瘤演进中的作用. 我们应用PCR-SSCP-银染法检测nm23基因在大肠 癌组织中的改变，结合肿瘤的临床、病理资料综合分析，探究nm23基因突变与大肠癌转移相关性.
, 百拇医药
1 材料和方法1.1 材料 江苏省肿瘤研究所惠赠中国人大肠癌组织标本63例，均经病理学明确诊断，其中20例有淋巴结转移，病理分型：高分化腺癌为3例，中分化腺癌56例，低分化腺癌4例.
1.2 方法 新鲜癌组织的DNA提取按酚-氯仿-异戊醇常规方法并略作改良：将癌组织剪碎，加入TE缓冲 液研磨后加入100g·L-1 SDS，蛋白酶K(10g·L-1)消化. 55℃水浴1h后加等量饱和酚、等量酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)、等量氯仿-异戊 醇(24∶1)抽提3次除去蛋白. 取上清，加1/10体积30g·L-1醋酸钠，2.5倍体积冷乙醇使DNA沉淀，再经700mL·L-1冷乙醇洗1次，去上清倒置控干后加TE溶解保存. 设计合成4对引物对应于nm23-H1基因第2～5位外显 子(第一位外显子未编码氨基酸).
, http://www.100md.com
引物25′-TGTTTCATTCCTCTACCTGC-3′
5′-GTTCTCCTATACTATGAAGG-3′171
35′-GTTATTCTCATTCTCTGTCC-3′
5′-CATACTTGGAGTATCCCAC-3′ 128
45′-GACCATATCTTCTTCTGTCC-3′
5′-CCTTGTGGCAACTAAATCAG-3′ 154
55′-GTCTTGGTCATGTGACTATC-3′
5′-GTGAAAAGCAATGTGGTCTG-3′ 141
, 百拇医药
PCR扩增的条件：95℃变性5min；94℃ 45s, 52℃～53℃ 45s；72℃ 60s，32个循环周期. 72℃延伸5min. PCR产物10μL加入上样缓冲液(含950g·L- 1甲酰胺)10μL 95℃变性5min，立即置于冰上. 反应液8μL行100g·L-1聚丙烯酰胺凝胶电泳(丙烯酰胺∶亚甲基双丙烯酰胺=49∶1). 电泳条件：电泳缓冲液0.5×TBE ，电压70V，4℃环境下过夜电泳. 银染分析：取出凝 胶，100mL·L-1乙醇固定，10g·L-1硝酸酸化，2g·L- 1硝酸银染色后30g·L-1 Na2CO3显色至条带清晰，背景均匀后100mL·L-1乙酸中止反应. 将nm23基因第5外显子扩增300μL，取上游引物(上海生物工程公司合成)10μL，浓度为50pmol·L-1封好 ，用四色荧光法标记四种脱氧核苷酸，按Sanger双脱氧终止法进行测序，上机电泳，计算机处理测序结果并进行分析.
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2 结果我们用nm23基因第2～5位外显子引物对63例大肠癌组织标本(其中20例有淋巴结转移， 病理分型高分化为3例，中分化腺癌为56例，低分化腺癌为4例)进行PCR-SSCP的检测，经 反复筛选，重复操作. 结果显示，63例标本nm23-H1基因第2～4外显子呈现2条带型(图1)；第5外显子大部分呈现2条带型，部分标本呈现4条带型(图1)，然后对4条带DNA带型的标本进行DNA测序，显示nm23-H1基因第5外显子序列存在多态性，第360位 碱基存在T→C置换，密码子由AGT→AGC，但编码氨基酸不变(丝氨酸)，为同义突变.
图1大肠癌组织nm23基因第5外显子PCR-SSCP电泳分析.
N：nm23基因5外显子(2条带型)；
A：nm23基因5外显子(4条带型)
, http://www.100md.com
3 讨论nm23基因是一种重要的肿瘤转移抑制基因. nm23-H1基因cDNA全长534bp，编码 152个氨基酸. 其中两个同源的基因nm23-H1基因与nm23-H2基因均位于17q22，分别编码Mr18000和17000的蛋白质，产物为催化核苷二磷 酸与核苷三磷酸互变的二磷酸核苷激酶(necleoside diphosphate kinase, NDPK), nm23-H1和nm23-H2基因分别编码NDPK的A亚基和B亚基. 人类基因结构发生异常或表达失控，会导致细胞生长和分化的异常，进而形成肿瘤，并可获 得恶性的生物学行为. 应用PCR-SSCP分析DNA扩增片段时，只要发生了带型的改变，包括单 链条带的增加、减少或泳动速率的改变，都可判断存在由DNA序列的突变. 目前，此技术已 应用于已知突变热点上的检测，筛选未知突变及分析癌基因、抗癌基因等的突变. 异源双链 体形成和SSCP分析相比较，后者更为敏感. PCR-SSCP法为一项较为敏感的检测点突变及小 片段缺失的方法，该方法用于检测150bp～300bp的DNA片段较为适宜，对于小于200bp的DNA 片段，其检出率可达90%[26,27]. 本实验中nm23-H1基因4个外显子的PCR扩增产物长度均小于200bp，故而SSCP技术适合nm23-H1基因的突变分析. 本研究结果提示，nm23基因突变在肠癌发生转移的过程中不占主导地位，肠癌转移的发生可能与其他基因相关，或者与nm23基因调控部位的甲基化有关，值得进一步探讨.
, 百拇医药
4 参考文献1 谷化平, 倪灿荣, 詹熔洲. 大肠癌CD15, CD44v6和nm23H1的mRNA表达与 转移及预后的相关性. 世界华人消化杂志，2000;8:887-891
2 王志伟, 陈瑞新, 周广军, 沈洪薰, 陈玉泉. 大肠癌患者外周血CK20 mRNA的表达. 世界华人消化杂志，2000;8:818-820
3 范如英,李世荣,吴霞,武子涛,晨智敏,邓永江,曹建彪,张红光. 大肠癌患者粪 脱落细胞P53的表达. 世界华人消化杂志，2000;8:814-815
4 张振书, 张亚历. 中国大肠癌研究进展. 世界华人消化杂志，2001;9:489-494
5 范应方, 黄宗海. 结直肠癌基因治疗研究进展. 世界华人消化杂志，2001;9:427-430
, 百拇医药
6 许昌泰, 闫小君. p53抗癌基因和消化系肿瘤. 世界华人消化杂志, 1999;7:77-79
7 李铭, 王灏, 郁宝铭, 郑民华. P53基因突变和肿瘤标志物对大肠癌患者预后的影响. 世界华人消化杂志, 1999;7:425-426
8 蒋会勇, 卿三华. 大肠癌淋巴结转移相关因素研究现况. 世界华人消化杂志, 1999;7:982-984
9 徐亮, 卢光宇. 结直肠癌ras P21表达和DNA含量分析. 世界华人消化杂志, 1999;7:706-707
10 Wu BP, Zhang YL, Zhou DY, Gao CF, Lai ZS. Microsatellite instability, MMR gene expression and proliferation kinetics in colorectal
, 百拇医药
cancer with famillial predisposition. World J Gastroenterol, 2000;6:902-905
11 应月强, 周氵光, 吴佩, 黄文斌. 大肠癌组织TGF-α和TGF-β 1的表达意义. 世界华人消化杂志，2001;9:223-225
12 蔡崎, 陆洪芬, 孙孟红, 杜祥, 范月珍, 施达仁. 结直肠癌组织中CD44v3, v6蛋白的表达意义. 世界华人消化杂志，2000;8:1255-1258
13 庄小强, 赖日权, 孙桂华, 王晓怀, 袁世珍. 大肠癌P53蛋白与PCNA表达的预后 意义. 世界华人消化杂志, 1999;7:616
14 杨家辉, 饶本强, 王瑶, 涂小煌, 张连阳, 陈少华, 欧阳学农, 戴西湖. 大肠癌患者外周血循环癌细胞检测的临床意义.
, 百拇医药
世界华人消化杂志， 2000;8:187-189
15 刘变英, 崔大祥, 潘胜武, 闫小君, 雷宇锋, 栗彤. 大肠癌及癌旁组织中P73基因的表达. 世界华人消化杂志，2001;9:229-230
16 刘江伟, 李开宗. 胰腺癌与癌基因及抑癌基因. 世界华人消化杂志，2001;9:72-73
17 潘胜武, 孙安乐, 刘变英, 崔大祥, 闫小君, 栗彤, 雷宇锋, 王胜. 大肠癌相关基因表达的早期诊断意义.
世界华人消化杂志，2000;8:1431-1432
18 谷化平, 尚培中, 苏红, 李志钢. 食管癌组织CD15抗原和组织蛋白酶D表达的关系. 世界华人消化杂志， 2000;8:259-261
, 百拇医药
19 赵敏芳,毛华,郑景熙,袁亚维. 血管内皮细胞生长因子对大肠癌HT-29细胞粘附作用的影响. 世界华人消化杂志，2000;8:646-649
20 刘灏,吴金生,李立宏,要秀. 大肠癌的血管生成与血小板源生长因子的表达研究. 世界华人消化杂志，2000;8:661-664
21 许沈华, 冯建国, 李德川, 牟瀚舟, 楼荣灿. 大肠癌患者外周血CD44水平与临床病理的相关性研究. 世界华人消化杂志，2000;8:432-435
22 陈治, 王晓莉, 张莉, 黄宗海, 潘玉先, 曹长安. 血管内皮生长因子及其受体在人大肠癌组织中的分布、定量和意义.
世界华人消化杂志，2000;8:472-473
23 秦环龙, 林擎天. p53，nm23-H1和CEA表达与大肠癌术后肝脏转移和局部复发的关系. 世界华人消化杂志，2000;8:589-590
, 百拇医药
24 申兴斌, 张旭晨, 梅立新, 赵晓明, 胡建功. 大肠癌组织nm23/NDPK及p53表达的意义. 世界华人消化杂志, 1999;7:809-810
25 张明, 倪灿荣, 戴益民, 范淼, 陈晓东, 张松平. HCC中nm23H1mRNA、蛋白产物的表达与预后指标的相关性研究.
世界华人消化杂志, 1999;7:342
26 Cohn KH, Ornstein DL, Wang FS, LaPaix FD, Phipps K, Edelsberg C, Zuna R, Mott LA, Dunn JL. The significance of allelic deletions
and aneuploidy in colorectal carcinoma: results of a 5-year follow-up study. Cancer, 1997;79:233-244
27 Berney CR, Yang JL, Fisher RJ, Russell PJ, Crowe PJ. Overexpression of nm23 protein assessed by color video image analysis in
metastatic colorectal cancer: correlation with reduced patient survival. World J Surg, 1998;22:484-490, http://www.100md.com(金月玲1 黄培林1 王亚平2 黄照权3 王建东2 孟明1)
2江苏省肿瘤研究所分子生物研究室 江苏省南京市 210008
3广西壮族自治区柳州铁路中心医院病理科 545007
广西壮族自治区科学研究与技术开发项目(桂科基0023024)，东南大学科研基金项目(XJ002665)
项目负责人 黄培林，210009，江苏省南京市丁家桥87号，东南大学基础医学院病理学教研室. E-mail: huang.peilin@163.net
收稿日期 2001-03-05 接受日期 2001-03-13
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主题词 结肠直肠肿瘤/病理学；基因，抑制，肿瘤；突变；肿瘤转移
金月玲, 黄培林, 王亚平, 黄照权, 王建东, 孟明. nm23-H1基因突 变与大肠癌转移的相关性. 世界华人消化杂志，2001；9(8)：965-966
0 引言
侵袭和转移是恶性肿瘤的生物学特性之一，大肠癌致死的原因之一是癌细胞的转移[1 -3]，其转移的机制一直是分子生物学研究的热点[4-14]. 诸多证据表明，在恶性肿瘤转移的过程中有许多基因在不同层次上参与调控[15-17]. 这些基因就 其作用的性质可分为正向作用的转移基因和反向作用的抑制肿瘤转移基因，例如移动因子、 粘附因子或酶蛋白因子[9,18-22]. 目前已分离出的几个能抑制肿瘤转移的基因， 如：nm23基因、多种肿瘤抑制基因-I(multiple tumor suppressor gene I, MTSI), WDNM1，WDNM2，以nm23基因研究较多[8,23-25]. 为了进一步探讨nm23-H1基因突变在大肠肿瘤演进中的作用. 我们应用PCR-SSCP-银染法检测nm23基因在大肠 癌组织中的改变，结合肿瘤的临床、病理资料综合分析，探究nm23基因突变与大肠癌转移相关性.
, 百拇医药
1 材料和方法1.1 材料 江苏省肿瘤研究所惠赠中国人大肠癌组织标本63例，均经病理学明确诊断，其中20例有淋巴结转移，病理分型：高分化腺癌为3例，中分化腺癌56例，低分化腺癌4例.
1.2 方法 新鲜癌组织的DNA提取按酚-氯仿-异戊醇常规方法并略作改良：将癌组织剪碎，加入TE缓冲 液研磨后加入100g·L-1 SDS，蛋白酶K(10g·L-1)消化. 55℃水浴1h后加等量饱和酚、等量酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)、等量氯仿-异戊 醇(24∶1)抽提3次除去蛋白. 取上清，加1/10体积30g·L-1醋酸钠，2.5倍体积冷乙醇使DNA沉淀，再经700mL·L-1冷乙醇洗1次，去上清倒置控干后加TE溶解保存. 设计合成4对引物对应于nm23-H1基因第2～5位外显 子(第一位外显子未编码氨基酸).
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引物25′-TGTTTCATTCCTCTACCTGC-3′
5′-GTTCTCCTATACTATGAAGG-3′171
35′-GTTATTCTCATTCTCTGTCC-3′
5′-CATACTTGGAGTATCCCAC-3′ 128
45′-GACCATATCTTCTTCTGTCC-3′
5′-CCTTGTGGCAACTAAATCAG-3′ 154
55′-GTCTTGGTCATGTGACTATC-3′
5′-GTGAAAAGCAATGTGGTCTG-3′ 141
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PCR扩增的条件：95℃变性5min；94℃ 45s, 52℃～53℃ 45s；72℃ 60s，32个循环周期. 72℃延伸5min. PCR产物10μL加入上样缓冲液(含950g·L- 1甲酰胺)10μL 95℃变性5min，立即置于冰上. 反应液8μL行100g·L-1聚丙烯酰胺凝胶电泳(丙烯酰胺∶亚甲基双丙烯酰胺=49∶1). 电泳条件：电泳缓冲液0.5×TBE ，电压70V，4℃环境下过夜电泳. 银染分析：取出凝 胶，100mL·L-1乙醇固定，10g·L-1硝酸酸化，2g·L- 1硝酸银染色后30g·L-1 Na2CO3显色至条带清晰，背景均匀后100mL·L-1乙酸中止反应. 将nm23基因第5外显子扩增300μL，取上游引物(上海生物工程公司合成)10μL，浓度为50pmol·L-1封好 ，用四色荧光法标记四种脱氧核苷酸，按Sanger双脱氧终止法进行测序，上机电泳，计算机处理测序结果并进行分析.
, http://www.100md.com
2 结果我们用nm23基因第2～5位外显子引物对63例大肠癌组织标本(其中20例有淋巴结转移， 病理分型高分化为3例，中分化腺癌为56例，低分化腺癌为4例)进行PCR-SSCP的检测，经 反复筛选，重复操作. 结果显示，63例标本nm23-H1基因第2～4外显子呈现2条带型(图1)；第5外显子大部分呈现2条带型，部分标本呈现4条带型(图1)，然后对4条带DNA带型的标本进行DNA测序，显示nm23-H1基因第5外显子序列存在多态性，第360位 碱基存在T→C置换，密码子由AGT→AGC，但编码氨基酸不变(丝氨酸)，为同义突变.
图1大肠癌组织nm23基因第5外显子PCR-SSCP电泳分析.
N：nm23基因5外显子(2条带型)；
A：nm23基因5外显子(4条带型)
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3 讨论nm23基因是一种重要的肿瘤转移抑制基因. nm23-H1基因cDNA全长534bp，编码 152个氨基酸. 其中两个同源的基因nm23-H1基因与nm23-H2基因均位于17q22，分别编码Mr18000和17000的蛋白质，产物为催化核苷二磷 酸与核苷三磷酸互变的二磷酸核苷激酶(necleoside diphosphate kinase, NDPK), nm23-H1和nm23-H2基因分别编码NDPK的A亚基和B亚基. 人类基因结构发生异常或表达失控，会导致细胞生长和分化的异常，进而形成肿瘤，并可获 得恶性的生物学行为. 应用PCR-SSCP分析DNA扩增片段时，只要发生了带型的改变，包括单 链条带的增加、减少或泳动速率的改变，都可判断存在由DNA序列的突变. 目前，此技术已 应用于已知突变热点上的检测，筛选未知突变及分析癌基因、抗癌基因等的突变. 异源双链 体形成和SSCP分析相比较，后者更为敏感. PCR-SSCP法为一项较为敏感的检测点突变及小 片段缺失的方法，该方法用于检测150bp～300bp的DNA片段较为适宜，对于小于200bp的DNA 片段，其检出率可达90%[26,27]. 本实验中nm23-H1基因4个外显子的PCR扩增产物长度均小于200bp，故而SSCP技术适合nm23-H1基因的突变分析. 本研究结果提示，nm23基因突变在肠癌发生转移的过程中不占主导地位，肠癌转移的发生可能与其他基因相关，或者与nm23基因调控部位的甲基化有关，值得进一步探讨.
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4 参考文献1 谷化平, 倪灿荣, 詹熔洲. 大肠癌CD15, CD44v6和nm23H1的mRNA表达与 转移及预后的相关性. 世界华人消化杂志，2000;8:887-891
2 王志伟, 陈瑞新, 周广军, 沈洪薰, 陈玉泉. 大肠癌患者外周血CK20 mRNA的表达. 世界华人消化杂志，2000;8:818-820
3 范如英,李世荣,吴霞,武子涛,晨智敏,邓永江,曹建彪,张红光. 大肠癌患者粪 脱落细胞P53的表达. 世界华人消化杂志，2000;8:814-815
4 张振书, 张亚历. 中国大肠癌研究进展. 世界华人消化杂志，2001;9:489-494
5 范应方, 黄宗海. 结直肠癌基因治疗研究进展. 世界华人消化杂志，2001;9:427-430
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6 许昌泰, 闫小君. p53抗癌基因和消化系肿瘤. 世界华人消化杂志, 1999;7:77-79
7 李铭, 王灏, 郁宝铭, 郑民华. P53基因突变和肿瘤标志物对大肠癌患者预后的影响. 世界华人消化杂志, 1999;7:425-426
8 蒋会勇, 卿三华. 大肠癌淋巴结转移相关因素研究现况. 世界华人消化杂志, 1999;7:982-984
9 徐亮, 卢光宇. 结直肠癌ras P21表达和DNA含量分析. 世界华人消化杂志, 1999;7:706-707
10 Wu BP, Zhang YL, Zhou DY, Gao CF, Lai ZS. Microsatellite instability, MMR gene expression and proliferation kinetics in colorectal
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cancer with famillial predisposition. World J Gastroenterol, 2000;6:902-905
11 应月强, 周氵光, 吴佩, 黄文斌. 大肠癌组织TGF-α和TGF-β 1的表达意义. 世界华人消化杂志，2001;9:223-225
12 蔡崎, 陆洪芬, 孙孟红, 杜祥, 范月珍, 施达仁. 结直肠癌组织中CD44v3, v6蛋白的表达意义. 世界华人消化杂志，2000;8:1255-1258
13 庄小强, 赖日权, 孙桂华, 王晓怀, 袁世珍. 大肠癌P53蛋白与PCNA表达的预后 意义. 世界华人消化杂志, 1999;7:616
14 杨家辉, 饶本强, 王瑶, 涂小煌, 张连阳, 陈少华, 欧阳学农, 戴西湖. 大肠癌患者外周血循环癌细胞检测的临床意义.
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世界华人消化杂志， 2000;8:187-189
15 刘变英, 崔大祥, 潘胜武, 闫小君, 雷宇锋, 栗彤. 大肠癌及癌旁组织中P73基因的表达. 世界华人消化杂志，2001;9:229-230
16 刘江伟, 李开宗. 胰腺癌与癌基因及抑癌基因. 世界华人消化杂志，2001;9:72-73
17 潘胜武, 孙安乐, 刘变英, 崔大祥, 闫小君, 栗彤, 雷宇锋, 王胜. 大肠癌相关基因表达的早期诊断意义.
世界华人消化杂志，2000;8:1431-1432
18 谷化平, 尚培中, 苏红, 李志钢. 食管癌组织CD15抗原和组织蛋白酶D表达的关系. 世界华人消化杂志， 2000;8:259-261
, 百拇医药
19 赵敏芳,毛华,郑景熙,袁亚维. 血管内皮细胞生长因子对大肠癌HT-29细胞粘附作用的影响. 世界华人消化杂志，2000;8:646-649
20 刘灏,吴金生,李立宏,要秀. 大肠癌的血管生成与血小板源生长因子的表达研究. 世界华人消化杂志，2000;8:661-664
21 许沈华, 冯建国, 李德川, 牟瀚舟, 楼荣灿. 大肠癌患者外周血CD44水平与临床病理的相关性研究. 世界华人消化杂志，2000;8:432-435
22 陈治, 王晓莉, 张莉, 黄宗海, 潘玉先, 曹长安. 血管内皮生长因子及其受体在人大肠癌组织中的分布、定量和意义.
世界华人消化杂志，2000;8:472-473
23 秦环龙, 林擎天. p53，nm23-H1和CEA表达与大肠癌术后肝脏转移和局部复发的关系. 世界华人消化杂志，2000;8:589-590
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24 申兴斌, 张旭晨, 梅立新, 赵晓明, 胡建功. 大肠癌组织nm23/NDPK及p53表达的意义. 世界华人消化杂志, 1999;7:809-810
25 张明, 倪灿荣, 戴益民, 范淼, 陈晓东, 张松平. HCC中nm23H1mRNA、蛋白产物的表达与预后指标的相关性研究.
世界华人消化杂志, 1999;7:342
26 Cohn KH, Ornstein DL, Wang FS, LaPaix FD, Phipps K, Edelsberg C, Zuna R, Mott LA, Dunn JL. The significance of allelic deletions
and aneuploidy in colorectal carcinoma: results of a 5-year follow-up study. Cancer, 1997;79:233-244
27 Berney CR, Yang JL, Fisher RJ, Russell PJ, Crowe PJ. Overexpression of nm23 protein assessed by color video image analysis in
metastatic colorectal cancer: correlation with reduced patient survival. World J Surg, 1998;22:484-490, http://www.100md.com(金月玲1 黄培林1 王亚平2 黄照权3 王建东2 孟明1)