青年乙型肝炎患者肝组织Bcl-2，Bax蛋白的表达
广东省廉江市人民医院消化内科 广东省廉江市 524400
项目负责人 杨柳明
收稿日期 2001-03-05 接受日期 2001-03-13
主题词 青年；乙型肝炎；病理学；原癌基因；Bcl-2蛋白；Bax蛋白；免疫组织化学
杨柳明, 吴志荣, 赵延龙, 陈杜芳, 伍桂荣. 青年乙型肝炎患者肝组织Bcl-2，Bax蛋白的表达. 世界华人消化杂志，2001；9(8)：966-967
0 引言Bcl-2蛋白具有对抗细胞凋亡的作用，而其蛋白家族中的Bax蛋白则可抑制Bcl-2的活性[1,2]. Bcl-2和Bax蛋白可在肝组织中表达，而当发生病毒性肝炎时常伴有肝细胞的 凋亡和坏死[3]. 我们采用免疫组化技术观察青年乙肝患者肝组织中Bcl-2及其相 关蛋白Bax的表达，并对其间的关系和意义进行了探讨.
, 百拇医药
1 材料和方法1.1 材料 选用我院2000年收治的青年乙型肝炎患者肝穿组织检查标本28例(诊断标准按1995年全国传染病与寄生虫病会议标准). 其中男16例，女12例，年龄18岁～35岁，乙型肝炎病 史2mo～17a. 病理组织学类型：急性肝炎15例，肝细胞部分或普遍疏松肿胀，肝小叶点状或灶状坏死，汇管区炎症；慢性肝炎13例，伴有不同程度的纤维化. 肝组织经40g·L-1甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，5μm厚连续切片，分别作HE及免疫组化染色. 小鼠抗人Bcl-2单抗、兔抗人Bax抗体免疫组化试剂盒(SPKit)均购自武汉博士德公司.
1.2 方法 将切片常规脱蜡及复水化，用3mol·L -1 H2O2/甲醇液室温40min以阻断内原酶活性. 切片于0.01mol·L-1枸橼酸盐缓冲液中微波炉抗原修复. 再以1∶100正常羊血清滴片，37℃封闭以减少非特异性着色. 然后于切片上滴加Bcl-2, Bax抗体(1∶200稀释)，于湿 盒内置4℃过夜. 滴加1∶100稀释的生物素化二抗，37℃孵育30min后滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵蛋白(HRP-Avidin)(1∶100稀释)，37℃，30min. DAB(Sigma)显色，苏木素衬染. 以PBS缓冲液分别代替Bcl-2, Bax抗体作为阴性对照.
, 百拇医药
2 结果Bcl-2，Bax阳性者细胞胞质呈棕黄色着染. 28例青年病毒性乙型肝炎，15例急性肝炎中， Bcl-2和Bax蛋白表达分布基本一致，主要在汇管区和小叶内点、灶状坏死区浸润的部分单核细胞、淋巴细胞等单个核细胞(mononuclear cell, MN cell)以及个别肝细胞；但其表达率不同. 在单个核细胞中，Bcl-2胞质阳性者占4/15(26.7%)，Bax胞质阳性者占8/15(53.3%)，Bcl-2和Bax均阳性者2例，Bcl-2和Bax均阴性者3例. 连续切片HE染色观察，发现Bcl-2阳性者存在不同程度的肝小叶灶状坏死，周边肝细胞胞质Bcl-2和Bax弱阳性. 13例慢性肝炎中，Bcl-2和Bax亦主要在汇管区、小叶内点灶状坏死区、碎屑样坏死区部分单个核细胞以及肝小叶内的枯否细胞等胞质内表达；Bcl-2阳性 为8/13(61.5%)，Bax阳性者占3/13(23.1%)，Bcl-2和Bax均阳性者3例. 在邻近碎屑样坏死区边缘的肝细胞胞质中两种蛋白呈强阳性表达. 连续切片HE染色观察，发现Bcl-2和Bax阳性肝细胞往往呈重度水肿或嗜酸性变.
, 百拇医药
3 讨论bcl-2原癌基因是1985年首先在B细胞滤泡性淋巴瘤中发现的，其属于抑制细胞凋亡 基因. 在体外实验中，Bcl-2蛋白无需其他因子即可维持T，B淋巴细胞的发育和增殖；若在T，B淋巴细胞有Bcl-2的过度表达，则可促进其无限增殖[4,5]. bax是bcl -2家族中的重要成员，研究证实bax基因长4.5kb，含有6个外显子，可通过不同的剪 接方式编码3种蛋白：Bax-α，β，γ. 细胞中Bax蛋白高表达时，加速细胞凋亡，并发现 细胞中Bcl-2与Bax的比例不同可调节细胞凋亡[1]. 研究表明，Bcl-2的Bax表达 并不局限于淋巴造血系统的细胞中，在乳腺及肝脏常见的良、恶性病变中均见不同程度的表达[6-9]. 我们对Bcl-2的Bax蛋白在青年乙肝患者肝组织中的表达进行了研究. 发现Bcl-2和Bax蛋 白表达分布基本一致，主要在汇管区和小叶内点、灶状坏死区浸润的部分单个核细胞以及坏 死区周边的部分肝细胞. 在急性肝炎，Bax的表达率高于Bcl-2. 随着病程的延长，Bcl-2在单个核细胞、枯否细胞中的表达有增强的趋势，以及邻近碎屑样坏死区边缘的肝细 胞中两种蛋白呈强阳性表达. 在慢性肝炎，连续切片HE染色观察，发现Bcl-2和Bax阳性肝细胞往往呈重度水肿或嗜酸性变. 肝组织单个核细胞可分泌IL-6, IL-1等细胞因子，在 炎症反应和免疫反应过程中起重要作用，Bcl-2可能通过抑制单个核细胞的凋亡，从而导致 肝细胞的损伤[10-14]. 骆抗先et al[15]经原位末端标记检测，发现在碎屑样坏死区有较多的DNA损伤肝细胞，细胞中Bax蛋白高表达可促进细胞凋亡. 此外，Bcl-2和Bax可形成二聚体，同样对细胞凋亡起着重要的作用. 我们对青年乙肝的研 究提示，肝炎早期肝细胞的损伤可能主要缘于Bax对单个核细胞的促增殖作用，随着病变的 活动和病程的延长，肝细胞在接受死亡信号之后，Bax通过与Bcl-2的相互作用，在单个核 细胞经细胞因子并未丧失作用的同时，导致肝细胞的持续损伤. 进一步研究Bcl-2和Bax及其影响因素在青年乙型肝炎发生发展中的作用并探索对病变的及时干预措施具有重要意义.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 Oltvai ZN, Milliman CL, Rovsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homologe, Bax, that accelerates programmed
cell death. Cell, 1993;74:609-619
2 Michael CR, Mattew JB, Virginia CP. Modulation of apoptosis by the widely distributed Bcl-2 homologe, Bax. Nature, 1995;374:736-738
3 蒋业贵,李奇芬,王宇明,顾长海. HDV/HBV感染树鼠句肝组织中Bcl2/Bax表达和肝细胞凋亡. 世界华人消化杂志，2000;8:625-628
, 百拇医药
4 Lu OL, Ulsom R, Wong L. Bcl-2 expression in adult and embryonic nonhaema topoietic tissue. J Pathol, 1993;169:431-437
5 乔庆, 吴金生, 张静, 马庆久, 赖大年. 凋亡相关基因bcl-2, bax在人类大肠腺癌中的表达意义. 世界华人消化杂志, 1999;7:936-938
6 丁华野, 皋岚湘, 邓永江. Bcl-2蛋白在乳腺癌组织中表达的临床病理意义. 解放军医 学杂志, 1996;21:191
7 郎振为, 王海舰, 孟忻, 李德新, 张世杰, 李俊强. 病毒性肝炎患者肝组织中Bcl-2蛋 白的表达. 中华肝脏病杂志, 1998;6:85-86
8 郭琳琅, 曹长安, 王友顺. Bcl-2及相关蛋白bax在肝脏良恶性病变中的表达. 新消化病学杂志, 1997;5:655
, 百拇医药
9 陈乃玲, 陈佩兰, 李琳, 邓燕林, 邓涛. 凋亡基因Bcl-2，Fas及Bax在慢性肝病的表达及临床价值. 世界华人消化杂志，2000;8(特刊8):84
10 王剑明, 邹倩, 邹声泉. bcl-2基因在阻塞性黄疸大鼠肝组织细胞凋亡中作用的研究. 世界华人消化杂志, 1999;7:1035-1037
11 白文元, 姚希贤, 冯丽英. 肝纤维化的研究现状. 世界华人消化杂志，2000;8:1267-1268
12 Friedman SL. The cellular basis of hepatic fibrosis: mechanisms and treatment strategies. New Engl J Med, 1993;328:1828-1835
13 王要军, 孙自勤. 肝纤维化的细胞学和分子生物学研究进展. 新消化病学杂志， 1994;2:244-246
14 姚迪, 李定国. 肝纤维化形成机制的研究进展. 新消化病学杂志, 1995;3(特刊4):59
15 骆抗先, 朱幼芙. 病毒性肝炎与肝细胞凋亡. 中华肝脏病杂志, 1996;4: 197-199, 百拇医药(杨柳明 吴志荣 赵延龙 陈杜芳 伍桂荣)
项目负责人 杨柳明
收稿日期 2001-03-05 接受日期 2001-03-13
主题词 青年；乙型肝炎；病理学；原癌基因；Bcl-2蛋白；Bax蛋白；免疫组织化学
杨柳明, 吴志荣, 赵延龙, 陈杜芳, 伍桂荣. 青年乙型肝炎患者肝组织Bcl-2，Bax蛋白的表达. 世界华人消化杂志，2001；9(8)：966-967
0 引言Bcl-2蛋白具有对抗细胞凋亡的作用，而其蛋白家族中的Bax蛋白则可抑制Bcl-2的活性[1,2]. Bcl-2和Bax蛋白可在肝组织中表达，而当发生病毒性肝炎时常伴有肝细胞的 凋亡和坏死[3]. 我们采用免疫组化技术观察青年乙肝患者肝组织中Bcl-2及其相 关蛋白Bax的表达，并对其间的关系和意义进行了探讨.
, 百拇医药
1 材料和方法1.1 材料 选用我院2000年收治的青年乙型肝炎患者肝穿组织检查标本28例(诊断标准按1995年全国传染病与寄生虫病会议标准). 其中男16例，女12例，年龄18岁～35岁，乙型肝炎病 史2mo～17a. 病理组织学类型：急性肝炎15例，肝细胞部分或普遍疏松肿胀，肝小叶点状或灶状坏死，汇管区炎症；慢性肝炎13例，伴有不同程度的纤维化. 肝组织经40g·L-1甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，5μm厚连续切片，分别作HE及免疫组化染色. 小鼠抗人Bcl-2单抗、兔抗人Bax抗体免疫组化试剂盒(SPKit)均购自武汉博士德公司.
1.2 方法 将切片常规脱蜡及复水化，用3mol·L -1 H2O2/甲醇液室温40min以阻断内原酶活性. 切片于0.01mol·L-1枸橼酸盐缓冲液中微波炉抗原修复. 再以1∶100正常羊血清滴片，37℃封闭以减少非特异性着色. 然后于切片上滴加Bcl-2, Bax抗体(1∶200稀释)，于湿 盒内置4℃过夜. 滴加1∶100稀释的生物素化二抗，37℃孵育30min后滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵蛋白(HRP-Avidin)(1∶100稀释)，37℃，30min. DAB(Sigma)显色，苏木素衬染. 以PBS缓冲液分别代替Bcl-2, Bax抗体作为阴性对照.
, 百拇医药
2 结果Bcl-2，Bax阳性者细胞胞质呈棕黄色着染. 28例青年病毒性乙型肝炎，15例急性肝炎中， Bcl-2和Bax蛋白表达分布基本一致，主要在汇管区和小叶内点、灶状坏死区浸润的部分单核细胞、淋巴细胞等单个核细胞(mononuclear cell, MN cell)以及个别肝细胞；但其表达率不同. 在单个核细胞中，Bcl-2胞质阳性者占4/15(26.7%)，Bax胞质阳性者占8/15(53.3%)，Bcl-2和Bax均阳性者2例，Bcl-2和Bax均阴性者3例. 连续切片HE染色观察，发现Bcl-2阳性者存在不同程度的肝小叶灶状坏死，周边肝细胞胞质Bcl-2和Bax弱阳性. 13例慢性肝炎中，Bcl-2和Bax亦主要在汇管区、小叶内点灶状坏死区、碎屑样坏死区部分单个核细胞以及肝小叶内的枯否细胞等胞质内表达；Bcl-2阳性 为8/13(61.5%)，Bax阳性者占3/13(23.1%)，Bcl-2和Bax均阳性者3例. 在邻近碎屑样坏死区边缘的肝细胞胞质中两种蛋白呈强阳性表达. 连续切片HE染色观察，发现Bcl-2和Bax阳性肝细胞往往呈重度水肿或嗜酸性变.
, 百拇医药
3 讨论bcl-2原癌基因是1985年首先在B细胞滤泡性淋巴瘤中发现的，其属于抑制细胞凋亡 基因. 在体外实验中，Bcl-2蛋白无需其他因子即可维持T，B淋巴细胞的发育和增殖；若在T，B淋巴细胞有Bcl-2的过度表达，则可促进其无限增殖[4,5]. bax是bcl -2家族中的重要成员，研究证实bax基因长4.5kb，含有6个外显子，可通过不同的剪 接方式编码3种蛋白：Bax-α，β，γ. 细胞中Bax蛋白高表达时，加速细胞凋亡，并发现 细胞中Bcl-2与Bax的比例不同可调节细胞凋亡[1]. 研究表明，Bcl-2的Bax表达 并不局限于淋巴造血系统的细胞中，在乳腺及肝脏常见的良、恶性病变中均见不同程度的表达[6-9]. 我们对Bcl-2的Bax蛋白在青年乙肝患者肝组织中的表达进行了研究. 发现Bcl-2和Bax蛋 白表达分布基本一致，主要在汇管区和小叶内点、灶状坏死区浸润的部分单个核细胞以及坏 死区周边的部分肝细胞. 在急性肝炎，Bax的表达率高于Bcl-2. 随着病程的延长，Bcl-2在单个核细胞、枯否细胞中的表达有增强的趋势，以及邻近碎屑样坏死区边缘的肝细 胞中两种蛋白呈强阳性表达. 在慢性肝炎，连续切片HE染色观察，发现Bcl-2和Bax阳性肝细胞往往呈重度水肿或嗜酸性变. 肝组织单个核细胞可分泌IL-6, IL-1等细胞因子，在 炎症反应和免疫反应过程中起重要作用，Bcl-2可能通过抑制单个核细胞的凋亡，从而导致 肝细胞的损伤[10-14]. 骆抗先et al[15]经原位末端标记检测，发现在碎屑样坏死区有较多的DNA损伤肝细胞，细胞中Bax蛋白高表达可促进细胞凋亡. 此外，Bcl-2和Bax可形成二聚体，同样对细胞凋亡起着重要的作用. 我们对青年乙肝的研 究提示，肝炎早期肝细胞的损伤可能主要缘于Bax对单个核细胞的促增殖作用，随着病变的 活动和病程的延长，肝细胞在接受死亡信号之后，Bax通过与Bcl-2的相互作用，在单个核 细胞经细胞因子并未丧失作用的同时，导致肝细胞的持续损伤. 进一步研究Bcl-2和Bax及其影响因素在青年乙型肝炎发生发展中的作用并探索对病变的及时干预措施具有重要意义.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 Oltvai ZN, Milliman CL, Rovsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homologe, Bax, that accelerates programmed
cell death. Cell, 1993;74:609-619
2 Michael CR, Mattew JB, Virginia CP. Modulation of apoptosis by the widely distributed Bcl-2 homologe, Bax. Nature, 1995;374:736-738
3 蒋业贵,李奇芬,王宇明,顾长海. HDV/HBV感染树鼠句肝组织中Bcl2/Bax表达和肝细胞凋亡. 世界华人消化杂志，2000;8:625-628
, 百拇医药
4 Lu OL, Ulsom R, Wong L. Bcl-2 expression in adult and embryonic nonhaema topoietic tissue. J Pathol, 1993;169:431-437
5 乔庆, 吴金生, 张静, 马庆久, 赖大年. 凋亡相关基因bcl-2, bax在人类大肠腺癌中的表达意义. 世界华人消化杂志, 1999;7:936-938
6 丁华野, 皋岚湘, 邓永江. Bcl-2蛋白在乳腺癌组织中表达的临床病理意义. 解放军医 学杂志, 1996;21:191
7 郎振为, 王海舰, 孟忻, 李德新, 张世杰, 李俊强. 病毒性肝炎患者肝组织中Bcl-2蛋 白的表达. 中华肝脏病杂志, 1998;6:85-86
8 郭琳琅, 曹长安, 王友顺. Bcl-2及相关蛋白bax在肝脏良恶性病变中的表达. 新消化病学杂志, 1997;5:655
, 百拇医药
9 陈乃玲, 陈佩兰, 李琳, 邓燕林, 邓涛. 凋亡基因Bcl-2，Fas及Bax在慢性肝病的表达及临床价值. 世界华人消化杂志，2000;8(特刊8):84
10 王剑明, 邹倩, 邹声泉. bcl-2基因在阻塞性黄疸大鼠肝组织细胞凋亡中作用的研究. 世界华人消化杂志, 1999;7:1035-1037
11 白文元, 姚希贤, 冯丽英. 肝纤维化的研究现状. 世界华人消化杂志，2000;8:1267-1268
12 Friedman SL. The cellular basis of hepatic fibrosis: mechanisms and treatment strategies. New Engl J Med, 1993;328:1828-1835
13 王要军, 孙自勤. 肝纤维化的细胞学和分子生物学研究进展. 新消化病学杂志， 1994;2:244-246
14 姚迪, 李定国. 肝纤维化形成机制的研究进展. 新消化病学杂志, 1995;3(特刊4):59
15 骆抗先, 朱幼芙. 病毒性肝炎与肝细胞凋亡. 中华肝脏病杂志, 1996;4: 197-199, 百拇医药(杨柳明 吴志荣 赵延龙 陈杜芳 伍桂荣)