大肠癌患者基质分解素-1基因表达增强
解放军252医院消化呼吸科 河北省保定市 0710003
项目负责人 张莉
收稿日期 2001-04-11 接受日期 2001-06-20
摘 要
目的 了解大肠癌患者癌组织中基质分解素-1基因表达情况.
方法 50例大肠癌患者术中取癌组织及正常组织；提取组织总RNA；用 共扩增逆转录定量PCR方法测定基质分解素-1基因表达水平.
结果 大肠癌组织基质分解素-1 (MMP3)的基因表达水平(1.96±0.4 4)明显高于正常大肠组织(0.43±0.12)；(P<0.001).伴有局部淋巴结转移者组织基质分 解素-1基因表达水平(3.32±0.62)明显高于无局部淋巴转移者(1.66±0.40)(P<0.01).
, http://www.100md.com
结论 基质分解素-1在大肠癌的浸润、转移中可能起重要作用.
主题词 结肠直肠肿瘤/病理学；基质溶解素1/遗传学；基因表达； 肿瘤转移；肿瘤侵润
张莉，秦北宁，任爱琴，张忠明，古彩吉吉，耿洪刚.大肠癌患者基质分解素- 1基因表达增强.世界华人消化杂志，2001；9(10)：1210-1212
0 引言恶性肿瘤的浸润与转移是导致病情加重的主要原因[1-5].近年来研究表明基质金 属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)在肿瘤的浸润、转移中起重要作用[6 -15].基质分解素-1(Stromelysin-1, MMP3)是MMPs的一种，它在大肠癌进展中的 作用鲜有报道.我们采用逆转录共扩增定量PCR方法检测了50例大肠癌患者MMP3基因表达情况 ，现报道如下：
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 经纤维结肠镜检察及活组织检查确诊的大肠癌患者 50例，男32例、女18例，平均年龄(56±12)岁.每例患者均在术中取癌组织一块，部分患 者在距癌肿10cm以上处取正常组织一块，迅速投入液氮，在标本留取1wk内行RNA提取.总 RNA提取试剂盒(Total RNA Isolation System)、AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Olig(dt)15 Primers、 Taq酶、PCR Markers、琼脂糖均为Promega公司产品.毛细管PCR仪为美国Idaho公司产品；凝胶成像系统：Kodak digital science system DC-40.
1.2 方法 RNA提取用Promega公司生产的Total RNA Isolation System提取组织总RNA.采用分光光度法测定提取的总RNA含量及纯度，A260/A280需在1.8～2.0间.cDNA合成采用10μL逆转录反应体系；含待测RNA1μg，A MV15u，RNA酶抑制剂20u，Oligdt(15Primer) 50mg/L及适量dNTP(10mmol/L)、5×RT buff er，42℃反应1h；95℃5min灭活AMV.共扩增-PCR参照Noonan et.al 的方法进行.基质分解 素-1 (MMP3)引物的设计参照Genebank资料及王爱民et.al[16]的设计；内参对照 β-actin 的引物设计参照Genebank资料.两对引物的序列如下：
, 百拇医药
MMP3
5’ Primer(sense)5’-TAT GGA TCC CCC CCT GAC TCC CCT GAG-3’
3’ Primer(antisense)5’-ATG GAA TTC AGG TTC AAG CTT CCT GAG G-3’
β-actin
5’ primer(sense)5'-CGA GAA GAT GAC CCA GAT CA-3’
3’ Primer(antisense)5'-GAT CTT CAT GAG GTA GTC AG-3’
PCR反应体系为20μL，内含cDNA2μL，10×buffer 2μL，4×dNTP(2mmol/L)2μL，MMP3 、β-actin引物(10μmon/L)各2μL，Taq酶1U，用水补至20μL. PCR反应在0.2mL薄壁管中进行，用毛细管PCR仪扩增.PCR反应参数为：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃后延伸7min .扩增产物在20g/L琼脂糖凝胶上进行电泳，MMP3和β-actin的扩增产物分别为194 bp和2 34 bp.对扩增产物用凝胶成像系统进行定量分析，用MMP3/β-actin的比值表示MMP3的相 对表达水平. 统计学处理 结果以x±s表示，用t检验进行处理.
, 百拇医药
2 结果2.1 大肠癌组织基质分解素-1的基因表达正常大肠 组织可见基质分解素-1的基因表达；大肠癌组织基质分解素-1的基因表达水平(1.96±0.4 4)明显高于正常大肠组织(0.43±0.12)(P<0.001).
2.2 大肠癌组织基质分解素-1基因表达与转移的关系50例大肠癌患者有9例经病理证实有淋巴结转移者；将此9例患者的癌组织MMP3基因表达 水平与41例无淋巴结转移者相比，伴有淋巴结转移者MMP3基因表达水平(3.32±0.62)明显 高于无局部淋巴转移者(1.66±0.40)(P<0.01).
3 讨论
基质金属蛋白酶(Matrix metalloprotein ases, MMPs)主要包括间质胶原酶类、Ⅳ型胶原酶/明胶酶类和基质分解素类三大类.基质 分解素类包括基质分解素-1、基质分解素-2、基质分解素-3和基质降解素(Matrilysin, putative metalloproteinase, PUMP-1，MMP7)[17-28].有关基质分解素与 肿瘤关系的研究目前报道较少，且多为对基质分解素-3的研究.研究表明头颈部鳞癌的局部浸润与基质分解素-3基因表达增强有关乳腺癌患者基质分解素-3与肿瘤进展有关.王爱民 et.al[29-30]研究了食管癌、肺癌患者基质分解素-1(MMP3)基因表达的情况 ，结果表明：食管癌、肺癌组织MMP3的基因表达水平显著高于正常食管组织和癌旁正常肺 组织.本研究大肠癌组织基质分解素-1的基因表达，显示大肠癌组织基质分解素-1 (MMP 3)的基因表达明显高于正常大肠组织；伴有局部淋巴结转移者组织基质分解素-1基因表达 水平明显高于不伴有局部淋巴结转移者，提示大肠癌的浸润、转移与基质分解素1基因表达 增强有关.但基质分解素-1的基因表达受诸多细胞因子、生长因子的影响，如TGF(、TNF(、 PDGF、EGF、bFGF等.大肠癌基质分解素-1基因表达增强是否与上述因子调控有关，及其调 控的程度，对此我们正在研究之中.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 李楠，徐采朴.胃癌组织中金属蛋白酶类基因过度表达.华人消化杂志,1998;2：118-120
2 Mattodosm LM.The matrix metalloproteinase.BioEssays，1992;455-463
3 高毅，黄宇琦，王宇，方石岗，杨继震.逆转录定量PCR检测实验性肝纤维组织中金属蛋白酶抑制因子-1的表达.
世界华人消化杂志，1999；7：993
4 王宇，高毅，杨继震.实验性肝纤维化过程中间质胶原酶表达的研究.世界华人消化杂志，1999；7：1004-1006
5 Ji F, Wang WL, Yang ZL, Li YM, Huang HD, Chen WD. Study on the expression of matrix metalloproteinase-2 mRNA in human
, http://www.100md.com
gastric cancer. World J Gastroenterol, 1999;5:455-457
6 李楠，徐采朴，宋波，刘为纹，王鑫，张朝山，徐元基，冯东晓.金属蛋白酶抑制剂TIMP-2基因转染对胃癌细胞体外生长浸润
与细胞外基质的相关性.华人消化杂志，1998；6：663-666
7 铁国栋，曹宇静，赵兴绪，段恩奎. 纤维粘连蛋白一整合素相互作用启动胚泡中基质金属蛋白酶活性.科学通报，2000；45：475-479
8 Duivenvoorden WC, Hirte HW, Singh G. Transforming growth factor betal acts as an inducer of matrix metalloproteinase
, 百拇医药
expression and activity in human bone-metastasizing cancer cells. Clin Exp Metastasis, 1999;17:27-34
9 向德栋，李奇芬，王宇明，王雅凡. 维生素E乳剂对肝脏星状细胞III型前胶原和MMP1 mRNA表达的影响.世界华人消化杂志，1999；7：1085
10 Gilles C, Polette M, Piette J , Thompson EW, Birembaunt P, Foidart JMI. High levels of MT-MMp expression is associated
with invasivenss of cervical cancer cells. Int J Cancer, 1996;65:209-213
, http://www.100md.com
11 Davies B, Miles LC, Happerfield MS, Naylor MS, Bobrow LG, Rubers RD, Balkwil FR. Activity of type IV collagennase in benign
and malignant breast disease.Br J Cancer, 1993;67:1126-1131
12 David EK, William G, Stevenson S. Quantitative zymography: detection of picogram quantities of gelatinases. Anal Biochem,1994;218:325-329
13 Zucker S, Drews M, C, Foda HD, Declerck, Langley KE, Babous WF, Docherty AJP, Cao J. Tissue inhibitor of metalloproteinase-2
, 百拇医药
(TIMP-2 ) binds to the catalytic domain of the cell surface receptor, membrane type 1-matrix metalloproteinase 1 (MT1-MMP).
J Biochemistry, 1993;273:1216-1222
14 Nagase H, Cawston TE, Brew K. Involvement of a region near valine-69 of tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)-1 in
the interaction with matrix metalloproteinase 3(stromelysin 1). Biochem J, 1997;325:163-167
, http://www.100md.com
15 Tokuraku M, Sato H, Murakami S, Okada Y ,Watanabe Y, Seiki M.Activation of the precursor of gelatinase / 72kDa rype IV
collagenase / MMP-2 in lungcarcinomas correlates with the expression of membrane-type matrix metalloprot (MT-MMP) and
with Lymph node metastasis. Br J Cancer (Pred Oncol), 1995;64:355-359
16 王爱民，王宝恩，杨跃伟，梁宝忠. 慢性肝病基质分解素-1基因表达的研究.中华医学杂志，1999；4：275-276
, 百拇医药
17 Ochieng J, Fridman R, Nangia Makker P, Kleiner DE, Liotta LA, Stetler Stevenson WG, Raz A. Galectin-3 is a novel substrate for
human matrix metalloproteinases-2 and-9. Biochemistry, 1994;33:14109-14114
18 黄宇琦，高毅，杨继震，方石岗，王宇，大鼠肝纤维化基质金属蛋白酶及其抑制因子的表达，世界华人消化杂志，1999；9：795-796
19 陈平圣，翟溶，张月娥，张绵生，缺氧对肝星状细胞产生胶原及胶原降解酶的影响.世界华人消化杂志，2000；5：586-587
20 姚树坤，段飞，肝纤维化早期诊断，世界华人消化杂志，2000；6：681-683
, 百拇医药
21 姜慧卿，张晓岚，肝纤维化的发生机制.世界华人消化杂志，2000；6：687-689
22 白文元，姚希贤，冯丽莫，肝纤维化的研究现状.世界华人消化杂志，2000；11：1267-1268
23 蒋泽生，高毅.基质金属蛋白酶的生物特性及其在肝癌与浸润转移中的作用，世界华人消化杂志，2000；12：1403-1404
24 郝远瑞，赵跃武，王令非，银平章. 人肝细胞癌组织中MMP-2酶活性的变化.世界华人消化杂志，2000；8：952-953
25 周永健，陈岳祥. 基质金属蛋白酶及其抑制因子与纤维化，国外医学消化手册，1996；2：67-70
26 洪照友，俞金龙，张元生，高毅. 基质金属蛋白酶-9，CD34的表达与肝癌侵袭转移的关系. 世界华人消化杂志，2001；2：170-174
27 蒋泽生，方石岗，高毅陈建锋，汪爽，Batimastat 对大鼠原发性肝癌生长侵袭转移的影响.世界华人消化杂志，2001；5：546-549
28 刘景章，赵子粼，陈泽华，高毅，肝硬化肝癌IV型胶原酶的表达.世界华人消化杂志，2001；6：711-713
29 王爱民，华川，韩利，王延明，李卫杰.食管癌患者基质分解素-1基因表达的研究. 中国肿瘤临床与康复，2000；3：8-9
30 王爱民， 李伟中，郭春江，李卫杰.肺癌患者基质分解素-1基因表达的研究.肿瘤， 2000；6：404-40, 百拇医药(张莉 秦北宁 任爱琴 张忠明 古彩吉吉 耿洪刚)
项目负责人 张莉
收稿日期 2001-04-11 接受日期 2001-06-20
摘 要
目的 了解大肠癌患者癌组织中基质分解素-1基因表达情况.
方法 50例大肠癌患者术中取癌组织及正常组织；提取组织总RNA；用 共扩增逆转录定量PCR方法测定基质分解素-1基因表达水平.
结果 大肠癌组织基质分解素-1 (MMP3)的基因表达水平(1.96±0.4 4)明显高于正常大肠组织(0.43±0.12)；(P<0.001).伴有局部淋巴结转移者组织基质分 解素-1基因表达水平(3.32±0.62)明显高于无局部淋巴转移者(1.66±0.40)(P<0.01).
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结论 基质分解素-1在大肠癌的浸润、转移中可能起重要作用.
主题词 结肠直肠肿瘤/病理学；基质溶解素1/遗传学；基因表达； 肿瘤转移；肿瘤侵润
张莉，秦北宁，任爱琴，张忠明，古彩吉吉，耿洪刚.大肠癌患者基质分解素- 1基因表达增强.世界华人消化杂志，2001；9(10)：1210-1212
0 引言恶性肿瘤的浸润与转移是导致病情加重的主要原因[1-5].近年来研究表明基质金 属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)在肿瘤的浸润、转移中起重要作用[6 -15].基质分解素-1(Stromelysin-1, MMP3)是MMPs的一种，它在大肠癌进展中的 作用鲜有报道.我们采用逆转录共扩增定量PCR方法检测了50例大肠癌患者MMP3基因表达情况 ，现报道如下：
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 经纤维结肠镜检察及活组织检查确诊的大肠癌患者 50例，男32例、女18例，平均年龄(56±12)岁.每例患者均在术中取癌组织一块，部分患 者在距癌肿10cm以上处取正常组织一块，迅速投入液氮，在标本留取1wk内行RNA提取.总 RNA提取试剂盒(Total RNA Isolation System)、AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Olig(dt)15 Primers、 Taq酶、PCR Markers、琼脂糖均为Promega公司产品.毛细管PCR仪为美国Idaho公司产品；凝胶成像系统：Kodak digital science system DC-40.
1.2 方法 RNA提取用Promega公司生产的Total RNA Isolation System提取组织总RNA.采用分光光度法测定提取的总RNA含量及纯度，A260/A280需在1.8～2.0间.cDNA合成采用10μL逆转录反应体系；含待测RNA1μg，A MV15u，RNA酶抑制剂20u，Oligdt(15Primer) 50mg/L及适量dNTP(10mmol/L)、5×RT buff er，42℃反应1h；95℃5min灭活AMV.共扩增-PCR参照Noonan et.al 的方法进行.基质分解 素-1 (MMP3)引物的设计参照Genebank资料及王爱民et.al[16]的设计；内参对照 β-actin 的引物设计参照Genebank资料.两对引物的序列如下：
, 百拇医药
MMP3
5’ Primer(sense)5’-TAT GGA TCC CCC CCT GAC TCC CCT GAG-3’
3’ Primer(antisense)5’-ATG GAA TTC AGG TTC AAG CTT CCT GAG G-3’
β-actin
5’ primer(sense)5'-CGA GAA GAT GAC CCA GAT CA-3’
3’ Primer(antisense)5'-GAT CTT CAT GAG GTA GTC AG-3’
PCR反应体系为20μL，内含cDNA2μL，10×buffer 2μL，4×dNTP(2mmol/L)2μL，MMP3 、β-actin引物(10μmon/L)各2μL，Taq酶1U，用水补至20μL. PCR反应在0.2mL薄壁管中进行，用毛细管PCR仪扩增.PCR反应参数为：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃后延伸7min .扩增产物在20g/L琼脂糖凝胶上进行电泳，MMP3和β-actin的扩增产物分别为194 bp和2 34 bp.对扩增产物用凝胶成像系统进行定量分析，用MMP3/β-actin的比值表示MMP3的相 对表达水平. 统计学处理 结果以x±s表示，用t检验进行处理.
, 百拇医药
2 结果2.1 大肠癌组织基质分解素-1的基因表达正常大肠 组织可见基质分解素-1的基因表达；大肠癌组织基质分解素-1的基因表达水平(1.96±0.4 4)明显高于正常大肠组织(0.43±0.12)(P<0.001).
2.2 大肠癌组织基质分解素-1基因表达与转移的关系50例大肠癌患者有9例经病理证实有淋巴结转移者；将此9例患者的癌组织MMP3基因表达 水平与41例无淋巴结转移者相比，伴有淋巴结转移者MMP3基因表达水平(3.32±0.62)明显 高于无局部淋巴转移者(1.66±0.40)(P<0.01).
3 讨论
基质金属蛋白酶(Matrix metalloprotein ases, MMPs)主要包括间质胶原酶类、Ⅳ型胶原酶/明胶酶类和基质分解素类三大类.基质 分解素类包括基质分解素-1、基质分解素-2、基质分解素-3和基质降解素(Matrilysin, putative metalloproteinase, PUMP-1，MMP7)[17-28].有关基质分解素与 肿瘤关系的研究目前报道较少，且多为对基质分解素-3的研究.研究表明头颈部鳞癌的局部浸润与基质分解素-3基因表达增强有关乳腺癌患者基质分解素-3与肿瘤进展有关.王爱民 et.al[29-30]研究了食管癌、肺癌患者基质分解素-1(MMP3)基因表达的情况 ，结果表明：食管癌、肺癌组织MMP3的基因表达水平显著高于正常食管组织和癌旁正常肺 组织.本研究大肠癌组织基质分解素-1的基因表达，显示大肠癌组织基质分解素-1 (MMP 3)的基因表达明显高于正常大肠组织；伴有局部淋巴结转移者组织基质分解素-1基因表达 水平明显高于不伴有局部淋巴结转移者，提示大肠癌的浸润、转移与基质分解素1基因表达 增强有关.但基质分解素-1的基因表达受诸多细胞因子、生长因子的影响，如TGF(、TNF(、 PDGF、EGF、bFGF等.大肠癌基质分解素-1基因表达增强是否与上述因子调控有关，及其调 控的程度，对此我们正在研究之中.
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4 参考文献1 李楠，徐采朴.胃癌组织中金属蛋白酶类基因过度表达.华人消化杂志,1998;2：118-120
2 Mattodosm LM.The matrix metalloproteinase.BioEssays，1992;455-463
3 高毅，黄宇琦，王宇，方石岗，杨继震.逆转录定量PCR检测实验性肝纤维组织中金属蛋白酶抑制因子-1的表达.
世界华人消化杂志，1999；7：993
4 王宇，高毅，杨继震.实验性肝纤维化过程中间质胶原酶表达的研究.世界华人消化杂志，1999；7：1004-1006
5 Ji F, Wang WL, Yang ZL, Li YM, Huang HD, Chen WD. Study on the expression of matrix metalloproteinase-2 mRNA in human
, http://www.100md.com
gastric cancer. World J Gastroenterol, 1999;5:455-457
6 李楠，徐采朴，宋波，刘为纹，王鑫，张朝山，徐元基，冯东晓.金属蛋白酶抑制剂TIMP-2基因转染对胃癌细胞体外生长浸润
与细胞外基质的相关性.华人消化杂志，1998；6：663-666
7 铁国栋，曹宇静，赵兴绪，段恩奎. 纤维粘连蛋白一整合素相互作用启动胚泡中基质金属蛋白酶活性.科学通报，2000；45：475-479
8 Duivenvoorden WC, Hirte HW, Singh G. Transforming growth factor betal acts as an inducer of matrix metalloproteinase
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expression and activity in human bone-metastasizing cancer cells. Clin Exp Metastasis, 1999;17:27-34
9 向德栋，李奇芬，王宇明，王雅凡. 维生素E乳剂对肝脏星状细胞III型前胶原和MMP1 mRNA表达的影响.世界华人消化杂志，1999；7：1085
10 Gilles C, Polette M, Piette J , Thompson EW, Birembaunt P, Foidart JMI. High levels of MT-MMp expression is associated
with invasivenss of cervical cancer cells. Int J Cancer, 1996;65:209-213
, http://www.100md.com
11 Davies B, Miles LC, Happerfield MS, Naylor MS, Bobrow LG, Rubers RD, Balkwil FR. Activity of type IV collagennase in benign
and malignant breast disease.Br J Cancer, 1993;67:1126-1131
12 David EK, William G, Stevenson S. Quantitative zymography: detection of picogram quantities of gelatinases. Anal Biochem,1994;218:325-329
13 Zucker S, Drews M, C, Foda HD, Declerck, Langley KE, Babous WF, Docherty AJP, Cao J. Tissue inhibitor of metalloproteinase-2
, 百拇医药
(TIMP-2 ) binds to the catalytic domain of the cell surface receptor, membrane type 1-matrix metalloproteinase 1 (MT1-MMP).
J Biochemistry, 1993;273:1216-1222
14 Nagase H, Cawston TE, Brew K. Involvement of a region near valine-69 of tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)-1 in
the interaction with matrix metalloproteinase 3(stromelysin 1). Biochem J, 1997;325:163-167
, http://www.100md.com
15 Tokuraku M, Sato H, Murakami S, Okada Y ,Watanabe Y, Seiki M.Activation of the precursor of gelatinase / 72kDa rype IV
collagenase / MMP-2 in lungcarcinomas correlates with the expression of membrane-type matrix metalloprot (MT-MMP) and
with Lymph node metastasis. Br J Cancer (Pred Oncol), 1995;64:355-359
16 王爱民，王宝恩，杨跃伟，梁宝忠. 慢性肝病基质分解素-1基因表达的研究.中华医学杂志，1999；4：275-276
, 百拇医药
17 Ochieng J, Fridman R, Nangia Makker P, Kleiner DE, Liotta LA, Stetler Stevenson WG, Raz A. Galectin-3 is a novel substrate for
human matrix metalloproteinases-2 and-9. Biochemistry, 1994;33:14109-14114
18 黄宇琦，高毅，杨继震，方石岗，王宇，大鼠肝纤维化基质金属蛋白酶及其抑制因子的表达，世界华人消化杂志，1999；9：795-796
19 陈平圣，翟溶，张月娥，张绵生，缺氧对肝星状细胞产生胶原及胶原降解酶的影响.世界华人消化杂志，2000；5：586-587
20 姚树坤，段飞，肝纤维化早期诊断，世界华人消化杂志，2000；6：681-683
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21 姜慧卿，张晓岚，肝纤维化的发生机制.世界华人消化杂志，2000；6：687-689
22 白文元，姚希贤，冯丽莫，肝纤维化的研究现状.世界华人消化杂志，2000；11：1267-1268
23 蒋泽生，高毅.基质金属蛋白酶的生物特性及其在肝癌与浸润转移中的作用，世界华人消化杂志，2000；12：1403-1404
24 郝远瑞，赵跃武，王令非，银平章. 人肝细胞癌组织中MMP-2酶活性的变化.世界华人消化杂志，2000；8：952-953
25 周永健，陈岳祥. 基质金属蛋白酶及其抑制因子与纤维化，国外医学消化手册，1996；2：67-70
26 洪照友，俞金龙，张元生，高毅. 基质金属蛋白酶-9，CD34的表达与肝癌侵袭转移的关系. 世界华人消化杂志，2001；2：170-174
27 蒋泽生，方石岗，高毅陈建锋，汪爽，Batimastat 对大鼠原发性肝癌生长侵袭转移的影响.世界华人消化杂志，2001；5：546-549
28 刘景章，赵子粼，陈泽华，高毅，肝硬化肝癌IV型胶原酶的表达.世界华人消化杂志，2001；6：711-713
29 王爱民，华川，韩利，王延明，李卫杰.食管癌患者基质分解素-1基因表达的研究. 中国肿瘤临床与康复，2000；3：8-9
30 王爱民， 李伟中，郭春江，李卫杰.肺癌患者基质分解素-1基因表达的研究.肿瘤， 2000；6：404-40, 百拇医药(张莉 秦北宁 任爱琴 张忠明 古彩吉吉 耿洪刚)